Biofabrication ile Bio-Elektronik Arayüz Bridging

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyopolimerik filmlerin elektriksel olarak biriktirilmesi ve bunların proteinler ve hücreler gibi biyolojik bileşenlerle fonksiyonelleştirilmesidir. Elektro-biriktirme, pH duyarlı bir polisakkarit çözeltisi ile birlikte, kutuplanmış bir elektrotta yerel olarak meydana gelen pH değişiminden yararlanılarak gerçekleştirilir. Katodik veya anodik bir biriktirme stratejisi seçildikten sonra, elektrot, elektro-geometri tarafından tanımlanan bir desene sahip ince bir film oluşturan sol-jel geçişini tetiklemek için kutuplanır.

Ayrıca, proteinler ve hücreler gibi biyolojik bileşenler elektrot biriktirme işlemi boyunca sisteme dahil edilebilir. Filmin biyolojik olarak fonksiyonelleştirilmesi amacıyla, floresan görüntülemeye dayalı olarak biyolojik bileşenlerin filmlerde yerelleştiğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Ek olarak, enzimatik aktivitenin elektrokimyasal tespiti ve raporlayıcı hücre yanıtının kullanımıyla, bileşenlerin fonksiyonel olduğu ve çevreleriyle etkileşime girebildiği kanıtlanmıştır.

Biyofabrikasyon, biyoloji ile elektronik arasındaki arayüzü oluşturmak için yeni bir araç seti sunmaktadır. Temel avantajlarının, basitliği ve fizyolojik koşullara yakın şartlarda montaj yapabilme yeteneği olduğuna inanıyoruz. Biyoloji, kendi kendine düzenleme ve enzimatik yöntemler aracılığıyla nan ölçekte üretim yapma konusunda uzmandır. Bu yetenekleri kullanarak, diğer montaj tekniklerinin kullandığı karmaşık, tehlikeli ve zaman alan sentez yöntemlerinin etrafından dolanmış oluyoruz.

Uçurtma benzeri yapıların elektrotla çöktürülebileceğini gözlemlediğimizde, iş birliği yapan ekibimiz BioD cihaz arayüzünü biyolojik materyaller ve mekanizmalar kullanarak oluşturma fikrini geliştirdi. Kitan, cihaz tarafından uygulanan elektriksel sinyalleri tanıyabilen ve ince bir film tabakası şeklinde çökelen, pH duyarlı, film oluşturan bir polisakkarittir. Kitanın elektrotla çöktürülebileceğini gördüğümüzde, bir BioD cihaz arayüzü inşa etmek için biyokimya ve moleküler biyolojiden gelen daha geniş bir araç setine erişebileceğimizi fark ettik.

Bu tekniğin uygulaması, fonksiyonel biyolojik bileşenlerin gerektiği laboratuvar üzerinde çip (lab-on-a-chip) düzeneklerine kadar uzanmaktadır; çünkü bu yöntem, söz konusu bileşenlerin canlı kalabildikleri bir elektrot üzerine yerleştirilmesi için ucuz ve kolay bir yol sunar. Biyofabrike bir film hassas olabileceği ve kolayca hasar görebileceği için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, filmi yıkarken veya püskürtürken çok sert davranmamaya özen gösterilmelidir.

Film kolayca bozulabileceği için dikkatli olunmalıdır. Öte yandan, filmin kolayca çıkarılması sayesinde elektrotların yeniden kullanılabilmesi bir avantajdır. Bu protokole başlamak için, bir güç kaynağını timsah ağzı klipsler ve ara bağlantı kabloları aracılığıyla özel olarak üretilmiş elektrotlara bağlayın.

İndiyum kalay oksit veya ITO kaplı bir cam lam anot veya çalışma elektrodu olarak görev yapacak, platin folyo ise katot veya karşı elektrot olarak hizmet edecektir; elektrotları, fonksiyonelleştirilecek olan ITO yüzeyi karşı elektroda zıt olacak şekilde, ITO yüzeyi ya solüsyona daldırılmak üzere dikey olarak ya da solüsyona yüzeyde tutulabilecek şekilde yatay olarak konumlandırın. Ardından, %1 aljinat ve %0,5 kalsiyum karbonatı distile suda karıştırıp karışımı otoklavlayarak bir aljinat çöktürme solüsyonu hazırlayın. Daha sonra, karıştırarak ve vorteksleyerek aljinatı Fluor küreler ile floresan işaretleme yapın.

Bu işlem, elde edilen filmin floresan görüntülemesine olanak sağlayacaktır. Otoklavlamadan sonra, her iki elektrodu hazırlanan çöktürme çözeltisine daldırın ve iki dakika boyunca metrekare başına üç amperlik sabit bir akım yoğunluğu uygulayın. Voltaj iki ila üç volt aralığında değişecektir. İki dakika sonra elektrodu ayırın ve çökmemiş olan çözeltiyi uzaklaştırın. Fazla aljinatı temizlemek için filmi sodyum klorür ile nazikçe durulayın.

Jeli güçlendirmek için filmi kısa bir süre 0,1 molar kalsiyum klorür içinde inkübe edin. Film daha sonra istenen saklama çözeltisinde inkübe edilir. Ortak çöktürme işleminden önce filmi floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

Bu videoya eşlik eden yazılı protokolde belirtildiği şekilde, bir sinyal gönderici hücre kültürü ve bir sinyal alıcı hücre kültürü büyütün. Ardından, aljinat ve kalsiyum karbonattan oluşan bir çöktürme çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi, hücrelerin kültürleme yoğunluğunun yaklaşık yarısına seyreltildiği durumda, %1 aljinat ve %0,5 kalsiyum karbonat nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde her bir hücre kültürüyle bir bire bir oranda karıştırın.

Polidimetilsilan bir kuyucukla sınırlandırılmış, iki ITO elektrot desenli bir cam lam ve bir platin karşı elektrot kullanın. Bir ITO elektrodu ve platin elektrodu bir güç kaynağına bağlayın. Daha önce yapıldığı gibi, elektrotları alıcı hücreleri içeren biriktirme çözeltisine daldırın.

Güç kaynağını, yüzey alanı boyutunun çökelmenin gerçekleşeceği tek elektrot tarafından tanımlandığı, metre kare başına üç amper yoğunlukta sabit akıma ayarlayın. Hücrelerin aljinat matrisi içinde birlikte çökelmesini sağlamak için akımı iki dakika boyunca uygulayın. Filmi daha önce olduğu gibi sodyum klorür ile durulayın ve karşı bağlantıyı bitişikteki ITO elektroduna geçirin.

Biriktirme prosedürünü tekrarlayın ancak bu kez gönderici hücreleri içeren çözeltiyi ekleyin. Co-biriktirilmiş hücreleri ve kalsiyum argenat içeren iki elektrotlu çipi, fosfat tamponlu salinde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

%10 LB besiyeri ve bir millimolar kalsiyum klorür ile desteklenmiştir. İnkübasyondan sonra, kitosan elektrot biriktirme işlemine başlamak için çipi bir floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin. Güç kaynağını elektrotlara bağlayın.

Timsah klipleri takın. Altın kaplamalı bir silikon çip katot, platin folyo ise anot görevi görecektir. Altın elektrot yüzeyini, daha önce olduğu gibi karşı elektroda paralel olacak şekilde konumlandırın.

Kato kum pullarını su ile karıştırarak ve polisakkaritleri çözmek için yavaşça iki molar hidroklorik asit ekleyerek bir Kato kum çözeltisi hazırlayın. Metinde referans verilen prosedürü takip ederek, elektrota biriktirilen filmi floresan mikroskobu ile görüntülemek amacıyla Kato kum çözeltisi floresanla işaretlenebilir. Ardından, elektrotları, biriktirme işlemi için istenen alan tamamen batacak şekilde kaizan çözeltisine yerleştirin.

Çalışma elektrodunun yüzey alanına dayalı olarak metrekare başına dört amper yoğunlukta hesaplanan sabit bir akımı iki dakika boyunca uygulayın. Bu durumda, dört milimetrekarelik bir altın elektroda 16 mikroampere akım uygulanır; fazla kitosanı uzaklaştırmak için elektrodu deionsuize su ile duruladıktan sonra voltaj iki ila üç volt aralığında değişecektir. Bir desenli elektrot üzerine, metrekare başına dört amper akım yoğunluğundaki bir çözeltiden kitosan ve glukoz oksidazı görüntülemek için bir floresan mikroskobu kullanarak filme geçin.

Kitosan elektrot çöktürme prosedürüne uygun olarak, glikoz oksidaz hapsedilmiş bir kaizan film oluşturulacaktır. İşlem görmüş elektrodu; çalışma elektrodu olarak üç elektrotlu bir sisteme, karşı elektrot olarak bir platin tele ve referans elektrot olarak gümüş/gümüş klorüre bağlayın, ardından elektrotları sodyum klorür içeren bir fosfat tampon çözeltisine daldırın. Konjugasyonun ardından, kronopotansiyometri kullanarak 60 saniye boyunca sabit bir voltaj uygulayarak proteini Kazam filmine elektrokimyasal olarak konjuge edin.

Tepkimeye girmemiş sodyum klorür ve konjuge olmamış glukoz oksidazı uzaklaştırmak için çipi fosfat tamponuna yerleştirin ve orbital sarsıcıda 10 dakika boyunca yıkayın. Üç elektrotlu sistemi tekrar bağlayın ve beş milimolar glukoz çözeltisine daldırın. Ardından, potansiyeli pozitif yönde 0,7 volta kadar taramak için çevrimli voltametri için istenen parametreleri ayarlayın.

Elektrotları glikoz çözeltisinden çıkarın ve fosfat tamponu ile durulayın. Ardından, elektrotları manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirilmiş, sekiz mililitre fosfat tamponu içeren 10 mililitrelik bir beherin içine yerleştirin. Çalışma elektrodu olarak hizmet etmesi için GOX fonksiyonelleştirilmiş çipi 0,6 volta ayarlayın.

İstenen parametreleri ayarladıktan sonra, bir bazal kayıt alın. Her bir alikot için glikoz konsantrasyonunu dört milimolar artırmak amacıyla tampona glikoz alikotları ekleyin. Bu deneyde, tampona 80 milimolar glikozun 400 mikrolitrelik alikotları eklenmektedir. Akım çıktısını her bir glikoz konsantrasyonu ile ilişkilendirin. Protein fonksiyonelleştirmesi gerçekleştirmek için bir standart eğri oluşturmak üzere, A-P-D-M-S içerisinde bulunan, yan yana altın ve ITO elektrotlarla desenlenmiş bir cam slayt kullanın.

Daha önce gösterildiği gibi, altın elektrodu katodik bir potansiyel ile kutuplandırarak tizen çöktürmesi gerçekleştirin. Filmi duruladıktan sonra, tirozinaz ile desteklenmiş, mavi floresan işaretli auto inducer two synthase çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyonun ardından.

Filmi daha önce olduğu gibi PBS ile durulayın, aljinat çöktürme solüsyonuna daldırılmış olan ITO elektroduna alıcı hücreler içeren bir anotik potansiyel uygulayın. İletilen sinyali enzimatik olarak oluşturmak için hücre popülasyonlarının aljinat içinde birlikte çöktürülmesinde belirtilen adımları takip etmeye devam edin. Filmler durulandıktan sonra, beş µM SAH ve %10 LB ortamı ile bir mM ile desteklenmiş PBS çözeltisi ekleyin.

Çözeltinin buharlaşmasını önlemek için elektrotların üzerini kalsiyum klorür ile kapatın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bu işlem, kırmızı floresan protein DS red üreterek bir alıcı hücre yanıtı oluşmasını sağlayacaktır; bitişik elektrotlar, mavi floresan özelliğe sahip inducer two synthase ve kooptasyonla alıcı hücreler tarafından eksprese edilen kırmızı floresanı yakalayacak şekilde filtreler ayarlanarak floresan mikroskobu ile görüntülenbilir. Uygulanan elektriksel sinyaller, bir elektrot yüzeyine yakın bölgelerde lokalize mikroortamlar oluşturabilir ve bu stimülasyonlar, alginat ve razan gibi polisakkaritlerin kendi kendine birleşerek elektrot yüzeyinde bir hidrojel film şeklinde çökelmesini tetikleyebilir.

Bu sol-jel geçişi elektrot yüzeyinde gerçekleştiği için, ortaya çıkan film, geometrisi elektrot deseniyle eşleşecek şekilde elektro-adreslenir. Aljinat kullanılarak, benzersiz hücre popülasyonları ayrı adreslere birlikte çöktürülmüştür. Gönderici ve alıcı hücre popülasyonları arasındaki etkileşim üzerine, elektrot adreslerinin kanıtı gözlemlenir.

Otindükleyici iki molekülü, gönderici hücrelerden yayılır ve alıcı hücreler tarafından alınarak DS red floresan proteinin ekspresyonu ile sonuçlanır. Burada, kırmızı floresans yalnızca alıcıların yönlendirildiği elektrotta gözlemlenir. Buna karşılık, biyosensör enzim glukoz oksidaz, hidrojen peroksit üreten enzimatik bir reaksiyon aracılığıyla glukozun tespit edilmesini sağlar ve bu peroksit daha sonra bir çıkış akımı üretmek üzere elektrokimyasal olarak oksitlenebilir.

Bu sayede, kimyasal bir sinyal elektriksel sinyale dönüştürülebilir. Bu grafik, Geo X'in kimyasal olarak konjuge edildiği filmlerin, Geo X içermeyen filmlerin aksine, glukoz varlığında güçlü bir antik sinyal ürettiğini göstermektedir. Bu sonuçlar, Geo X'in bir çöktürülmüş zam filmi üzerine monte edilebildiğini ve/veya katalitik aktivitesini koruduğunu göstermektedir. Ayrıca, artan glukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak otik akımda basamaklı bir artış meydana gelmektedir.

Sunulan standart eğri, basamaklı artışların eklenen glikoz miktarına bağlı olarak yaklaşık lineer bir şekilde ilerlediğini göstermektedir. Bu sonuçlar, enzimin burada gösterildiği gibi Razza filme konjugasyon sonrası hassasiyetini koruduğunu kanıtlamaktadır; I iki sentaz bir Penta tirozin etiketi içerir. Tirozinaz, tirozin etiketi üzerinde etkili olarak kalıntıların fenol gruplarını o quinonlara oksitler ve bunlar daha sonra kovalent olarak kazan'ın aminlerine bağlanır. Tirozinaz montajı ile a i iki sentazın kaza film fonksiyonelleştirmesinin kanıtı, altın üzerindeki bir kaza filmini gösteren bu floresans görüntüde gözlemlenmektedir; burada fonksiyonelleştirilmiş I iki sentaz mavi renkte floresanla işaretlenmiştir. a I iki sentaz, gönderici hücrelerde olduğu gibi substrat SAH'tan bir I iki ürettiği için, SAH varlığında adapte edilmiş alıcı hücrelere yakınlığı, alıcı hücrelerin ds ekspres ederek floresan yanıt vermesine neden olur.

Alıcı hücrelerin kırmızı floresansı, ai'nin birinden diğerine difüzyonu nedeniyle adresler arasındaki etkileşimi yeniden kanıtlamakta ve tizen'e immobilize edilen 10 enzimin kovalent olarak bağlandıklarında aktivitelerini koruduklarını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, polisakkarit filmlerin nasıl elektro-biriktirileceği ve çeşitli teknikler kullanılarak nasıl fonksiyonelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Bu fonksiyonelleştirme adımlarındaki çok yönlülüğü, sonraki testlerde çok sayıda biyolojik bileşenle çalışmamıza olanak tanıyacak şekilde göstermiş olduk.

Bu teknik bir kez kavrandığında, biyolojik bileşenlerin hassas bir şekilde aşılanabileceği belirgin film paternleri oluşturmak için sadece birkaç dakika içinde uygulanabilir. Böylece, belirlenmiş elektrotlar üzerinde biyolojik olarak paternlenmiş ve aktif yüzeyleri oldukça kolay bir şekilde, düzenli bir biçimde ve buna rağmen karmaşık biyolojik etkileşimleri gerçekleştirebilecek şekilde oluşturabiliyoruz. Bu prosedürün ardından, hedeflenen etkileşimin tasarımına ulaşmak için hem elektrot dizisinin tasarımında hem de biyolojik bileşenlerin seçiminde yaratıcılık kullanılabilir.

Biyofabrikasyon araçlarının, her biri hayatımızda ayrı ayrı devrim yaratmış olan biyoteknoloji ve mikroelektronik gibi iki farklı alanı birbirine bağlamasını umuyoruz. Bu iki alanı bir araya getirerek, toplumun en acil sorunlarının bazılarına yeni çözümler üretebileceğimize inanıyoruz. Örneğin, biyofabrikasyonun; yeni algılama yöntemleri, hasta başı testler, hastalık teşhisleri ve biyolojik ve kimyasal tehditlerin algılanması için basit ve çok yönlü yöntemler sağlayabileceğini öngörüyoruz.

Uzak vadeli bir örnek, gelecek nesil arteriyel stentlerin arterinizi açık tutmanın yanı sıra metabolik profilinizi de izleyebilmesi olabilir.