Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri Xenopus laevis

Bu prosedürün amacı, daha sonraki yüksek çözünürlüklü görüntü analizi için Xenopus Lavis büyüme konilerini kültürlemektir. Bu, önce yumurta üretimini uyarmak için dişi kurbağalara hormon enjekte edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, yumurtaları toplamak ve döllemek ve daha sonra onlara mRNA veya diğer ilgili yapıları enjekte etmektir.

Ertesi gün embriyolar diseke edilir ve nöral tüpler izole edilir, kesilir ve kapak fişleri üzerine kaplanır. Son adım, büyüyen aksonları ve büyüme konilerini görüntülemektir. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu, zaman içinde büyüme konilerindeki protein lokalizasyonundaki değişiklikleri göstermek için kullanılabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü nöral tüp diseksiyonlarını, tekniği ilk elden gözlemlemeden bir yöntem bölümünü okuyarak öğrenmek zor olabilir. Daha önce 12 ila 14 saat önce 400 ünite koryonik gonadotropin enjekte edilmiş dişi kurbağalardan yumurta elde edin. Yumurtaları bir X işareti modifiye edilmiş zil çözeltisinde toplayın.

Daha sonra toplanan X'i in vitro olarak daha önce tarif edildiği gibi kıyma testisleri ile dölleyin ve en az 20 dakika sonra 0.1 XMMR ekleyin. Ortamı çıkarın ve embriyo jöle kaplamasını çıkarmak için embriyoları pH 7.8'de bir XMMR'de% 2 sistein içinde üç ila beş dakika inkübe edin. Sonra embriyoları bir behere dökün.

Daha sonra, embriyoları son yıkamadan sonra üç ila beş kez 0.1 XMMR veya 0.1 x modifiye banyo salini ile yıkayın. Embriyoları enjeksiyona kadar veya istenirse oda sıcaklığında 0.1 XMMR'de tutun. Enjeksiyondan önce gelişimi yavaşlatmak için embriyoları 14 ila 18 santigrat dereceye yerleştirin.

Önceden hazırlanmış kapaklı RNA'yı çift damıtılmış su ile 50 ila 200 pikogram muz litresi nihai konsantrasyona seyreltin ve ardından mikro enjeksiyona kadar buz üzerinde saklayın. Daha sonra, bir süter çektirme veya benzeri bir alet kullanarak bir bo silikat kılcal damarını çekerek enjeksiyon iğnesini hazırlayın. Daha sonra bir mikroskop altında, tüy benzeri bir şekil oluşturmak için iğne ucunu belirli bir açıyla kırmak için forseps kullanın ve iğneyi seyreltilmiş RNA çözeltisinin 0,5 ila bir mikrolitresi ile doldurun.

İğneyi mikro manipülatöre monte edin Burada bir tıbbi sistemin PLI 100 PICO enjektörü kullanılır. Şimdi, döllenmiş embriyoları bir ila dört hücre aşamasında, 0.1 XMMR'de% 5 fol içeren plastik bir kaba yerleştirin. Radikal veya aşamalı bir mikrometre kullanarak her yeni mikro pipet için enjeksiyon hacmini kalibre edin.

Ardından, pico enjektörünü her enjeksiyon için istenen miktarda RNA verecek şekilde ayarlayın. Burada bir nanolitre enjeksiyon hacmi kullanılır. Embriyoları forseps ile veya tercih edilirse bir tutma platformunda tutun ve istenen hacmi hayvan blasterlerine enjekte edin.

Düzgün bir RNA dağılımı elde etmek için enjeksiyonları embriyo boyunca çeşitli yerlere dağıtın. Dört hücreli aşamalı bir embriyo için her blasterde bir ila iki enjeksiyon yapılırken, iki hücreli aşamalı bir embriyo için iki ila dört enjeksiyon kullanılır. Enjeksiyonlardan sonra, enjekte edilen embriyoları 0.1 XMMR içeren plastik bir kaba aktarın ve 20 ila 23. aşamaya kadar gelişmelerine izin verin.

İstenilen gelişim hızına bağlı olarak, embriyolar 14 ila 22 santigrat derece sıcaklıkta inkübe edilir, PBS'de mililitre laminin başına 10 mikrogram ile PLL muameleli kültür kapları kaplanır ve plakalar bir saat boyunca 37 santigrat derecede yerleştirilir. İnkübasyon süresi geçtikten sonra, son yıkamadan sonra laminin kaplı yüzeyin havaya maruz kalmasına izin vermemeye dikkat ederek plakaları PBS ile üç kez yıkayın. PBS'yi kültür ortamıyla değiştirin.

Son olarak, kültürlü bir tabağın tabanını 0,1 XMMR'de %1 aros ile kaplayarak ve sertleşmesine izin vererek üç agros kaplı tabak hazırlayın. Sertleştikten sonra, bir tabağı Steinberg'in medya değişkenliği ile doldurun enjekte edilen mRNA'nın ekspresyonu, embriyoların diseksiyon yapmadan önce bir floresan mozaiği sergilemesine neden olabilir. Embriyoları floresan varlığı açısından tarayın ve nöral tüpteki floresan füzyon proteinini ifade eden embriyoları tanımlayın.

Daha sonra 20 ila 23. aşamadaki floresan embriyoları Steinberg's Media içeren agros kaplı plastik tabağa aktarın. Çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve vitellin zarını çıkarmak için ince forseps kullanın. Daha sonra, bir forseps embriyoyu yerinde tutarken, ikincisini embriyonun yan tarafında bir kesi yapmak ve içi boş iç kısmı ortaya çıkarmak için kullanın.

Daha sonra, embriyoyu ikiye bölmek ve nöral tüpü içeren dorsal kısmı izole etmek için embriyonun dorsal ve ventral yarısı arasındaki doku boyunca sıkıştırmak için her iki forseps setini kullanın. Dorsal X explan'ı mililitre başına iki miligram, Steinberg'in ortamına kollajenaz içeren bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve 15 ila 20 dakika boyunca bir döndürücü üzerine yerleştirin. Daha sonra sırt ekplanını, taze steinberg ortamı ile doldurulmuş agro kaplı bir kaba aktarın.

Mikroskop altında çalışırken, forsepsin ucunu epidermis ile alttaki doku arasına kaydırarak ve epidermisi yavaşça geri çekerek nöral tüpü dorsal epidermis ve ventral Noor'dan diseksiyon yapın. Daha sonra dokuyu tutmak için bir forseps ve nöral tüpü çevreleyen dokuyu çıkarmak için başka bir forseps kullanın. Daha sonra, diseke edilmiş nöral tüpü taze kültür ortamı ile doldurulmuş agros kaplı bir kaba aktarın.

Birkaç nöral tüp toplandıktan sonra, her tüpü yaklaşık 20 parçaya kesmek için tungsten iğneleri veya forsepsleri keskinleştirirsiniz. Daha sonra parçaları laminin kaplı kültür kaplarının üzerine yerleştirin ve patlıcanları sıralara eşit şekilde yayın. Nöral tüpler kaplandıktan sonra, hücrelerin bağlanmasını bozacağı için bulaşıklar hareket ettirilmemelidir.

Kaplanmış nöral tüp ekplanını 20 ila 22 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığında görüntü nöronlarının ve büyüme konilerinin kaplanmasından 12 ila 24 saat sonra XUS lavis nöronlarının kültürü için bir hücre kültürü inkübatörü gerekli değildir. RNA'nın değişken ekspresyonunun, büyüme konileri arasında bir dizi floresan seviyesine neden olabileceğini unutmayın.

Bu DIC görüntüsü, görüş alanının sol üst köşesinde X explan'dan çıkan aksonları ve nöritleri göstermektedir. Bu görüntüdeki ve aşağıdaki görüntülerdeki ölçek çubuğu 10 mikronu temsil eder. Bu daha yüksek büyütme oranlı film, büyüyen bir aksonun ucundaki büyüme konisini gösterir.

Son olarak, bu floresan mikroskobu filmi, bir büyüme konisinde EB bir GFP'nin ekspresyonunu gösterir. Buradayken, artı uç füzyon proteini EB bir GFP olan görüntüleme örneğini sunuyoruz. Bu nöral eksplant yöntemi, nörit büyümesi sırasında büyüme konisi içindeki davranışlarını aydınlatmak için herhangi bir sayıda proteine uygulanabilir.