Mikroarray'ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Bu prosedürün genel amacı, glikan mikro dizileri kullanarak geniş bir bitki veya doku tipi yelpazesinde hücre duvarı polimer bileşimini karşılaştırmaktır. Öncelikle, ilgili bitki dokularını hasat edin. Homojenizasyon sonrası alkolde çözünmeyen kalıntılar hazırlayın.

Ardından, hücre duvarı glikanlarını sırasıyla CDTA ve sodyum hidroksit kullanarak ekstrakte edin. Daha sonra, hücre duvarı glikan ekstraktlarını bir robot yardımıyla bir mikroarray üzerine basın. Mikroarrayleri, hücre duvarı glikanlarına yönelik monoklonal antikorlarla problayın ve mikroarraylerdeki spot sinyallerini nicelendirin.

Nihayetinde, sonuçlar ilgilenilen bir örnek setindeki glikan epitoplarının göreceli bolluğunu belirlemek için kullanılabilir. Birden fazla bitki doku tipindeki hücre duvarı glikan varlığının eş zamanlı olarak genel bir görünümünü sunma vele kompozisyonel farklılıkları tespit etme ihtiyacını fark ettiğimizde bu mikro-dizi yöntemini geliştirdik. Dolayısıyla, bu tekniğin monosakkarit analizi gibi geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, yüzlerce örneğin aynı anda taranabildiği mikro-dizi tabanlı bir platform olmasıdır. Bu, hücre duvarı kompozisyonunun profillenmesi için hızlı ve kapsamlı bir yöntemdir. İlgilenilen her doku için, sıvı azot kullanarak 100 miligram taze ağırlıktaki bitki dokularından oluşan üç paralel örnekle başlayın.

Örnekleri ince bir toz haline gelene kadar homojenize edin, ardından hücre duvarı materyalini hazırlamak için homojen karışımı 10 mililitrelik plastik konik tüplere aktarın. Homojen karışımı oda sıcaklığında 10 mililitre %80 etanol içinde yeniden süspande edin ve iki dakika boyunca şiddetle vorteksleyin. Örnekleri 3,500 ×g'de santrifüjleyin ve süpernatantı atın.

%70 ethanol yıkamalarını en az üç kez veya üst faz berraklaşana kadar tekrarlayın. Ardından %100 aseton ile son bir yıkama gerçekleştirin. Alkolde çözünmeyen kalıntıları paletleyin ve ince ve homojen bir toz elde etmek için gece boyunca havada kurutun; alkolde çözünmeyen kalıntı örneklerini 0,4 milimetrekare gözenekli bir elekten geçirin.

Ardından, karıştırma işlemi için her birinde üç milimetrelik bir cam boncuk bulunan mikro tüplere, alkolde çözünmeyen kalıntı örneklerinden 10 miligram tartın. Pektinlerin ve pektinle ilişkili polimerlerin ekstraksiyonu için her bir örneğe 500 mikrolitre 50 milimolar CDTA ekleyin, tüpleri kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından tissueizer kullanarak üç saat boyunca sekiz hertz'de karıştırın. Örnekleri 12.000 kat yerçekimi ivmesinde santrifüjleyin.

G. Süpernatantları dikkatlice uzaklaştırın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Peletleri bir mililitre deiyonize su ile iki kez yıkayın. Kalan hücre duvarı peletinden tüplerdeki tüm sıvıyı uzaklaştırın.

Çapraz bağlayıcı glikanları ekstrakte etmek için 0,1% sodyum hidrür içeren dört molar 500 µL sodyum hidroksit kullanın. Daha önce açıklanan ekstraksiyon işlemini uygulayarak, çapraz bağlayıcı glikanlar içeren süpernatantları dört °C'de saklayın. Peletleri deiyonize su ile iki kez yıkayın.

Ardından, 500 µL Cain kullanarak selüloz gibi kalıntı polimerleri ekstrakte edin; partikül maddeleri uzaklaştırmak için ekstrakte edilmiş hücre duvarı polimerlerini içeren süpernatantları santrifüjleyin. Daha sonra, örneklerin doku tipine ve ekstraksiyon tipine göre düzenlendiği önceden tasarlanmış özel bir yerleşim düzeni kullanarak, her bir örnekten 50 µL'yi polipropilen 384 kuyucuklu mikrotitre plakasına yükleyin.

Ardından, sıfır, beş ve 25 katlık seri dilüsyonlar hazırlamak için hücre duvarı polimer örneklerini deiyonize su ile seyreltin. Mikro-diziler için pin yüksekliği, toplama ve bekleme süresi ile yıkama adımları gibi parametreleri ayarlayın. Örnek buharlaşmasını önlemek için baskı odasının nemini %60'ta kontrol edin.

Şimdi yazdırma işlemini başlatın. Robot, örnek plakasındaki solüsyonları, makinede düz bir plakaya sabitlenmiş nitroselüloz membrana yazdırmak için kapiler kanal pinleri kullanır. Dizideki her bir nokta 15 nanolitre solüsyon içerir ve üç kopya halinde yazdırılır.

Membran üzerinde yan yana özdeş mikro diziler basın ve bunları tekil diziler halinde kesin. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, her bir mikro diziyi oda sıcaklığında iki saat boyunca %5'lik yağsız süt tozu çözeltisi ile bloklayın.

Hücre duvarı glikanı ve epitoplarına özgü monoklonal antikorları ekleyin ve iki saat boyunca inkübe edin. Özgül olmayan bağlanmaları gidermek için mikro dizileri beşer dakikalık üç kez PBS ile yıkayın. Ardından, beşer dakikalık üç PBS yıkamasının ardından, mikro dizileri horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikor ile iki saat boyunca inkübe edin.

Mikrodizileri kromojenik veya kemilüminesans substratlar kullanarak geliştirin. Münferit mikrodizileri yüksek çözünürlüklü bir masaüstü tarayıcı ile tarayın. Görüntüleri negatif 16 bit TIFF dosyaları olarak kaydedin.

Otomatik bir ızgara aracı ile donatılmış explore görüntü işleme yazılımını kullanarak her bir noktanın integral yoğunluğunu hesaplayın. Ardından, her bir mikro dizin için ızgara verilerini bir metin dosyası olarak dışa aktarın. Analiz için veri dosyasını manuel olarak bir Excel hesap tablosuna aktarın.

Her örnek için ortalama bir leke yoğunluğu değeri elde etmek amacıyla, baskı tekrarları ve dilüsyonlar genelindeki integral leke yoğunluklarının ortalamasını alın. Farklı örnekler arasındaki göreceli ortalama leke yoğunluklarını, Excel'deki koşullu biçimlendirmeyi veya çevrimiçi bir ısı haritası oluşturucuyu kullanarak bir ısı haritası şeklinde grafiğe dökün. Her antikor tipi için arka plan sinyalini ve yalancı pozitifleri kaldırmak, verileri 100'e normalize etmek ve %5'lik bir eşik değeri uygulamak için gerekli araçları kullanın.

Nicotiana'dan alınan anther filamentleri, polenler, ovaryumlar, petal sapları ve stigma olmak üzere altı doku tipindeki glikanların bağıl bolluğunu ölçmek için kapsamlı mikroarray polimer profilleme kullanılmıştır. Birçok çiçek dokusunun bulunduğu bu çalışmada, mikroarray, pektik polisakkaritler üzerindeki bir epitopa özgü olan monoklonal antikor JIM 5 ile sorgulanmıştır. JIM 5 epitopunun tüm çiçek dokularının CDTA ekstraktlarında tespit edildiği not edilmelidir.

Bununla birlikte, seviyesi polende en yüksek, stigma dokusunda ise en düşüktür. İlginç bir şekilde, JIM five epitopu polenin sodyum hidroksit ekstraktlarında saptanmış, ancak diğer dokuların ekstraktlarında saptanmamıştır. Kantitatif bilgiler, ovaryum dokusundaki mikro dizide internal standartlar olarak işlenen farklı saflaştırılmış polisakkaritlerin standart eğrileri oluşturularak elde edilmiştir.

Her bir örnekte, toplam hücre duvarı kalıntılarının yaklaşık %1,5'ini oluşturacak şekilde JIM five epitopu içeren yaklaşık 157 mikrogram hoog bulunmaktaydı; buna karşın, polen dokusunda toplam hücre duvarı kalıntısının yaklaşık %6,25'ini oluşturacak şekilde JIM five epitopu içeren 625 mikrogram hoog Ronin mevcuttu. Tüm doku tipleri genelindeki 15 glikan epitopunun bağıl bolluğu bir ısı haritası olarak özetlenmiştir. Renk çubuklarının yoğunluğu, her örnek için düzeltilmiş ortalama spot yoğunluğu ile orantılıdır.

Bu verilerin görsel bir temsili, farklı çiçek dokuları arasındaki glikan epitop oluşum farklarının hızlıca yorumlanmasını sağlar. Bu sonuçlar, münferit glikan epitoplarının çeşitli çiçek türleri arasında benzersiz şekilde dağıldığını göstermektedir. Örneğin, LM 13 epitopu, diğer dokularla karşılaştırıldığında antrop filamentlerinde ve SE L dokularında daha boldur.

Bu örüntü, MAB LM six tarafından öncelikle tespit edilen daha kısa zincirli epitopların örüntüsüyle çarpıcı bir tezat oluşturmaktadır. Çapraz bağlı glikanlar da birçok çiçekte farklı görülme örüntülerine sahiptir. Örneğin, LM 10 epitopu diğer dokularla karşılaştırıldığında stigma dokusunda bol miktarda bulunur, ancak ovaryum dokusunda mevcut değildir.

LM 15 xog glikan epitopları, diğer dokularla karşılaştırıldığında taç yaprak ve anter filamentinde en yüksek seviyededir; hetero maninler ise anter filamentlerinde en yüksek seviyededir. Bu videoyu izledikten sonra, geniş bir bitki ve doku türü yelpazesinde hücre duvarı glikanlarının nasıl ekstrak edileceği ve göreli bolluğunun nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Mikro diziler kullanıldığında, bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra üç günde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takip eden her adımda, örneklerin ve tekrarların tutarlı bir şekilde işleme tabi tutulması gerektiğini unutmamak önemlidir. Ek soruları yanıtlamak için asetik nitrik asit analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Örneğin, CDTA ve sodyum hidroksit kullanılarak pektinlerin ve kons glikanların ardışık ekstraksiyonu sonrası geriye kalan mutlak selüloz içeriği nedir?

Bu teknik, Arabidopsis ve Fisca, Nutella gibi model bitkilerin yanı sıra pamuk, buğday, okaliptüs ve tütün gibi diğer bitkilerdeki glikan oluşumunu hızla karşılaştırmak için bitki hücre biyolojisi alanında geniş bir uygulanabilirliğe sahiptir.