Name: Mikroarrayler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Öğrenin bitki hücre duvarı glikanlarını CoMPP yöntemiyle karakterize etmeyi. Monoklonal antikorlar ve mikroarray platformu kullanarak farklı bitki türlerinde ve doku tiplerinde glikan bileşimini hızlı ve kapsamlı şekilde analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IEM finansman Danimarka Araştırma Konseyi (FTP ve FNU) kabul etmek istiyorum. ERL bir ARC DP hibe desteği kabul etmektedir. AB Bitki hücre duvarları hibe Mükemmellik ARC Merkezi&#39;nin desteği ile hazırlanmıştır.

1. Doku Toplama ve Hazırlama <ol><li> Ilgi her doku için en az üç nüsha halinde bitki dokularının 100 mg taze ağırlık (10 mg kuru ağırlığının minimum) toplayın. Aşağıdaki adımları vejetatif doku hücre duvarı malzemesinin hazırlanması açıklanmaktadır. Depolama dokularının durumunda, un istenen nişasta enzimatik olarak daha önce 13 açıklandığı gibi hücre duvarı polimerlerin ekstraksiyon işlemine devam etmeden önce kaldırılır. </li><li> 24 boru adaptörü kümeleri ve 3 mm tungsten karbid boncuklar (30 Hz, 2 x 30 saniye) ile, Qiagen TissueLyser II kullanılarak sıvı azot ile birlikte ince toz haline örnekleri homojenize edilir. Sadece birkaç örnek işleniyor Alternatif olarak, eğer bir havanda kullanılır. </li><li> 10 ml plastik konik tüpler içine homojenatlarında aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 ml% 80 v / v etanol içinde homojenat yıkama ve 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteks hücre çeperi materyali hazırlanır. </li><li> 3.500 x g&#39;de santrifüjleyin ve supernatant atın. Süpernatant berrak olana kadar% 70 etanol, özellikle, klorofil içeren dokular için, ya da en az üç kez yıkama tekrarlayın. </li><li> % 100 aseton ile son yıkama yapın ve gecede kurumasını bekleyin Alkol Çözünmeyen Kalıntı (AIR) içeren granül bırakın. </li><li> Elek AIR ince, homojen toz elde etmek ve kötü, bazen homojenat kalır zemin partikülleri büyük kaldırmak için 0.4 mm 2 mesh ile örnekleri. </li><li> Mikrotüpler, numunelerin karışım yardım etmek için bir 3 mm cam boncuk içeren her birine 10 mg AIR örnek tartılır. </li></ol> 2. Hücre Duvarı glukanlardır çıkarımı <ol><li> Pektinler ile ilişkili pektinler, ve polimer her bir örnek için 50 uM CDtA (pH 7.5), 500 ul ilave edilerek numune çıkarılır. </li><li> Kısaca girdap boruları çözücü numune malzeme ile temas halinde olmasını sağlamak ve böylece 8 Hz, 3 saat boyunca TissueLyser ile karıştırılır. </li><li> Dikkatle, 12.000 xg&#39;de santrifüjleyin r4 ° C&#39;de süpernatan ve mağaza kaydının silinmesi </li><li> 13,000 x g hızında kalan herhangi bir çözücü, girdap ve santrifüj sulandırmak ve çıkarmak için de-iyonize su, 1 ml granül yıkayın. Pelet bozmadan bu adımı yineleyin ve sonraki adıma geçmeden önce tüplerin tüm sıvı kaldırmak. </li><li> Çapraz bağlama glukanlardır ardışık olarak% 0.1 ile 4M NaOH ile 500 ul, kalan hücre duvarı peleti elde edilir adımlar 2.1 &#39;de tarif edilen prosedür kullanılarak w / v NaBH4, - CDtA çıkarılması için 2.4. NaBH4 böylece polisakaritlerin soyulma baz engelleyen bir alkol ile polisakaritler azaltılması sonunda aldehit (ya da keto) grubu azaltmak için eklenir. </li><li> Santrifüjlemeden sonra, süpernatan tekrar çıkarılır, 4 ° C de depolanır ve peletlerin bir sonraki ekstraksiyon işlemine geçmeden önce de-iyonize su ile iki kere yıkandı. </li><li> Isteğe bağlı bir adım olarak, bu tür selüloz gibi polimerlerin kalıntı, 500 ul cadoxen (% 31 v / v 1,2-diami ile ekstre edilmiştir2.4 - 2.1 adımlar açıklandığı gibi aynı prosedürü kullanarak 0.78 M CdO ile noethane). Alternatif olarak, kalan pelet mutlak selülozik içeriği Asetik / Nitrik testler (Tartışma bakınız) kullanılarak tespit edilebilir. </li></ol> 3. Baskı Mikroarray&#39;ler <ol><li> Santrifüj süpernatantlar herhangi bir partikül madde kaldırmak için 13.000 xg&#39;de hücre duvarı polimerleri ekstre içeren. </li><li> Bir de polipropilen 384 numune doku tipi ve ekstraksiyon tipine göre düzenlenir Önceden tasarlanmış özel bir düzen kullanarak mikrotiter plaka içine her bir örnek 50 ul yükleyin. </li><li> Deiyonize su ile 0, 5 ve 25 × seri dilüsyon serisi hücre duvarı polimer örneği seyreltin. </li><li> Böyle pin yüksekliği, toplama ve bekleme süresi, ve yıkama adımları gibi parametreler microarrayer kontrol yazılımı ayarlanır. </li><li> Baskı bölmesinin nem örnek buharlaşmasını önlemek için% 60 kontrol edilir. </li><li> Yazdırma işi LabNEXT softwa ile başlatıldığıyeniden ve mikroarray düzeni karşılık gelen bir program. </li><li> Robot makine düz bir levha üstüne tutturulmuş 20 x 20 cm nitroselüloz membran üzerinde numune plaka çözümleri yazdırmak için kılcal kanal işaretçilerine kullanır. Dizisindeki her nokta çözümü 15 nl içerir ve üç nüsha halinde basılır. </li><li> Yazdırma işi tamamlandıktan sonra Özdeş mikroarrayler Tek tek dizileri içine membran ve kesim birbirlerine yanında yazdırılır. </li><li> Her bir deneyde, diziler daha fazla ya da daha az örnekleri, seyreltici ya da çoğaltır yerleştirmek için modifiye edilebilir. </li></ol> 4. Glukanıdır Mikroarray&#39;ler arasında Sondalama <ol><li> Baskıdan sonra, spesifik olmayan bağlayıcı azaltmak için fosfat içinde çözüldü ağırlık / hacim kaymağı alınmış süt tozu 2 saat boyunca oda sıcaklığında (Mpbs) tamponlu tuzlu su içinde% 5 bireysel mikrodizileri bloke eder. </li><li> Mpbs içinde 2 saat için hücre-duvar glikan epitoplar için spesifik monoklonal antikorlar ile Sondası mikrodizileri. Monoklonal antib çoğunluğuHücre duvarı glukanlardır karşı odies üç firmalardan ticari olarak temin edilebilirler; Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ), Carbosource Hizmetleri ( <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a> ) ve PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ). </li><li> Bir negatif kontrol, sadece Mpbs ve birincil antikor ile birlikte inkübe bir mikro içerir. </li><li> Fosfat içinde 3 kez spesifik olmayan bağlanma kaldırmak için 5 dakika için (PBS), tamponlu tuzlu su mikrodizileri yıkayın. </li><li> 2 saat için Mpbs içinde yabanturpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonder antikor ile mikrodizileri kontrol edin. Hücre duvarı glukanlardır karşı en monoklonal antikorlar, anti-fare veya anti-sıçan sekonder antikor gerektirir. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma kaldırmak için 5 dakika için 3 kez PBS tamponu ile yıkama adımları tekrarlayın. </li><li> Kromojenik (3,3-diaminobenzidin) ya da chemil kullanılarak mikrodizileri geliştirmekuminecent (luminol) yüzeyler. </li></ol> 5. Niceleme <ol><li> Kalkınma sonra, yüksek çözünürlüklü (1200 dpi) masaüstü tarayıcı kullanarak bireysel mikroarrayler taramak ve negatif, 16 bit TIFF dosyaları (Şekil 3) olarak kaydedin. </li><li> Otomatik ızgara aracı ile donatılmış Görüntü İşleme Yazılımları (LabNEXT) Xplore kullanarak her nokta ayrılmaz yoğunluğunu hesaplayın. Tamamlayıcı nokta yoğunluğu her bir nokta çevreleyen ızgara alanı içinde piksellerin toplamı elde edilir. </li><li> Her mikroarray için grid veri bir txt dosyası olarak ihraç edilir ve manuel analizi için bir Excel elektronik tablo içine alınabilir. Bir çevrimiçi araç ( <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/</a> ) otomatik olarak tercüme ve bireysel txt dosyalarından veri işlemek için geliştirilmiştir. </li><li> İntegral nokta yoğunluğu baskı çoğaltır genelinde ortalama bir &#39;ortalama bir nokta elde etmek dilüsyonları edilirHer numune için yoğunluk &#39;değeri (Şekil 2). Alternatif olarak, bir dizi üzerinde sadece tek bir seyreltme değerine karşılık gelen nokta sinyaller her bir numune için göreli bolluk glikan epitop ölçmek için kullanılır. </li><li> Farklı numuneler arasındaki göreceli ortalama nokta yoğunlukları excel veya çevrimiçi heatmapper araçları (koşullu biçimlendirme kullanarak bir heatmap (Şekil 4) olarak sunulmaktadır <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm</a> ). Her antikor tipi için veriler 100 düzeltilir ve% 5 eşik değeri arka sinyal ve yanlış pozitif kaldırmak için uygulanmaktadır. </li></ol>

<ol><li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants%3A+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li>
<li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action%2C+matrix+properties%2C+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li>
<li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+walls%3A+the+skeleton+of+the+plant+world%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li>
<li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall%3A+searching+for+the+genes+that+define+structure%2C+architecture+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li>
<li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li>
<li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li>
<li>Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillats%2C+WGT+%22The+Plant+Cell+Wall%22">The Plant Cell Wall</a>. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).</li>
<li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li>
<li>Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li>
<li>Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506(2011).</li>
<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , In Press (2012).</li>
<li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7%2C+JIM5+and+JIM7%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li>
<li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li>
<li>Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li>
<li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li>
<li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li>
<li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+linkage+%281%E2%86%923%29%2C%281%E2%86%924%29-%CE%B2-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li>
<li>Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga%2C+Chara%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li>
<li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li>
<li>Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

CoMPP birkaç gün içinde yüzlerce bitkisel kaynaklı numunelerin glukanıdır kompozisyonu profilleme için hızlı ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, lektinler, reseptörleri ve antikorları 16 gibi glukanıdır-bağlayıcı proteinler ile karbohidrat etkileşimleri yüksek verimli tarama zaten mevcut bakteriyel veya memeli glukanıdır dizi platformlar tamamlar. Hücre duvarı glukanlardır tespit etmek için kullanılabilir probları geniş bir çeşitliliği ile, bitki hücre duvarı 8,9 polisakkaritlerin tüm ana sınıfa ai...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 3 mm Tungsten Karbür boncuk </td><td> Qiagen </td><td> 69997 </td><td></td></tr><tr><td> Koleksiyon mikrotüpler (1,2 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 19560 </td><td> 1.5 ml mikrofüj tüpler de kullanılabilir </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser II </td><td> Qiagen </td><td> 85300 </td><td></td></tr><tr><td> 3 mm cam boncuklar </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDtA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 34588 </td><td></td></tr><tr><td> Oksit Kadmiyum </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-diaminoetan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 03550 </td><td></td></<html> tr&gt; <tr><td> Nitroselüloz membranı (0.22 mikron gözenek boyutu) </td><td> GE-su ve proses teknolojileri </td><td> EP2HY00010 </td><td> farklı gözenek boyutlu membranlar farklı pin tipleri için uygundur </td></tr><tr><td> Xact II microarrayer robot </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> Xact II robot nitroselüloz membran bağlı olduğu özel bir 20 x 20 cm seramik plaka takıldı </td></tr><tr><td> RM mikroarray işaretçilerine Xtend </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> işaretçilerine zarlarında tespit için uygun olmalıdır </td></tr><tr><td> 384 oyuklu plakalar (polipropilen) </td><td> Greiner </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-glikan monoklonal antikor </td><td> / Bitki Probları CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> Web siteleri; PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ), Carbosource (ww.carbosource.net &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.carbosource.net) ve Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ). </td></tr><tr><td> Anti-sıçan IgG (tüm molekül) - keçi üretilen peroksidaz antikor. </td><td> Sigma </td><td> A9037 </td><td> İkincil antikor tipi (örneğin fare, sıçan, keçi vb yükseltilmiş) kullanılan birincil antikor bağlıdır. </td></tr><tr><td> SIGMA FAST 3,3 &#39;-diaminobenzidin tablet </td><td> Sigma </td><td> D4293 </td><td> reaktif geliştirilmesi tipi, kullanılan ikincil antikorlar ve tespit yöntemi (colourmetric, ya da chemiluminecent) bağlıdır. </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico Chemiluminescent Yüzey </td><td> Thermoscientific </td><td> 34080 </td><td> yukarıya bakın </td></tr><tr><td> Görüntü İşleme Yazılımları Xplore </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> Otomatik gridding araçları ile birçok yazılım türleri mevcutturmikroarray noktalar piksel değerini ölçmek için. </td></tr><tr><td> Bitki polisakkaritler </td><td> Sigma / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroarray&#39;ler kullanarak bitki hücre duvarı polimerlerin glukanıdır profilleme

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Bitki hücre duvarları fizyolojisi ve bitki gelişmesinde önemli bir rol oynar ve insan topluluklarının (örneğin tahta, kağıt, tekstil ve biyoyakıt endüstrisi) 1,2 için hammadde sağlamak heterojen glukanlardır karmaşık matrisler vardır. Bununla birlikte, bu bileşenlerin biyosentezini ve işlevlerini anlamada zorlu kalır. Hücre duvarı glukanlardır kimyasal ve yapı taşları, glikozil kalıntılarının karmaşıklığı nedeniyle conformationally çeşitlidir. Bu formu çoklu pozisyonlarda bağlar ve halka yapısı farklı, izomerik ya da anomerik konfigürasyon, ve ek olarak, non-şeker artıkları bir dizi ile sübstitüe edilmiştir. Glukanıdır kompozisyonu hatta farklı hücre ve / veya doku tipleri veya tek bir hücre duvarı 3 alt alan adları değişir. Ayrıca, bunların bileşimi, aynı zamanda 1 geliştirme sırasında, ya da çevresel işaret 4 yanıt olarak modifiye edilir. Ex2.000 genlerin cess Bitki hücre duvarlarının heterojen glukanlardır karmaşık matrisler Arabidopsis 5 hücre duvarı glukanıdır biyosentezi ve modifikasyonu yer alacağı öngörülmüştür olanlarıdır. Bununla birlikte, biyosentez genlerinin göreceli olarak az sayıda işlevsel olarak 4,5 karakterize edilmiştir. Genlerin çoğu zaman farklı olarak hücre tipleri 6 arasında, sık sık düşük seviyelerde ifade edilir çünkü karşıt genetik yaklaşım zordur. Ayrıca, mutant çalışmalar genellikle uygun hücre duvarı işlevi 7 korunmasını sağlamak için gen fazlalık veya telafi edici mekanizmalar tarafından engellenmiştir. Böylece yeni yaklaşımları hızla glukanıdır yapıların çeşitli karakterize etmek ve anlayış hücre duvarı biyosentezi ve modifikasyonu fonksiyonel genomik yaklaşımlar kolaylaştırmak için ihtiyaç vardır. Monoklonal antikor (mAb) 8,9 Bitkilerde glukanıdır yapısı ve dağılımı belirlenmesi için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu dist tanımakpektinler, xyloglucans, xylans, mannans, glukan ve arabinogalactans gibi bitki hücre duvarının glukanlardır ana sınıfları, içinde bulunan inct epitoplar. Son zamanlarda bunların kullanımı bitki ve doku tipleri eşzamanlı 9,10,11 geniş bir yelpazede glukanlardır göreli bolluğu belirlemek için geniş çaplı tarama deneyler kadar uzatılmıştır. Burada düşük reaktif ve numune hacimleri ile minyatür bir mikroarray platformu kullanarak ekranlı olması (100 sn) çoklu örnekleri sağlar Kapsamlı Mikroarray Polimer Profiling (CoMPP) (Şekil 1 ve 2) 10,11 adlı bir mikroarray tabanlı glukanıdır tarama yöntemi sunuyoruz. Mikroarray üzerinde nokta işaretleri resmen glukanıdır epitop oluşumu hakkında yarı-nicel veri vermek için ölçülebilir. Bu yaklaşım karmaşık biyolojik sistemlerin 12 glukanıdır değişiklikleri izleme ve hücre duvarı kompozisyonları küresel bir bakış sağlamak için uygundur, özellikle önceki bilgilerif Bu kullanılamıyor.

Nicotiana alata çiçeklerden altı doku tipleri (anter filamentler, polen, yumurtalıklar, yaprakları, sepals ve stigma) olarak glukanlardır göreli bolluğu CoMPP kullanılarak belirlendi. Şekil 3A kısmen (düşük) methylesterified homogalacturonan (HG), pektik polisakkaritler 14 oluşur bir epitopu için mAb JIM5 özel ile probed edilmiş bir temsilcisi mikroarray gösterir. JIM5 epitopunu çiçek dokuların CDtA özleri algılanırsa ancak mercek dokusu (Şekil 3A ve 4A) polen ve en düşük en yüksek o...

Denilen bir tekniği<strong&gt; C</strong&gt; Omprehensive<strong&gt; M</strong&gt; Icroarray<strong&gt; P</strongBitki hücre çeperi glukanlardır karakterizasyonu için&gt; olymer profil (CoMPP) tarif edilir. Bu yöntem, biyolojik bağlamlarda geniş bir aralıkta glikan geçtiği tarama izin veren bir minyatür mikrodizi analitik platformu ile tanımlanan glikan-epitoplara karşı yönelik monoklonal antikorlar özgüllük birleştirir.

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Bitki hücre duvarları, bitkilerin fizyolojisinde ve gelişiminde önemli bir rol oynayan ve ... sağlayan heterojen glikanlardan oluşan karmaşık matrikslerdir.

Bu prosedürün genel amacı, glikan mikro dizileri kullanarak geniş bir bitki veya doku tipi yelpazesinde hücre duvarı polimer bileşimini karşılaştırmaktır. Öncelikle, ilgili bitki dokularını hasat edin. Homojenizasyon sonrası alkolde çözünmeyen kalıntılar hazırlayın.Ardından, hücre duvarı glikanlarını sırasıyla CDTA ve sodyum hidroksit kullanarak ekstrakte edin. Daha sonra, hücre duvarı glikan ekstraktlarını bir robot yardımıyla bir mikroarray üzerine basın. Mikroarrayleri, hücre duvarı glikanlarına yönelik monoklonal antikorlarla problayın ve mikroarraylerdeki spot sinyallerini nicelendirin.Nihayetinde, sonuçlar ilgilenilen bir örnek setindeki glikan epitoplarının göreceli bolluğunu belirlemek için kullanılabilir. Birden fazla bitki doku tipindeki hücre duvarı glikan varlığının eş zamanlı olarak genel bir görünümünü sunma vele kompozisyonel farklılıkları tespit etme ihtiyacını fark ettiğimizde bu mikro-dizi yöntemini geliştirdik. Dolayısıyla, bu tekniğin monosakkarit analizi gibi geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, yüzlerce örneğin aynı anda taranabildiği mikro-dizi tabanlı bir platform olmasıdır. Bu, hücre duvarı kompozisyonunun profillenmesi için hızlı ve kapsamlı bir yöntemdir. İlgilenilen her doku için, sıvı azot kullanarak 100 miligram taze ağırlıktaki bitki dokularından oluşan üç paralel örnekle başlayın.Örnekleri ince bir toz haline gelene kadar homojenize edin, ardından hücre duvarı materyalini hazırlamak için homojen karışımı 10 mililitrelik plastik konik tüplere aktarın. Homojen karışımı oda sıcaklığında 10 mililitre %80 etanol içinde yeniden süspande edin ve iki dakika boyunca şiddetle vorteksleyin. Örnekleri 3,500 ×g'de santrifüjleyin ve süpernatantı atın.%70 ethanol yıkamalarını en az üç kez veya üst faz berraklaşana kadar tekrarlayın. Ardından %100 aseton ile son bir yıkama gerçekleştirin. Alkolde çözünmeyen kalıntıları paletleyin ve ince ve homojen bir toz elde etmek için gece boyunca havada kurutun; alkolde çözünmeyen kalıntı örneklerini 0,4 milimetrekare gözenekli bir elekten geçirin.Ardından, karıştırma işlemi için her birinde üç milimetrelik bir cam boncuk bulunan mikro tüplere, alkolde çözünmeyen kalıntı örneklerinden 10 miligram tartın. Pektinlerin ve pektinle ilişkili polimerlerin ekstraksiyonu için her bir örneğe 500 mikrolitre 50 milimolar CDTA ekleyin, tüpleri kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından tissueizer kullanarak üç saat boyunca sekiz hertz'de karıştırın. Örnekleri 12.000 kat yerçekimi ivmesinde santrifüjleyin.G. Süpernatantları dikkatlice uzaklaştırın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Peletleri bir mililitre deiyonize su ile iki kez yıkayın. Kalan hücre duvarı peletinden tüplerdeki tüm sıvıyı uzaklaştırın.Çapraz bağlayıcı glikanları ekstrakte etmek için 0,1% sodyum hidrür içeren dört molar 500 µL sodyum hidroksit kullanın. Daha önce açıklanan ekstraksiyon işlemini uygulayarak, çapraz bağlayıcı glikanlar içeren süpernatantları dört °C'de saklayın. Peletleri deiyonize su ile iki kez yıkayın.Ardından, 500 µL Cain kullanarak selüloz gibi kalıntı polimerleri ekstrakte edin; partikül maddeleri uzaklaştırmak için ekstrakte edilmiş hücre duvarı polimerlerini içeren süpernatantları santrifüjleyin. Daha sonra, örneklerin doku tipine ve ekstraksiyon tipine göre düzenlendiği önceden tasarlanmış özel bir yerleşim düzeni kullanarak, her bir örnekten 50 µL'yi polipropilen 384 kuyucuklu mikrotitre plakasına yükleyin.Ardından, sıfır, beş ve 25 katlık seri dilüsyonlar hazırlamak için hücre duvarı polimer örneklerini deiyonize su ile seyreltin. Mikro-diziler için pin yüksekliği, toplama ve bekleme süresi ile yıkama adımları gibi parametreleri ayarlayın. Örnek buharlaşmasını önlemek için baskı odasının nemini %60'ta kontrol edin.Şimdi yazdırma işlemini başlatın. Robot, örnek plakasındaki solüsyonları, makinede düz bir plakaya sabitlenmiş nitroselüloz membrana yazdırmak için kapiler kanal pinleri kullanır. Dizideki her bir nokta 15 nanolitre solüsyon içerir ve üç kopya halinde yazdırılır.Membran üzerinde yan yana özdeş mikro diziler basın ve bunları tekil diziler halinde kesin. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, her bir mikro diziyi oda sıcaklığında iki saat boyunca %5'lik yağsız süt tozu çözeltisi ile bloklayın.Hücre duvarı glikanı ve epitoplarına özgü monoklonal antikorları ekleyin ve iki saat boyunca inkübe edin. Özgül olmayan bağlanmaları gidermek için mikro dizileri beşer dakikalık üç kez PBS ile yıkayın. Ardından, beşer dakikalık üç PBS yıkamasının ardından, mikro dizileri horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikor ile iki saat boyunca inkübe edin.Mikrodizileri kromojenik veya kemilüminesans substratlar kullanarak geliştirin. Münferit mikrodizileri yüksek çözünürlüklü bir masaüstü tarayıcı ile tarayın. Görüntüleri negatif 16 bit TIFF dosyaları olarak kaydedin.Otomatik bir ızgara aracı ile donatılmış explore görüntü işleme yazılımını kullanarak her bir noktanın integral yoğunluğunu hesaplayın. Ardından, her bir mikro dizin için ızgara verilerini bir metin dosyası olarak dışa aktarın. Analiz için veri dosyasını manuel olarak bir Excel hesap tablosuna aktarın.Her örnek için ortalama bir leke yoğunluğu değeri elde etmek amacıyla, baskı tekrarları ve dilüsyonlar genelindeki integral leke yoğunluklarının ortalamasını alın. Farklı örnekler arasındaki göreceli ortalama leke yoğunluklarını, Excel'deki koşullu biçimlendirmeyi veya çevrimiçi bir ısı haritası oluşturucuyu kullanarak bir ısı haritası şeklinde grafiğe dökün. Her antikor tipi için arka plan sinyalini ve yalancı pozitifleri kaldırmak, verileri 100'e normalize etmek ve %5'lik bir eşik değeri uygulamak için gerekli araçları kullanın.Nicotiana'dan alınan anther filamentleri, polenler, ovaryumlar, petal sapları ve stigma olmak üzere altı doku tipindeki glikanların bağıl bolluğunu ölçmek için kapsamlı mikroarray polimer profilleme kullanılmıştır. Birçok çiçek dokusunun bulunduğu bu çalışmada, mikroarray, pektik polisakkaritler üzerindeki bir epitopa özgü olan monoklonal antikor JIM 5 ile sorgulanmıştır. JIM 5 epitopunun tüm çiçek dokularının CDTA ekstraktlarında tespit edildiği not edilmelidir.Bununla birlikte, seviyesi polende en yüksek, stigma dokusunda ise en düşüktür. İlginç bir şekilde, JIM five epitopu polenin sodyum hidroksit ekstraktlarında saptanmış, ancak diğer dokuların ekstraktlarında saptanmamıştır. Kantitatif bilgiler, ovaryum dokusundaki mikro dizide internal standartlar olarak işlenen farklı saflaştırılmış polisakkaritlerin standart eğrileri oluşturularak elde edilmiştir.Her bir örnekte, toplam hücre duvarı kalıntılarının yaklaşık %1,5'ini oluşturacak şekilde JIM five epitopu içeren yaklaşık 157 mikrogram hoog bulunmaktaydı; buna karşın, polen dokusunda toplam hücre duvarı kalıntısının yaklaşık %6,25'ini oluşturacak şekilde JIM five epitopu içeren 625 mikrogram hoog Ronin mevcuttu. Tüm doku tipleri genelindeki 15 glikan epitopunun bağıl bolluğu bir ısı haritası olarak özetlenmiştir. Renk çubuklarının yoğunluğu, her örnek için düzeltilmiş ortalama spot yoğunluğu ile orantılıdır.Bu verilerin görsel bir temsili, farklı çiçek dokuları arasındaki glikan epitop oluşum farklarının hızlıca yorumlanmasını sağlar. Bu sonuçlar, münferit glikan epitoplarının çeşitli çiçek türleri arasında benzersiz şekilde dağıldığını göstermektedir. Örneğin, LM 13 epitopu, diğer dokularla karşılaştırıldığında antrop filamentlerinde ve SE L dokularında daha boldur.Bu örüntü, MAB LM six tarafından öncelikle tespit edilen daha kısa zincirli epitopların örüntüsüyle çarpıcı bir tezat oluşturmaktadır. Çapraz bağlı glikanlar da birçok çiçekte farklı görülme örüntülerine sahiptir. Örneğin, LM 10 epitopu diğer dokularla karşılaştırıldığında stigma dokusunda bol miktarda bulunur, ancak ovaryum dokusunda mevcut değildir.LM 15 xog glikan epitopları, diğer dokularla karşılaştırıldığında taç yaprak ve anter filamentinde en yüksek seviyededir; hetero maninler ise anter filamentlerinde en yüksek seviyededir. Bu videoyu izledikten sonra, geniş bir bitki ve doku türü yelpazesinde hücre duvarı glikanlarının nasıl ekstrak edileceği ve göreli bolluğunun nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Mikro diziler kullanıldığında, bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra üç günde tamamlanabilir.Bu prosedürü takip eden her adımda, örneklerin ve tekrarların tutarlı bir şekilde işleme tabi tutulması gerektiğini unutmamak önemlidir. Ek soruları yanıtlamak için asetik nitrik asit analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Örneğin, CDTA ve sodyum hidroksit kullanılarak pektinlerin ve kons glikanların ardışık ekstraksiyonu sonrası geriye kalan mutlak selüloz içeriği nedir?Bu teknik, Arabidopsis ve Fisca, Nutella gibi model bitkilerin yanı sıra pamuk, buğday, okaliptüs ve tütün gibi diğer bitkilerdeki glikan oluşumunu hızla karşılaştırmak için bitki hücre biyolojisi alanında geniş bir uygulanabilirliğe sahiptir.

glycan-profiling-of-plant-cell-wall-polymers-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve duvar türetilen karbonhidrat bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur.  Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Bu protokol, enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce RE'yi 2 aminobenzamid ile etiketleyerek ve ardından elde edilen oligosakkaritlerin kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak analiz edilmesiyle, heteroksilanların indirgeyici uç (RE) ve iç bölge glikosil dizi(ler)inin yapısal karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri açıklar.

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Biz hazırlık ve N- glukanlardir turp (Raphanus sativus) farklı çeşitlerin üzerinden analizi için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

N- glukanlardir Raphanus sativus çeşitlerin kullanarak PNGase h+ Analizi

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Bu protokol, Arabinogalactan proteinlerinin ve pektinlerinin immünolokalizasyonu için bitki materyalinin hidrofilik akrilik reçineye gömülü, bölümlenmiş ve cam slaytlara monte edilmiş nasıl sabitlendiğini ayrıntılı olarak açıklar. Hücre duvarı ile ilgili epitopların spesifik antikorlarla tespit edileceğini gösteriyoruz.

Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Öğrenin bitki hücre duvarı glikanlarını CoMPP yöntemiyle karakterize etmeyi. Monoklonal antikorlar ve mikroarray platformu kullanarak farklı bitki türlerinde ve doku tiplerinde glikan bileşimini hızlı ve kapsamlı şekilde analiz edin.

Mikroarray'ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Daha fazla video keşfet