Name: Zebra balığı Embriyonik nöroepitelyumda geçirgenliği için bir Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Öğrenin zebra balığı embriyonik nöroepitelyum geçirgenliğini ölçmek için floresan dextran enjeksiyonu ve görüntüleme tekniklerini kullanarak. Bu yöntem gelişimsel biyoloji ve nörolojik hastalık araştırmalarında beyin gelişimini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Uzman balık yetiştiriciliği için çok faydalı tartışmalar ve yapıcı eleştiri, ve Olivier Paugois için Sive laboratuar üyelerine özel teşekkürler.

1. Mikroenjeksiyon için hazırlık <ol><li> Sutter araçlar iğne çektirmenin kullanarak kılcal tüpler çekerek mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın. </li><li> Floresan boya ile Yük mikroenjeksiyon iğnesi (FITC-Dekstran). </li><li> Mikromanipülatör ve mikroenjeksiyon aparat üzerine iğne takın. </li><li> Dikkatlice genişliği yaklaşık 2 mikron için forseps kullanarak mikroenjeksiyon iğne kırmak, ancak bu sizin mikroenjektör kurulum bağlı olarak değişecektir. Bizim mikroenjeksiyon iğneler için, bu Bükmez ucundan iğnenin birinci bölgeye karşılık gelir. </li><li> Her enjeksiyondan 1 nl sunar, böylece enjeksiyon zamanı ve basınç ayarlama, yağ damlacık çapı ölçün. Harvard Apparatus mikroenjektör için örnek ayarlar şunlardır: P dengesi = 1.4 psi, p = 1.4 psi üzerinden, P 0,4-0,7 sn bir enjeksiyon süresi ile = 22.9 psi, p net = 67,8 psi enjekte. Bu ayarları kullanarak bizim iğne çapı yaklaşık 2 mikron. Bununla birlikte, belirli ayarlar mikroenjektör olabilir, ve bir değişiklik gösterecektiriğne çapı ccording. </li></ol> 2. Embriyolar hazırlanması <ol><li> Coat 2, her durum için su içinde% 1 agaroz ile yemekler, 1-200 ul pipet ucu ile agaroz içine gedikler açar ve agaroz tıpaları çıkarın. Embriyo medya ile yemekler doldurun. </li><li> Kullanma forseps, bir stereomikroskop altında 18 hpf veya yaşlı dechorionate embriyolar. Embriyolar Kimmel ve diğerleri göre sahnelenir. 11. </li><li> İlk agaroz kaplı çanak içine dechorionated embriyolar transfer. </li><li> Embriyolar (12 Westerfield göre yapılmıştır) hareketli bırakana kadar embriyo uyuşturmak için, çanak tricaine (0.1 mg / ml) ilave edilir. </li></ol> 3. Beyin Ventrikül enjekte <ol><li> Orient embriyolar böylece deliğe embriyonun kuyruk koyarak onların dorsal tarafına bakıyorsun. Mikromanipülatör da sağ tarafta ise ön beyin sağa sola ve arka beyin için olacak şekilde, daha sonra embriyo hareket eder. </li><li> Wi Pozisyon iğnearka beyin ventrikül dest noktası. </li><li> Sarısı (Şekil 1A) içine beynin derinliği boyunca gitmek emin olmak arka beyin ventrikül dikkatlice pierce tavan plakası. </li><li> Boya beynin ventriküllerin bütün uzunluğu doldurur emin ventriküllerin içine floresan boya 1-2 nl enjekte edilir. </li><li> Embriyo medya ile dolu ikinci agaroz kaplı çanak embriyo transferi ve yeniden uyutmak gibi 2.4 nitelendirdi. </li><li> HEMEN gibi bir zaman sıfır görüntü elde etmek için 4. bölümde açıklanan görüntüleme başlatmak. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Delikte kendi kuyruğu ile Orient embriyolar gibi 3.1 &#39;de açıklanan. </li><li> Bir aydınlık dorsal görüntü çekmek için gönderilen ve floresan hem ışık ile bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Farklı embriyoların görüntüleme arasındaki büyütme sabit tutun. Bu görüntü J (5,2-6) kullanılarak yapılan analizler, doğrudan karşılaştırma için olanak sağlar. </li><li> Embriyo mikroskop veya çanak HAREKETLİ OLMAKSIZIN, bir alilgili floresan görüntü. </li><li> İstediğiniz zaman noktalarında her bir embriyo için yineleyin. </li></ol> 5. Boya Hareketi Kantitasyonu <ol><li> Önceden Gutzman ve Sive 10 tarafından açıklandığı gibi Photoshop aydınlık ve floresan görüntüler Birleştirme. </li><li> Mesafe mevcuttur Image J yazılımı boya ön hamle ölçün <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> . </li><li> Görüntü J ve nöroepitelyumda bir 10-20 ° açı (Şekil 1A) de ön boyatmak önbeyin menteşe noktasından bir çizgi çizmek için satırı aracını kullanabilirsiniz Aç birleştirilmiş dosya. Bu vahşi tip epitele dışarı çıkması boyanın ilk ve en göze çarpan yer olduğu için bu bölge seçildi. </li><li> Hat uzunluğunu hesaplamak için ölçüm aracı seçin. </li><li> Her zaman noktası için yineleyin. </li><li> Boya ön diğer zaman noktalarından t = 0 anında mesafe çıkarılarak zamanla taşındı net mesafe hesaplayın. </li><li> Üzerinde Çizgrafiği. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Yabani tip embriyoları kullanılarak bir nöroepitelyal geçirgenlik deneyinde elde edilen sonuçlar arasında bir örneği Şekil 1B-B &#39;de gösterilmiştir. Doğru geçirgenliği ayırt etmek için, bu vahşi tip veya kontrol embriyolar (Şekil 2) sadece biraz sızdıran bir boyut tanımlamak farklı moleküler weightsto ile boyalar sınamak yararlıdır. Bu genetik mutantlar veya çevre koşullarının belirlenmesi için izin verdiği ya da artış veya azalma geçirgenliği (Şekil 1D, yeşil ve kırmızı çizgiler sırasıyla). 24 hpf zebrafish nöroepitelyumda için, 70 kDa FITC Dekstran sızıntıları yavaş 2 saat boyunca, 2.000 kDa yapmaz ve hemen 10 kDa sızıntıları dışarı oysa. Bu nedenle 70 kDa iki artış ve nöroepitelyal geçirgenliğini azaltmak olduğunu koşulları tanımlamak için ideal bir moleküler ağırlığı. Iğne ventriküler lümen, floresans w kaçırırsahasta t beyin dışında görünür = 0 (örneğin Gutzman ve Sive, 2009 10 bakınız). Enjekte boya başlangıçta beynin içindeki değildi ve neuropeithelium ve boya ve permeabilite dolaşımına ilişkin net bir sonuca yapılamaz çünkü bu embriyoların atılmalıdır. Nihayet, embriyolar önceden floresan boya enjeksiyonu yapılabilir küçük ventriküller veya un-şişirilmiş beyin ventriküller, bir tuz çözeltisi ile ventriküllerin ön enjeksiyon varsa. Bu floresan boya ile enjekte ederken kolay ventriküllerin sonraki görselleştirme yapmak ventriküller şişirir. Uygun kontroller salin enjeksiyonu, normal nöral tüp gelişimi bozar olup olmadığını belirlemek için yapılmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4242/4242fig1.jpg" /> Şekil 1. Farklı molekül ağırlığı boyalar zamanla seyri. (A) Deneysel Diyagramı. Ilk, Floresan boya ventriküller içine enjekte edilir. X enjeksiyon için iğne = pozisyonu. Sonraki dorsal görüntüler zamanla yakalanır. Sonunda, mesafe menteşe noktası (bir kırmızı çizgi ile temsil edilir) ölçülür önbeyin gelen boya ön tarafından taşındı. (BC) 22 HPF (t = 0 dakika, B) ve HPF 24 (t = 120 dak, C) Aydınlık ve floresan dorsal görüntü birleştirilmiştir. Beyaz çizgi önbeyin ventrikülden boya ön mesafeyi gösterir. (D) Varsayımsal örnek geçirgenliği veri. Mavi = vahşi tip veya denetimleri, kontrol grubuna göre artmış geçirgenlik azalmıştır kontrol göreli geçirgenlik ve yeşil = örneği ile kırmızı = örnek. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4242/4242fig2.jpg" /> Şekil 2. Farklı molekül ağırlığı boyalarını nöroepitelyal geçirgenliği ölçümü. (AE) Dorsal Birleştirilmiş aydınlık ve t 22 hpf vahşi tip embriyo floresan görüntüler = 0 dak FITC-d ile enjeksiyon sonrası10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) ve 2,000 kDa (E): aşağıdaki molekül ağırlıklarında Extran. T = 24 hpf az 120 dak olarak (A&#39;-E &#39;) aynı embriyo (AE). Sola Anterior. F = önbeyin, M = orta beyin, H = arka beyin. Asterisk = kulak.

<ol><li>Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+neurulation%3A+first+impressions+do+not+count%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+vertebrate+neurulation+and+a+re-evaluation+of+teleost+neural+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation.</a> Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).</li>
<li>Salehi, Z., Mashayekhi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cerebrospinal+fluid+on+neural+cell+survival+in+the+developing+chick+cerebral+cortex%3A+an+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study.</a> Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).</li>
<li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).</li>
<li>Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69, 893-905 (2011).</li>
<li>Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Totally+tubular%3A+the+mystery+behind+function+and+origin+of+the+brain+ventricular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system.</a> Bioessays. 31, 446-458 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+neuroepithelial+barrier+by+Claudin5a+is+essential+for+zebrafish+brain+ventricular+lumen+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Information+Network+%28ZFIN%29%3A+a+resource+for+genetic%2C+genomic+and+developmental+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research.</a> Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu, belirli bir moleküler ağırlığa sahip bir enjekte boya için kararlı olarak bir oturma embriyonik zebrafish beyin geçirgenliğini ölçmek için yeteneğini gösterir. Embriyonik zebrafish nöroepitelyumda molekül ağırlıkları farklı boyalar değişik şekillerde geçirgen olduğunu Bizim gözlem boya paracellular geçirgenliği ile hareket ettiğini göstermektedir. Ancak, gözlenen geçirgenliği bir transsellüler katkı olasılığını ekarte edemez. Bu teknik, tüpün iç ve dış hem de görülebilir ve lümen enjekte edilebilir olduğu sürece her...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Dekstran, Flöresein, Anyonik, Lizin tamir edilebilir </td><td> Invitrogen </td><td> D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 </td></tr><tr><td> Tricaine tozu </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Kapiler Tüpler </td><td> FHC A.Ş. </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyonik nöroepitelyumda geçirgenliği için bir assay

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

Beyin ventriküler sistemi omurgalılar arasında muhafaza edilir ve beyin gelişiminin erken aşamalarında oluşturmak ve hayvanın hayatı boyunca korunur beynin ventrikül adı birbirine boşlukları bir dizi oluşur. Beyin ventriküler sistemi omurgalılarda bulunan ve karıncıklar merkez lümen beyin omurilik sıvısı (BOS) 1,2 ile dolduğunda, nöral tüp oluşumu sonra geliştirmektir. BOS normal beyin gelişimi ve işlevi için gerekli olan 3-6 ve proteinden zengin bir sıvıdır. Nöral tüp kapandıktan sonra zebrafish, beyin ventrikül enflasyon, yaklaşık 18 saat sonrası fertilizasyon (HPF) başlar. Birden süreçler nöroepitelyumda oluşumu, geçirgenlik ve BOS üretimini düzenleyen sıkı kavşak oluşumu dahil beynin ventrikül oluşumu ile ilişkilidir. Bütün bu işlem etkileyen, Na, K-ATPaz beyin ventrikül şişirme için gerekli olduğunu göstermiştirClaudin 5a sıkı birleşim oluşum 9 için gerekli olan süre ES 7,8,. Ayrıca, en miyozin inhibisyonu yoluyla, embriyonik epitele bu &quot;gevşeme&quot; gösterdi beyin karıncık şişirme ile ilişkilidir. Zebrafish beynin ventrikül şişirme sırasında geçirgenliği düzenlendiğini incelemek için, bir ventriküler boya tutma testi geliştirdi. Bu yöntem, floresan beyin omurilik sıvısı etiketlemek için, oturma zebrafish embriyo, önceden laboratuarımızda 10 yılında geliştirilen bir teknikle beyin ventrikül enjeksiyon kullanır. Embriyolar sonra beyin ventriküller ve nöroepitelyumda aracılığıyla floresan boya hamle olarak zamanla görüntülü. Mesafe boya ön ölçülür uzağa saat boyunca epitele ve bazal (non-luminal) tarafından taşınır ve nöroepitelyal geçirgenlik bir ölçüsüdür (Şekil 1). Biz boyalar 70 kDa ve küçük nöroepitelyumda hareket edeceğini gözlemlemek ve detecte olabilir24 hpf (Şekil 2) embriyonik zebrafish beyin dışında d. Bu boya tutma analiz gelişimi esnasında farklı zamanlarda, farklı genetik yapısının çeşitli nöroepitelyal geçirgenlik analiz etmek için kullanılır, ve çevresel düzensizliklerin sonrasında olabilir. Aynı zamanda, CSF patolojik birikim incelenmesinde yararlı olabilir. Genel olarak, bu teknik araştırmacılar, gelişme esnasında ve hastalık geçirgenlik rolü ve düzenleme analiz etmeyi sağlar.

Biz embriyonik zebrafish beyin geçirgenliği için canlı bir bütün hayvan kantitatif ölçümü tarif. Tekniği nöral tüp lümeninde farklı molekül ağırlıklarında beyin omurilik sıvısı ve molekülleri korumak için yeteneği analiz ve ventriküllerin kendi hareketini rakamlarla. Bu yöntem, gelişme esnasında ve hastalık epitel geçirgenlik ve olgunlaşma farklılıkları belirlemek için yararlıdır.

Zebra balığı Embriyonik nöroepitelyumda geçirgenliği için bir Assay

Beyin ventriküler sistemi omurgalılar arasında korunmuştur ve beyin ventrikülleri adı verilen bir dizi birbirine bağlı boşluktan oluşur; bunlar ...

Bu prosedürün genel amacı, zebrafish embriyonik nöroepitelyumunun geçirgenliğini nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle beyin ventriküllerine 70 kilodalton fitzy dekstran enjekte edilerek gerçekleştirilir. Ardından, parlak alan ve floresan görüntülerden oluşan bir zaman dizisi elde edilir.Ardından, her zaman noktasında floresan boyanın ön beyin menteşe noktasından olan mesafesi ölçülür. Son olarak, zaman içinde kat edilen mesafe hesaplanır. Nihayetinde, farklı genetik arka planların veya çevresel koşulların karşılaştırılmasıyla nöroepitelyal geçirgenlikteki değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu prosedürün genel amacı, zebra balığı embriyonik nöroepitelindeki geçirgenliği nicelleştirmektir. Enjeksiyona hazırlanmak için önceden hazırlanmış bir enjeksiyon iğnesini floresan boya ile doldurun; iğneyi manipülatöre ve mikroenjeksiyon aparatına monte edin. Mikroenjeksiyon iğnesini yaklaşık iki mikron genişliğe getirmek için pens kullanarak dikkatlice kırın.Her bir enjeksiyonun bir nanolitre hacim iletmesi için enjeksiyon süresini ve basıncını ayarlayarak yağ içindeki damla boyutunu ölçün. Embriyoları hazırlamak için her bir koşul için iki tabağı suda %1 agros ile kaplayın ve 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak agros üzerinde delikler açıp tıkaçları çıkarın. Tabakları bir stereo mikroskop altında embriyo medyumu ile doldurun. Döllenmenin üzerinden 18 saat veya daha fazla zaman geçmiş embriyoları klorlamak için pens kullanın.Ardından, embriyoları anestezi yapmak için agros kaplı kaplardan birine aktarın. Kaba trica ekleyin ve embriyolar hareket etmeyi bırakana kadar bekleyin. Embriyonun kuyruğunu deliğe yerleştirerek, sırt kısmını görecek şekilde konumlandırın.Mikromanipülatörünüz sağdaysa, embriyoyu ön beyin sola ve arka beyin sağa gelecek şekilde hareket ettirin. İğneyi arka beyin ventrikülünün en geniş noktasına yerleştirin. Ardından, beynin derinliğinden geçip vitellusa girmediğinizden emin olarak, arka beyin ventrikülünün tavan plağını dikkatlice delin.Ardından, boyanın beynin tüm uzunluğunu doldurduğundan emin olarak ventriküllere bir ila iki nanolitre floresan boya enjekte edin. Ventriküller. Embriyoları, embriyo ortamı ile doldurulmuş ikinci agar tabağına aktarın ve onları yeniden anestezi altına alın. Görüntüleme zamanını elde etmek için derhal görüntülemeye geçin.Embriyoları görüntülemek için sıfır görüntü alın. Embriyoları, daha önce olduğu gibi, hem transmisyon hem de floresan ışığa sahip bir diseksiyon mikroskobu altında kuyrukları deliğe gelecek şekilde yönlendirin. Bir aydınlık alan dorsal görüntüsü alın.Embriyolar arasında sabit bir büyütme sağlayarak, embriyo mikroskobunu veya kabını hareket ettirmeden doğrudan karşılaştırma yapılmasına imkan tanıyın. Karşılık gelen bir floresan görüntü alın; bu işlemi her embriyo ve istenen her zaman noktası için tekrarlayın. Boya hareketini nicelleştirmek için, brightfield ve floresan görüntüleri birleştirmek amacıyla Photoshop kullanın.Ardından boya cephesinin hareket ettiği mesafeyi ölçmek için, Image J'yi kullanarak birleştirilmiş dosyayı açın ve nöroepitelyumdan 10 ila 20 derecelik bir açıyla ön beyin menteşe noktasından boya cephesine doğru bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın; çizginin uzunluğunu hesaplamak için ölçüm aracını seçin. Son olarak, sıfırıncı zamandaki mesafeyi diğer zaman noktalarından çıkararak boya cephesinin zaman içindeki net hareket mesafesini hesaplayın.Hareketleri gösterilen bir grafiğe aktarın. Burada, yabani tip embriyolar kullanılarak elde edilen nöroepitel geçirgenlik sonuçlarına dair bir örnek verilmiştir. Burada gösterilen birleştirilmiş parlak alan görüntüleri sırasıyla döllenmeden sonraki 22. ve 24. saatlerde alınmıştır.Beyaz çizgi, D ön yüzünün ön beyin ventrikülüne olan mesafesini göstermektedir. Grafik, mavi ile gösterilen kontrol embriyolarına kıyasla yeşil ile gösterilen geçirgenlik artışını veya kırmızı ile gösterilen geçirgenlik azalmasını belirleme yeteneğini kanıtlayan hipotetik örnek geçirgenlik verilerini göstermektedir. Geçirgenliği doğru bir şekilde ayırt edebilmek için, vahşi tip veya kontrol embriyolarında yalnızca hafif sızıntı yapan bir boyutu tanımlamak amacıyla farklı moleküler ağırlıklardaki boyaları test etmek faydalıdır.Bu durum, 24 saat boyunca geçirgenliği artıran veya azaltan genetik mutantların veya çevresel koşulların belirlenmesine olanak tanır. Döllenme sonrası, vahşi tip zebra balığı nöroepitelyumunda; 70 kilodalton fitzy dekstran iki saat boyunca yavaşça sızarken, 2000 kilodalton sızmaz ve 10 kilodalton neredeyse anında dışarı sızar.Bu nedenle, nöroepitel geçirgenliğini hem artıran hem de azaltan koşulları belirlemek için ideal moleküler ağırlık 70 kilodaltondur. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik zebrafish'te nöroepitel geçirgenliğinin nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

an-assay-for-permeability-of-the-zebrafish-embryonic-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu makale, zebra balıklarının larva hareketini izleyerek toksik bileşiklere karşı davranışsal tepkisini açıklamaktadır. Protokol ayrıca zebra balığı larvalarının çevresel kirleticiye verdiği tepkinin bir örneğine de bakıyor.

Larva Hareket Deneyi: Zebra Balığı Larvalarında Bir Bileşiğin Nörodavranışsal Toksisitesini İncelemek İçin Yüksek Verimli Yöntem

Bu video, zebra balığı embriyolarında motor nöronların elektrofizyolojisini incelemek için invaziv olmayan bir testi göstermektedir. Omurilik motor nöronlarının spontan depolarizasyonu sonucu embriyolarda kuyruk koilinin ölçümü yapıldıktan sonra, koilleme frekansını azaltmak için bir sodyum kanal blokeri uygulanır. Daha sonra, embriyolar agaroz içinde hareketsiz hale getirilir ve bir floresan mikroskobu altına yerleştirilir. Genetik olarak tasarlanmış motor nöronlar, bir donör ve bir alıcı...

Zebra Balığı Embriyolarında Motor Nöronların Elektrofizyolojisini İncelemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yaklaşım

Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık ziyade embriyo / larva incelenir için, erişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde uygulanabilen bir nicel yan hat rejeneratif deneyi geliştirilmiştir. Deney 1) neuromast ve 2) tek tek saç hücre düzeyde çözünürlüğü dahil.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Burada plazmid DNA dağıtımı ve yetişkin zebrabalığı telencephalon ependymoglial hücre etiketleme için bir elektroporasyon yöntemi dir. Bu protokol, tek tek ependymoglial hücreleri görselleştirmek ve izlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir ve çok çeşitli genetik manipülasyonlara elektroporasyon uygulamak için yeni olanaklar sunar.

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Kan-beyin bariyerbütünlüğü sinir sistemi fonksiyonu için çok önemlidir. Drosophila melanogasterolarak, kan-beyin bariyeri geç embriyogenez sırasında glial hücreler tarafından oluşur. Bu protokol, D. melanogaster embriyolarında ve üçüncü instar larvalarında kan-beyin bariyeri oluşumu ve bakımı için taht yöntemlerini açıklamaktadır.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Zebra balığı embriyo titreşimi ürkütücü tepkisine dayalı olarak kimyasal bileşik toksisitesini değerlendirmek için bir tarama sisteminin iş akışını ve veri analizini açıklıyoruz. Sistem, zebra balığı embriyolarının bir titreşim uyaranına maruz kaldıklarında hareketlerini kaydeder ve genel toksisite/ölümcüllük ve nöromüsküler toksisitenin entegre bir değerlendirmesine izin verir.

Zebra Balığı Titreşim İrkilme Tepkisi Tarama Sistemi Kullanılarak Kimyasalların Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, Evan'ın mavi boya bazlı değerlendirmesini kullanarak yetişkin zebra balığı (Danio rerio) modelinde kan-beyin bariyeri (BBB) bütünlüğünü değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sunar ve nörovasküler bozulmanın hem kalitatif hem de kantitatif analizini sağlar.

Bekçiyi Görselleştirmek: Evan'ın Yetişkin Zebra Balıklarında Kan-Beyin Bariyeri Geçirgenliğine İlişkin Mavi Boya Bazlı Değerlendirmesi

Öğrenin zebra balığı embriyonik nöroepitelyum geçirgenliğini ölçmek için floresan dextran enjeksiyonu ve görüntüleme tekniklerini kullanarak. Bu yöntem gelişimsel biyoloji ve nörolojik hastalık araştırmalarında beyin gelişimini incelemeye yardımcı olur.

Zebra balığı Embriyonik nöroepitelyumda geçirgenliği için bir Assay

Daha fazla video keşfet