Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Bu prosedürün genel amacı, tıklama kimyası (click chemistry) yoluyla viral yüzeylerin yeniden mühendislenmesine yönelik esnek bir yöntemi göstermektir. Bu prosedürün ilk adımında, insan embriyonik böbrek hücreleri tip beş adenovirüs ile enfekte edilir ve ya doğal olmayan amino asit olan homo alanin ya da aseto şeker parasiti N-asetoasetil glukozamin varlığında inkübe edilir. İki gün sonra, azid işaretli adenovirüs partikülleri toplanır ve saflaştırılır.

Ardından, floresan probları bu partiküllerin yüzeyine bağlamak için kemoselektif azot-alkin sikloekleme işlemi kullanılır. Yazılı protokolde açıklandığı üzere, bu işlem iki olası bağlama yönteminden biri kullanılarak gerçekleştirilir: gerinim destekli veya bakır katalizli azot-alkin sikloekleme.

Terapötik uygulamalarda bu bağlantılar polipeptit polimerlerini veya küçük molekülleri içerebilir. Bu deneyde, probun kapsid proteinlerine bağlanması SDS-PAGE aracılığıyla gösterilebilmesi için floresan bir prob kullanılmıştır. Özellikle terapötikler, gen aktarımı, onkotik tedavi ve aşı teknolojisi bağlamında, virüslerin gen aktarım ajanları olarak geliştirilmesine yönelik önemli bir ilgi vardır.

Bu bağlamda, virüs-konak etkileşimini optimize etmek, terapötik doku hedefli immün stimülasyon için uygun özelliklerin elde edilmesi açısından özellikle önemlidir. Konak-virüs etkileşiminin optimizasyonunda birçok başka faktör de önem taşımaktadır. Bu doğrultuda, iki aşamalı bir etiketleme protokolü geliştirmiş bulunmaktayız.

İlk adım, doğal olmayan bir amino asidin veya doğal olmayan bir şekerin metabolik olarak tanıtılmasıdır. Bu işlem, virüslerin enfektivitesini veya genel uygunluğunu önemli ölçüde bozmadan —ki bu aşılması gereken büyük bir engeldir— virüslere istediğimiz hemen hemen her türlü fonksiyonelliği eklememize olanak tanıyan, çok yüksek seçiciliğe sahip kimyasal yöntemlerle daha sonra geliştirebileceğimiz bir çapa noktası oluşturur. Davumbazı ve laboratuvar ekipmanlarını sterilize ettikten sonra, 37 °C'de HEK büyüme ortamında tutulan HEK 2 93 hücreleri içeren 11 adet 100 milimetrelik kültür tabağı hazırlayın.

Hücre kültürü %80 ila %90 konfluense ulaştıktan sonra, kaplardan birindeki büyüme ortamını uzaklaştırın ve TD tamponu ile bir kez yıkayın. Hücreleri bir mililitre tripsin EDTA ile serbest bırakın ve bir dakika boyunca inkübe edin. Dokuz mililitre büyüme ortamı ekleyin ve bu kaptaki hasat edilen hücre sayısını sayın.

Bir hemositometre kullanarak, geri kalan 10 kültür kabının her biri için enfeksiyon için gerekli olan adenovirüs partikül sayısını hesaplayın. Büyütme ortamını yavaşça uzaklaştırın, ardından beş mililitre TD tamponu ile yıkayın. Bir mililitre enfeksiyon tamponu ekleyin ve bu süre zarfında bir saat boyunca inkübe edin.

Enfeksiyondan sonra her 15 dakikada bir kapları yanlara doğru nazikçe sallayın. Her bir kaba dikkatlice dokuz mililitre HEK büyüme ortamı ekleyin ve 18 saat daha inkübe edin. Sistin içindeki bir HA'nın konsantre stok çözeltilerinden.

Yazılı protokole uygun olarak bir HA işaretleme ortamı hazırlayın. Öncelikle bu stok çözeltileri 0.2 mikrometre tipinde bir şırınga filtresiyle filtrelediğinizden emin olun. Kontrol için kullanılan metiyonin stok çözeltisini aynı şekilde sterilize edin; büyüme ortamını dikkatlice uzaklaştırın ve her bir kültür kabını beş mililitre TD tamponu ile yıkayın.

Bunu 10 mililitre HA işaretleme ortamı ile değiştirin ve enfekte hücreleri altı saat daha inkübe edin. Viral kapsid proteinleri şimdi azo homo alanin varlığında ve metiyonin yokluğunda transle edilecektir. İşaretleme ortamını dikkatlice 10 mililitre taze büyüme ortamı ile değiştirin ve 18 saat daha inkübe edin.

Bu adım tamamlandıktan sonra, videonun üçüncü adımındaki saflaştırma prosedürüne geçiniz. Alternatif olarak, azi etiketleri, doğal olmayan amino asit a HA yerine azi içeren şekerler aracılığıyla tanıtılabilir. Bu protokolde, UDPN Acetoacetyl Glucosamine'in metabolik öncülü olan parazitle ilişkili n acetoacetyl galacto aseto şekeri varlığında büyütülmüştür.

Şeker etiketleme işlemini gerçekleştirmek için Tip beş adenovirüs, yalnızca fiber üzerinde azi grupları sunacaktır. İlk olarak, ekrandaki uyarıya kadar videonun birinci adımını takip edin. Bu, yazılı protokoldeki adım 1.5'e karşılık gelmektedir.

Önce 100 µL ATO şeker stok çözeltisini Falcon tüplerine pipetleyip metanolün buharlaşmasını sağlayarak şeker işaretleme çözeltisini hazırlayın. Ardından, 100 mL HEK büyüme ortamı ekleyin. Her kaptaki hücrelerin üzerini 10 mL bu şeker işaretleme ortamı ile kaplayın ve 37 °C'de 44 saat boyunca inkübe edin.

Saflaştırma için üçüncü adıma geçiniz. Kültür kabındaki enfekte hücreleri medyum ile birlikte iki konik tüpe aktarın ve 4 °C'de, 10 dakika boyunca 2000 G'de santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve her bir peleti, 37 °C'lik bir benmari içinde sıvı azot kullanarak dört mililitre TD tamponunda yeniden süspande edin. Enfekte hücreleri liz etmek için üç dondurma-çözdürme döngüsü gerçekleştirin. Her döngü arasında süspansiyonu bir vorteks ile karıştırın.

Birinci adımda enfeksiyon için kullanılan adenovirüs GFP transgeni içerdiğinden, bu aşamadaki floresan aktivite viral DNA'nın transduksiyonunu ve ekspresyonunu doğrular; hücre kalıntılarını çöktürmek için çözme süspansiyonunu 2000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. 1,25 g/mL ile 1,4 g/mL arasında bir sezyum klorür yoğunluk gradyanı dikkatlice hazırlayın. Lizize edilmiş hücre süpernatantını yoğunluk gradyanının üzerine pipetleyin ve 15 °C'de 126.000 G'de bir saat boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjleme işleminden sonra, santrifüj tüpünde kalın ve geniş bir bant oluşmuş olmalıdır. Bu, azi modifiyeli virüstür. Tüpün altına bir star L iğne ile delik açarak içeriğin damla damla akmasını sağlayın ve bu virüsü dikkatlice toplayın.

İki ligasyon yönteminin bandı suşu göstermiştir. Promote edilen rota daha basit reaksiyon koşulları içerir, ancak suş promote ligasyonu gerçekleştirmek için ticari olarak mevcut probların daha sınırlı bir seçeneğine sahip olma dezavantajını taşır. Virüs saklama tamponu içindeki 50 µL azi modifiyeli virüsü, 0,25 µL Tamara BCN etiketleme çözeltisi ile karıştırın; tüp kapağının altını folyo ile vurarak karıştırın ve oda sıcaklığında gece boyunca döndürün.

Click virüsünü santrifüj destekli jel filtrasyonu kullanarak saflaştırın. Spin kolonları virüs saklama tamponu ile dengeleyin. Oksijensiz bakır(I) katalizörlü sikloekleme, probların daha yüksek erişilebilirliğini sağlar, ancak oksijensiz bir atmosferi sürdürmek için özel ekipman gerektirme dezavantajına sahiptir.

Bakır katalizli ligasyon gerçekleştirmek için, öncelikle tüm reaksiyon materyallerini ve çözeltileri bir azot eldiven torbasında altı saat boyunca deoksijenize edin. Bu sürenin ardından, reaksiyonu başlatmak için eldiven torbası içerisinde bakır(I) katalizör stok çözeltisini hazırlayın. Virüs probu ve şelatlayıcı ajandan oluşan 50 µL'lik çözeltiye, bu bakır stok çözeltisinden 1 µL ekleyin.

Etiketleme reaksiyonunun eldiven torbasında gece boyunca sürmesine izin verin. Kabul filtrasyonunu dördüncü adımdaki gibi saflaştırın. Kaynatma sonrası, saflaştırılmış, tıklanmış virüsü ve laly örnek tamponu ile 10 dakika boyunca bekletin.

Kuyuya seçilen virüsü ve kontrolleri yükleyin ve elektroforezi gerçekleştirin. Floresan probu ışıktan korumak için tankın üzerini folyoyla kapalı tutun. Bir saat sonra, jeli taramak için floresan jel tarayıcı kullanın.

Sağlam veya azi etiketli olmayan virüslerin, HA etiketlemesi için önemli miktarda floresan etiketlemeyi yerinden etmemesi gerektiğini unutmayın; yüksek konsantrasyonlu HA ile üretilen virüsler, daha yüksek derecede HA inklüzyonu nedeniyle daha güçlü floresan etiketleme gösterir. Ayrıca, şeker etiketli virüsün azi etiketlerini yalnızca fiber kapsid proteininde eksprese ettiğine dikkat edin. %80 konfluensten başlayarak; azi etiketlemede enfeksiyon için iki gün, etiketli virüsün hasadı ve saflaştırılması için beş saat, klik reaksiyonu için bir gece ve SDS PAGE analizi için iki saat olmak üzere toplam üç buçuk gün hesaplanmıştır. Özetle, iki tip azi etiketleme yöntemi ve iki azid-alkin klik kimyası reaksiyonu gösterilmiştir.

Başvurunuz ve kaynaklarınız, amacınıza hangi yöntemin veya yöntemlerin en uygun olduğunu belirlemelidir. Bu protokoldeki tüm malzemeler ticari olarak temin edilebilse de, HA asetoz şekerlerinin ve INE problarının sentezlenmesinin önemli ölçüde daha maliyet etkin olduğunu ve virüs yüzey modifikasyonlarında daha fazla esneklik sağladığını tespit ettik.