Name: Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Öğrenin adenovirüs yüzeylerini biyoortogonal tıklama kimyası ile modifiye etme yöntemini. Azid grupları eklenerek viral vektörlerin hedefe yönelik gen tedavisi uygulamaları için optimize edilmesi sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz finansman (CBET-0.846.259) için NSF kabul etmek istiyorum.

Bu protokol başvurulan tüm medya, tamponlar ve çözümler hazırlanması için Tablo 1&#39;e bakınız. 1. Aha-Etiketli Adenovirüs Üretimi <ol><li> Onlar 80 gelinceye kadar 37 ° C&#39;de HEK 293 hücre büyüme ortamında tutulan insan embriyonik böbrek hücre onbir 100 mm doku kültürü yemekleri (HEK 293) (bkz. Tablo 1) hazırlayın -% 90 konfluense. (Not:.% 90 üzerinde konfluense ile Kültürler bulaştırmak ve istediğiniz gibi virüsler üretmek olmayabilir zor olabilir) </li><li> İlk sonra tripsin-EDTA (1 ×) 1 ml bir dakika süreyle kuluçkaya hücreleri, TD tampon 5 ml ile bir kez durulama, büyüme medyumu kaldırarak tabaklar birinde hücreleri gevşetmek. </li><li> HEK 293 hücre büyümesi orta 9 ml ekleyin ve bu yemeğin gelen hasat HEK 293 hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın. Bir multiplicit kullanarak enfeksiyonu için gerekli adenovirus tip 5 (Ad5) miktarını hesaplamak için bu numarayı kullanın10 PFU / hücre enfeksiyon y (İçişleri Bakanlığı) değeri. Normal Ad5 için, enfektivite endeksi (partiküllerin sayısı ile bulaşıcı parçacıklar oranında) tipik olarak 1:20 olması için hesap. </li><li> Enfeksiyonuna tampon 10 ml hazırlayın. </li><li> Yavaşça TD tamponu, 5 ml ile yıkama, daha sonra kalan on kültür kaplarından HEK 293 hücre büyümesini orta kaldırın. 1 saat için 37 ° C&#39;de her çanağı ve inkübe enfeksiyon tampon 1 ml ekleyin. Bu enfeksiyon dönemde, yavaşça 15 dakika aralıklarla tarafına her kültürün çanak tarafında sallayın. </li><li> Enfeksiyondan sonra, 18 saat süreyle 37 ° C&#39;de taze HEK 293 hücre büyümesi, orta ve inkübe 9 ml ilave edilir. </li><li> Aha etiketleme ortamı (veya denetimi için kontrol orta Met), 100 ml hazırlayın. Etiketleme medya hazırlamadan önce bir 0.2-um steril enjektör filtre ile yoğun stok solüsyonlar filtre emin olun. </li><li> Dikkatlice (böylece bulaşmış hücrelerin yıkayacak değil) 18 saat sonra bir HEK 293 hücre büyümesi orta kaldırmaknd TD tampon 5 ml her kültürün çanak yıkayın. </li><li> TD tampon yıkama solüsyonu çıkarın ve her kültürün çanak Aha etiketleme orta 10 ml ekleyin. Bir kontrol için, metionin kontrolü orta bu aşamada yerine Aha etiketlenmesi ortamının kullanılması gerekir. </li><li> 6 saat boyunca 37 ° C&#39;da medium etiketlemede enfekte olmuş hücreler inkübe. Etiketleme 12 arasındaki herhangi bir zamanda yapılabilir - 24 saat post-enfeksiyonu, ancak süresi 6 saat daha uzun olmamalıdır. Sağlanması enfektivite önemli ölçüde azalarak değilken bu aralık viral yapısal protein çeviri ile örtüşen maksimize etmek için tespit edilmiştir. 7 </li><li> Dikkatle etiketleme orta kaldırmak böylece hücreleri bozmak için değil. Her bir çanak taze HEK 293 hücre büyümesi orta 10 ml ilave edilir ve bir başka 18 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edilir hücreleri. Bu basamak sırasında enfekte olmuş hücreler kaybı minimize etmek için, bunun tamamıyla etiketleme çözeltisi kaldırmak için gerekli değildir. HEK 293 hücre büyüme ortamı M aşırı miktarda içerirve hangi herhangi bir kalıntı Aha outcompete olacaktır. </li><li> Saflaştırma için 3. adıma geçin. </li></ol> 2. Azido-Şeker-Etiketli Adenovirüs Üretimi <ol><li> Kadar ve adım dahil olmak üzere 1.5 Aha-Etiketli Adenovirüs üretimi başlıklı prosedürü takip edin. </li><li> Azido-şeker etiketleme orta 100 ml hazırlayın. </li><li> 44 saat boyunca 37 ° C&#39;de taze Azido-etiketleme şeker, orta ve inkübe 10 ml ile hücreleri kapsar. </li></ol> 3. Azid-Etiketli adenoviral Parçacıklarının Arıtma <ol><li> Her kültürün çanak ve konik tüpler için transfer enfekte hücre ile birlikte medya çıkarın. 4 azından 10 dakika süreyle 2000 g&#39;de santrifüje ° C. Süpernatantı ve TD tampon pelet (10 yemekleri başına TD tampon 8 ml kullanarak) tekrar süspansiyon. </li><li> Sıvı nitrojen ve bir 37 ° C arasında bir su banyosunda Dewar şişeye kullanılarak tekrarlandı (3 ya da daha fazla) dondurma-eritme çevrimi ile enfekte olmuş hücreler Lyse. 10 dk için 2000 g&#39;de santrifüje4 ° C&#39;de süpernatan gelen hücre enkazları ayırmak. </li><li> Önce bir Ultra temizle santrifüj tüpüne 1.25 g / ml CsCl 2.5 ml çözelti pipet ile bir CsCl yoğunluk gradyanı santrifüj tüpüne hazırlayın. Sonra, yavaş gradyanı arayüz rahatsız özen, 1.4 g / ml solüsyon CsCl 2.0 ml eklemek için tüpün altında konumlandırılmış olan ucu ile bir pipetle kullanımı. </li><li> CsCl yoğunluk gradiyenti tüpün üstüne adımı 3.2 süpernatan Pipeti ve tüp doldurmak için gerekli eklentiyi TD tampon durumunda. 15 de 1 saat süre ile 125,000 g azından bir sallanan bir kova rotor ° C bir ultrasantrifüjdeki in örnekleri santrifüjlenir. </li><li> Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra, virüs partiküllerinin, iki CsCl çözeltilerinin arayüzüne bir kalın beyaz bir bant olarak görülmelidir. Çözeltisi damla damla akmasını sağlamak için steril bir iğne ile borunun alt kısmında küçük bir delikli edin. </li><li> Kalınlığında beyaz bant toplayın, hangi dolaşıyor, etiketli Ad5 parçacıklar içermelidirg bakım aşırı CsCl çözümü dışlamak için. Virüs katman üzerinde açılımının teşvik edecek hücresel proteinlerin toplama kaçının. Ayrıca biraz kalın beyaz virüs bant üzerinde hafif bir tabaka oluşturur boş virion capsids değildir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, etiketlenmiş Ad5 partiküllerin üzerindeki bir nihai saflaştırma gerçekleştirmek. Adım 3,6 bir 4-ml ultrasantrifüjdeki tüpüne toplanan fraksiyonu ekleyin ve 1.35 g / ml CsCl çözeltisi ile tüp doldurun. 15 ° C&#39;de 18 saat süreyle 125,000 g&#39;de santrifüje ve adımları 3.5 ve 3.6 &#39;da anlatıldığı gibi, borunun ortasında oluşturan kalın beyaz bir bant toplamak. (Viral titrenin düşükse, beyaz bir bant ikinci santrifüjlemeden sonra görünür olmayabilir, ve etiketli virüs kurtarmak için mümkün olmayacaktır dikkat ediniz). </li><li> Uzun süreler boyunca virüs partiküllerinin depolanması için, toplanan virüsü ekstresinin diyaliz tamponu virüsü depolama karşı gerçekleştirilmelidir. -80 ° C&#39;de diyalizlenmiş virüs numunelerinin Mağaza </li></ol> 4. LiGerilme-Promoted Azid-Alkinler Siklokatılma kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıkların kolayca dolaşmak (SPAAC) <ol><li> Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 50 ul&#39;lik bir çözeltisine, SPAAC etiketleme çözeltinin 0.25 ul ekleyin. (Ticari olarak mevcut gergin alkinlerin venders listesi için reaktiflerin tabloya bakın). </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında devam etmek için gerginlik-terfi Siklokatılma tepki verin. Işığa duyarlı bir sonda (örn. TAMRA) kullanılması durumunda, alüminyum folyo ile tepkime kabına kapsamaktadır. </li><li> 6. adıma göre etiketli virüs arındırın. </li></ol> 5.. Deoksijenize Atmosferde Bakır (I)-Katalizli Azid-Alkinler Siklokatılma (CuAAC) kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıklarının Ligasyonu <ol><li> Bakır yerine 7,2 mg (I), bir Eppendorf tüpüne bromür (CuBr) toz, alüminyum folyo ile kaplanmıştır. </li><li> Ikinci bir Eppendorf tüpüne DMSO pipetle 1 ml. </li><li> HazırlamakÜçüncü bir Eppendorf tüpüne CuAAC etiketleme solüsyonu 50 ul. Alkin prob ışığa duyarlı ise alüminyum folyo ile sarın (örneğin TAMRA-Alkinler). </li><li> 6 saat boyunca bir deoxygenated eldiven çanta içinde üç Eppendorf tüpleri, kapağını açıp, yerleştirin. Tüm numuneler CuAAC reaksiyon tamamlanıncaya kadar eldiven çanta içinde kalmalıdır. </li><li> 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiş, her ikisi de, CuBr tozunun 7.2 mg DMSO 1 ml ilave edilerek CuBr bir 50 × stok çözeltisi hazırlayın. </li><li> 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiştir CuAAC etiketleme çözeltisi, 50 ul Bu CuBr stok solüsyonu 1 ul pipet ile CuAAC reaksiyona girerler. Eldiven çanta içinde 12 saat devam etmek için tepki verin. </li><li> 6. adıma göre etiketli virüs arındırın. </li></ol> 6. Etiketli Virüs Parçacıkların Arıtma ve Depolama <ol><li> Centri-Eyl jel filtrasyon Spin kullanarak c etiketli virüs numunelerinin arındırınüreticinin yönergelerine Virüs Depolama Buffer ile dengelenmiş olumns. </li><li> Alternatif olarak, saflaştırma Virüs Depolama tampona karşı diyaliz ile gerçekleştirilebilir. </li><li> Etiketli virüs partiküllerinin -80 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> 7. Etiketli Adenovirüs ve Floresanlar Jel Tarama SDS-PAGE <ol><li> 10 dakika süre ile etiketlenmiş virüsü ve kaynamaya saflaştırılmış 20 ul 20 ul Laemmli numune tamponu (2 x) eklenir. Çökeltileri herhangi bir çözünmeyen kaldırmak için 30 saniye için örnekleri santrifüjleyin. Kalan bakır arıtma sonrası varsa, örnek kaynatarak görselleştirme sırasında zorluk, SDS-PAGE jel protein kalın çizgiler neden olabilir. Bu durumda, bu basamakta örneğin kaynama gelmemektedir. </li><li> Elektroforez hücre jel kaset takın ve çalışan tampon ekleyin. Viral protein örnekleri ile kuyu gerekli sayıda yükleyin. Iyi öncesi stai yüklemek için birini kullanınned molekül ağırlığı işaretleri. 200, 1 saat boyunca jel çalıştırın V. süresi boyunca alüminyum folyo kaplı elektroforez hücre fluorofor etiketin photobleaching azaltmak için tutun. </li><li> En iyi çözünürlük ve tüm özgür fluorofor kaldırmak için, izleme boya elektroforez sırasında jel dışında çalışmasına izin verin. Elektroforez durdurun ve hızlı bir floresan jel tarayıcıya jel aktarmak ve uygun dalga boyu (TAMRA için 574 nm) floresans emisyon için jel tarayın. </li><li> Her bir partikül viral konjuge boya moleküllerin sayısı çeşitli standart TAMRA konsantrasyonlarının ölçülmesi ve floresans adım 7.3 örnek ile karşılaştırılarak ölçülebilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar SDS-PAGE ve TAMRA-konjuge Ad5 floresan jel tarama gözlemlenen Sonuçlar Şekil 3 içerisinde gösterilmiştir. Bu fluoresan jel taramaları örnekleri modifiye yapıldı rağmenprobları ile SPAAC ligate edilir olduğunda CuAAC yoluyla tanımladı, sonuç olarak benzer olması gerekir. Bu jel taramaları gösteriyor ki üç Ad5 kapsid proteinleri (Hexon, Penton ve Fiber) modifikasyonu ile Aha etiketleme sonuçları, şeker etiketleme sadece Fiber kapsid proteini değiştirir iken. Dahası, konsantrasyon Aha bir artış (4 mM vs 32 mM) Aha esas daha büyük bir ölçüde neden olan, fakat aynı zamanda enfektivite azaltmak için gösterilmiştir. Önce sonuçları 7 4mm üretilen Ad5 için Aha, maruz metiyonin sitelerin yaklaşık% 5 32 mM Aha kullanıldığında bu sayı% 10 artış ile, TAMRA-değiştirilmiş olduğunu göstermektedir. Bu sırasıyla yaklaşık 280 ve 510, Ad5 parçacık başına boya etiketli siteler karşılık gelir. Şeker-etiketleme 1 analizi kabaca 22 Ad5 üzerinde 36 glikozilasyon sitelerin bir azido şeker tarafından işgal ve daha sonra TAMRA etiketli belirtti. Tarif edildiği gibi on doku kültür plakaları azit-değiştirilmiş Ad5 üretmek için kullanıldığı takdirde<html> Bu protokolde, 200 - azit-değiştirilmiş virüsünün 300 ul yaklaşık 1.5 bir titresi x 10 12 parçacıklar / ml, 3.6 adım toplanan beyaz bir bant elde edilmelidir. Bu yöntemin yaygın bir zorluk düşük viral titre atfedilebilir bu arıtma adımı, bir viral grubun olmamasıdır. Enfeksiyondan sonra plakadan gevşetilmiş olur - ki - adım 1 sırasında yıkarken Bu genellikle aşırı ya da altında birleşmiş, ya da hücreleri yıkayarak olan hücrelerini enfekte bir sonucudur. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Protokol genel bakış. Azid içeren Aha veya GalNAz ilk adenovirüs partikülleri içine dahil edilmiştir. Bir floresan alkin prob ile ligasyon sonra &quot;klik&quot; kimyası ile yapılır. Son olarak, SDS-PAGE flüoresan prob ligasyonu göstermek için kullanılır. igure 2 &quot;/&gt; Şekil 2,. Üzerine alkin prob Ligation azit-değiştirilmiş de-oksijenli altında (a) SPAAC, (b) CuAAC ve (c) oksijenli bir atmosfer üzeri virüsü. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. TAMRA-Alkinler ile CuAAC konjugasyon sonra azid etiketli adenovirus tip 5 (Ad5) SDS-PAGE Floresan tarar. (A) Aha iki farklı konsantrasyonu kullanılarak, Ad5 Aha-etiketli. Etiketleme artan Aha konsantrasyonu ile artan etiketleme derecesi ile, adenovirüs Hexon, Penton ve Fiber kapsid proteinleri meydana görünüyor. (B) Ac 4 GalNAz-etiketli adenovirüs sadece Fiber kapsid protein etiketli gibi görünüyor. <table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Hazırlık </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Ad5 depolama tamponu </td><td> 5 mM Tris-HCl tampon (pH 8.0) ihtiva eden 0.5 mM MgCl2, 50 mM NaCl,% 25 (v / v) gliserol, ve% 0.05 (a / h) Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda </td></tr><tr><td> Ad5 enfeksiyonu tampon </td><td> 2% (v / v) sığır serumu, 1 × TC çözeltisi, Ad5 depolama tampon içinde (MOI bir 10 PFU / hücre ve 01:20 bir enfektivite indeksi kullanılarak belirlenir hacmi). TD tamponu kullanılarak nihai hacme çözüm getirmek </td><td> Ad5 konsantrasyon UV absorpsiyon yoluyla belirlenebilir. </td></tr><tr><td> TC çözüm (200 ×) </td><td> 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> TD tampon </td><td> 137 mM NaCl, 5 mM KCI, mM Na 2 HPO 4, ve 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 0.07 </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> HEK 293 hücre büyüme ortamı </td><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10% (v / v) sığır serumu (BSC) ve 1% (v / v) Pen Strep ile desteklenmiş </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> Cys stok solüsyonu (100 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 200 mM L-sistein ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Aha stok solüsyonu (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 100 mM L-Azidohomoalanine ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Aha etiketleme orta </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 2 mM L-sistein% 10 MKC, Aha stok solüsyonu (1 x) ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce taze hazırlayın. Bu, bir 4 mM c tekabülAHA oncentration, farklı konsantrasyonlarda (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) kullanılmakla beraber. </td></tr><tr><td> Met stok solüsyonu (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) L-Metionin 100 mM ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Met kontrolü orta </td><td> DMEM (-Met /-Cys) stok solüsyonu (1 x), Met,% 10 MKC ile desteklenmiş 2 mM L-sistein </td><td> Kullanmadan önce taze hazırlayın. </td></tr><tr><td> Ac 4 GalNAz stok solüsyonu (1.000 ×) </td><td> Metanol içinde 50 mM N-peracetylated azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> 4 ° C&#39;de depolamak Ac 4 GalNAz GlcNAz bir metabolik öncüsüdür. </td></tr><tr><td> Azido-şeker etiketleme orta </td><td> 100 ul Ac 4 GalNAz stok çözeltisi, 100 ml HEK 293 hücre büyüme ortamı </td><td> Metanol HEK 293 hücre büyümesi orta eklemeden önce buharlaşmasına izin verin. </td></tr><tr><td> Sezyum klorür çözümler </td><td> CsCl TD tampon içinde çözülmüş: 1.25 g / ml (18.08 g / 50 ml H2O) 1.35 g / ml (25.60 g / 50 ml H2O) 1.40 g / ml (31.00 g / 50 ml H2O) </td><td> Ultrasantrifüj için Yoğunluk gradyanlar </td></tr><tr><td> Virüs depolama tamponu </td><td> Fosfat CaCl2, 0.9 mM MgCl2 ve% 10 (v / v) gliserol ihtiva eden 0.5 mM, tuzlu su (PBS), pH 7.2 tampon </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) etiketleme çözümü </td><td> DMSO içinde TAMRA-BCN: <ol><li> UV ab kullanınAdım 4.1 virüsü çözeltisi titresi belirlemek için sorbance (OD 260 Assay) </li><li> 50 ul alikotu viral partiküllerin sayısı (N Ad5) belirlemek </li><li> TAMRA-BCN molarite (M) kullanılarak belirlenir: c BCN = 4 × 10 × 8 (N Ad5 / N Avo) N Avo = 6.022 × 10 23 (Aşama 4 hazırlanan tepkime karışımı virion başına 100 alkin probları içerir, böylece) </li></ol></td><td> Gerilme-terfi alkin prob SDS-PAGE ile, yaklaşık 10 12 parçacıklar / ml &#39;lik bir viral titrenin önerilmiştir için </td></tr><tr><td> TAMRA-Alkinler (CuAAC) etiketleme çözümü </td><td> Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 (N Ad5 yukarıdaki gibi belirlenmiştir) 50 ul, 1.5 mM Batho<html> fenantrolin disülfonat (yani 1.5 × son CuBr konsantrasyon), TAMRA-Alkinler. TAMRA-Alkinler molarite (M) kullanılarak belirlenmektedir: c Alk = 2 × 10 × 6 (N Ad5 / N Avo) (5. Basamak hazırlanan tepkime karışımı virion başına 100 alkin probları içerir, böylece) </td><td> Tris tampon bakır, rekabetçi bir önleyici ve ligand olarak da bilinir. 8 </td></tr><tr><td> Laemmli numune tamponu (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6.8),% 4 (w / v) SDS, 20% (v / v) gliserol,% 10 (v / v) 2-merkaptoetanol, ve% 0.004 (w / v) Bromofenol mavi </td><td></td></tr><tr><td> Tampon Koşu </td><td> 187 mM glisin, 19 mM Tris-HCl, H2O, 3,5 mM SDS </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tablo 1. Bu protokol gerektirdiği tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması.

<ol><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+%22Clickable%22+Amino+Acids+and+Sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors%3A+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li>
<li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li>
<li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+%28Ad%29+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li>
<li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Strain-Promoted+%5B3+%2B+2%5D+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Azidler olanlar dahil Kemoselektif ve bioorthogonal tıklayın reaksiyonlar, gelişimi bir araştırma hızla gelişen bir alandır ve sonradan bioconjugation uygulamalar için seçim için bu reaksiyonlar giderek artan sayıda vardır. Biz kendi laboratuar ve tüm reaktifler ticari durumu çünkü onların kullanışlılığı seçildi yalnızca iki yöntem eklemek için bu protokol kapsamında sınırlama getirdik. Bu tür ilk rotada - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) - alkin bir cyclooctyne halkası (...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Bir GFP transgen içeren Adenovirüs tip 5 (Ad5) </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> İnsan embriyonik böbrek (HEK 293) hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Eagle Orta (DMEM), Yüksek Glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Eagle Orta, hiçbir Metionin, hiçbir Sistein (DMEM-Met /-Cys), Yüksek Glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Sığır Buzağı Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penisilin - Streptomisin 100 × Çözüm (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> % 0.5 Tripsin-EDTA (10 x) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm Hücre Kültürü Bulaşık, doku kültürü ile tedavi edilen polistiren </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Hücre kültürü CO2 inkübatör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemositometre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biyogüvenlik kabini </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Steril şırınga filtresi (0.2 um, selüloz asetat) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Avrupa) </td></tr><tr><td> Avanti JE santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Konik tüpler (50 ml, steril) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tüp, Thinwall, Ultra Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Bir GB 41 GB ve 60 r ile donatılmış ultrasantrifüjdekiOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-Lock Tüpler, 1.5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> 5418 Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Eyl jel filtrasyon sıkma sütunlar </td><td> Princeton Ayrımları </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Steril iğne, 18 gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azot eldiven çanta (deoxygenated CuAAC yapılacak ise) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar şişesi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıvı azot </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektroforez hücre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Floresan jel tarayıcı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hazır Jel Tris-HCl Jel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disülfonik asit (BDA) disodyum tuzu </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris baz (tris (hidroksimetil) aminometan) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disodyum Fosfat (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat (PBS) tamponlu </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-sistein </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metiyonin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (sodyum dodesil sülfat) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glisin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sezyum Klorür (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Bakır (I) bromit (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Klorür (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum Klorür (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Klorür (NaCI) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> CuAAC * için alkin prob </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Alkinler </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> SPAAC * için gergin alkin prob </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO Alkinler </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> Click kimyası reaktifler ve kitler * Önemli satıcıları Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Araştırma, Kimya Araçlar &#39;ı ve Baseclick içerir. Alkin boyalar ve ligandları çeşitli bu üreticilerinin katalogları bulunabilir.

bioorthogonal tıklayın kimya ile viral yüzeylerin kemoselektif modifikasyonu

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Virüs partiküllerinin modifikasyonu gen tedavisi, onkolitik uygulamaları ve aşı geliştirme etkileyen yönelik muazzam bir potansiyele dikkat önemli bir miktar aldı. Çoğunlukla genetik tabanlı olduğu viral yüzeyler, değiştirmek amacıyla 1,2,3 Şu yaklaşımlar genellikle zayıflama muzdarip virüs üretim, enfektivite ve hücresel iletimi. 4,5 Kemoselektif click kimyası kullanarak, son derece esnek ve erişilebilir hem de kalan süre bu konularda sidesteps basit bir alternatif yaklaşım geliştirdik. 1,2 Bu protokolün amacı adenovirüs tip 5 parçacıkların yüzey değiştirme bioorthogonal tıklama kimyası ile etkinliğini göstermektir. Bu proteinler üzerine hedef moleküllerin, boyalar veya ilgi diğer moleküllerin Kemoselektif ligasyonu sağlayan bu iki adımlı süreç hem terapötik 1 veya analitik, 2,6 kullanılabilirazid etiketleri ile önceden etiketli. Bu yöntemin üç büyük avantajları (1) metabolik etiketleme viral spor üzerinde hiçbir etkisi, 1,7 az gösteriyor ki vardır (2) efektör ligandlar geniş bir yelpazede kullanılabilir, ve (3) oldukça hızlı, güvenilir ve kolay erişim. 1,2,7 Bu işlemin ilk adımda, adenovirüs partikülleri işlevsel bir azid (N-3) içermesi, her ikisi de azidohomoalanine (Aha, bir metiyonin vekil) veya doğal olmayan bir şeker O-bağlı N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ya taşıyan üretilir grubu. Azid-modifiye edilmiş virüs partiküllerinin saflaştırıldıktan sonra, flüoresan TAMRA parçasını içeren bir prob alkin önceden etiketlenmiş proteinleri veya glikoproteinleri bir Kemoselektif şekilde ligate edilir. Son olarak, bir SDS-PAGE ile analiz viral proteinlerin kapsid üzerine prob başarılı ligasyonu göstermek için gerçekleştirilir. Aha dahil tüm viral kapsid etiketlemek için gösterilirproteinleri (Hexon, Penton ve Fiber), sadece Fiber etiketlenmesi O-GlcNAz birleştirmeyecektir ederken. Bu gelişen alanında, azid-alkin ligasyonu için birden çok yöntem başarıyla geliştirilmiştir, ancak biz en uygun olduğu tespit sadece iki tanesini burada gösterilmiştir - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) ve bakır-katalize azid-alkin Siklokatılma (CuAAC) deoxygenated atmosferi altında.

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için tasarlanmıştır<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Her bir azid grubu chemoselectively viral yüzey değiştirme aracı olarak &quot;ı&quot; kimyası reaksiyon yoluyla ligate edilir.

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Virüs partiküllerinin modifikasyonu, gen tedavisi, onkolitik... üzerinde etkili olma konusundaki muazzam potansiyeli nedeniyle önemli düzeyde ilgi görmüştür.

Bu prosedürün genel amacı, tıklama kimyası (click chemistry) yoluyla viral yüzeylerin yeniden mühendislenmesine yönelik esnek bir yöntemi göstermektir. Bu prosedürün ilk adımında, insan embriyonik böbrek hücreleri tip beş adenovirüs ile enfekte edilir ve ya doğal olmayan amino asit olan homo alanin ya da aseto şeker parasiti N-asetoasetil glukozamin varlığında inkübe edilir. İki gün sonra, azid işaretli adenovirüs partikülleri toplanır ve saflaştırılır.Ardından, floresan probları bu partiküllerin yüzeyine bağlamak için kemoselektif azot-alkin sikloekleme işlemi kullanılır. Yazılı protokolde açıklandığı üzere, bu işlem iki olası bağlama yönteminden biri kullanılarak gerçekleştirilir: gerinim destekli veya bakır katalizli azot-alkin sikloekleme.Terapötik uygulamalarda bu bağlantılar polipeptit polimerlerini veya küçük molekülleri içerebilir. Bu deneyde, probun kapsid proteinlerine bağlanması SDS-PAGE aracılığıyla gösterilebilmesi için floresan bir prob kullanılmıştır. Özellikle terapötikler, gen aktarımı, onkotik tedavi ve aşı teknolojisi bağlamında, virüslerin gen aktarım ajanları olarak geliştirilmesine yönelik önemli bir ilgi vardır.Bu bağlamda, virüs-konak etkileşimini optimize e

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Biz sıralı on-chip bioorthogonal Siklokatılma kimya ve antikor-antijen yakalama kullanarak, küçük moleküllerin hızlı, geri dönüşümlü immobilizasyon ve Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları için işlevselleştirilen nanoparçacık meclisleri için bir yöntem mevcut.

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Burada, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek ve ardından azidi, suş destekli azid-alkin siklo ilavesi (SPAAC) ile kimyasal bir prob ile birleştirerek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmak için bir protokol sunuyoruz.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Burada, fluorescently Qβ VIP üzerinde disulfides dibromomaleimide ile functionalize için bir yordam mevcut. Biz Qβ ifade ve arıtma, molekülleri dibromomaleimide functionalized sentezi ve dibromomaleimide ve Qβ arasında konjugasyon tepki açıklanmaktadır. Elde edilen Sarı floresan konjuge parçacık bir floresan sonda hücrelere olarak kullanılabilir.

Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

Burada açıklanan protokol araştırmacılar özellikle adenovirus capsids seçilen siteler tarafından basit Kimya değiştirmek sağlar. Korumalı adenovirus parçacıklar vektörler ve yeniden hedeflenen gen transferi vektörel çizimler oluşturulacak ve vektör ana etkileşimler okudu.

Genetik ve kimyasal kapsid değişiklikler Adenovirus tabanlı gen transferi vektörlerin koruyucu ve hedefleme için kombine

Modüler kafesli bileşiklerin tıklanabilir moieties ile fotokimyasal özelliklerinin sentezi ve ölçümü için bir protokol sunulmuştur.

Tıklanabilir Kafesli Bileşiklerin Tasarımı, Sentezi ve Fotokimyasal Özellikleri

Yağ asilasyonunun incelenmesinin hücresel protein etkileşimleri ve hastalıklarda önemli etkileri vardır. Burada sunulan, çeşitli hücre tiplerinde uygulanabilen ve nabız kovalama ve kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere diğer tahlillerle birleştirilebilen yağlı asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitini geliştirmek için modifiye edilmiş bir protokoldür.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Burada, rutin mikroskopi ekipmanı kullanarak hücre içi sialillenmiş N-glikoproteinlerin biyogörüntülemesine izin veren metabolik oligosakkarit mühendisliği, tıklama kimyası ve genleşme mikroskobunu birleştiren basit bir protokol öneriyoruz.

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Öğrenin adenovirüs yüzeylerini biyoortogonal tıklama kimyası ile modifiye etme yöntemini. Azid grupları eklenerek viral vektörlerin hedefe yönelik gen tedavisi uygulamaları için optimize edilmesi sağlanır.

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Daha fazla video keşfet