Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteomik tarafından keşfedilen çok sayıda yeni biyobelirteçleri verimli bir şekilde analiz etmek için yüksek verimli sıralı Eliza kullanmaktır. Bu, ilk olarak, her bir biyobelirteç için seyreltme oluşturmak ve testler arasında geri kazanılan plazmayı depolamak için kullanılan bir kaynak plakaya numuneler eklenerek elde edilir. Daha sonra, hasta örneklerindeki konsantrasyonlarını belirlemek için her protein için Eliza'lar çalıştırılır.

Sonuç olarak, akut graft versus host hastalığının klinik belirtilerinin başlangıcında bu biyobelirteçlerin protein seviyelerinin yükselmesi değerlendirilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre ana avantajı, sıralı analizörlerin, çoğullama platformlarında her zaman mevcut olmayan birden fazla yeni proteini analiz edebilmesidir. Bu tekniğin sonuçları, akut graft versus host hastalığının teşhisine kadar uzanır.

Bu yöntemle doğrulanan biyobelirteçler şu anda klinik bakım için araştırılmaktadır. Bu yöntem, travma sonrası şiirsel kök hücre naklindeki komplikasyonlar hakkında fikir verebilir. Ayrıca akciğer nakli, komplikasyonlar, akciğer kanseri veya potansiyel olarak tanısal bir kan testinin yararlı olacağı herhangi bir hastalık gibi diğer hastalıklar için biyobelirteç keşfi ve validasyonu için de uygulanabilir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü tekrarlanabilirliği ve düşük parti değişkenliğini sağlamak için çoklu adımların tutarlı bir şekilde yapılması önemlidir Deneyden bir gün önce, alttaki pıhtıları ve üstteki lipitleri plazmadan ayırmak için düşünülen plazma alikot örneklerini 15, 300 RCF ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca döndürün. Daha sonra, her numuneden 150 mikrolitre seyreltilmemiş plazmayı, önceden tanımlanmış haritalara göre manuel pipetleme ile 96 kuyulu V alt plakaya plakalayın. Plakayı Paraform'a sarın ve 72 saate kadar dört santigrat derecede bir insan odasına yerleştirin.

Daha sonra, IL iki reseptör alfa ve insan büyüme faktörü veya HGF yakalama antikorları, üreticinin spesifikasyon plakasına göre yeniden oluşturulduktan ve seyreltildikten sonra, her bir antikorun 50 mikrolitre alikotunu, ilgili 96 kuyulu yüksek bağlayıcı yarım kuyucuk plakasının her bir oyuğuna yerleştirin. Daha sonra bu plakaları bir plaka kapatıcı ile kapatın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, reg üç alfa'yı üreticinin protokolüne göre üreticinin kaplama tamponu ile seyreltin ve 25 mikrolitre çözeltiyi 3 84 kuyulu bir maxor plakasının her bir oyuğuna plakalayın.

Daha sonra bu plakayı deneyin ilk gününde de dört santigrat derecede kapalı olarak saklayın. IL iki reseptör alfa test plakasını yıkayarak ve TBS'de blotto ile bloke ederek başlayın. Standardı yeniden oluşturduktan sonra, üreticinin protokolüne göre sekiz noktalı bir standart eğri oluşturun.

Sonraki plaka, 50 mikrolitre seyreltilmemiş plazma ve her standarttan 50 mikrolitre çift olarak kaynak plakadan ELIZA test plakasına. Daha sonra kapalı plakayı oda sıcaklığında 300 RPM'ye ayarlanmış bir plaka döndürücü üzerinde inkübe edin. İki saat sonra, plazmayı IL iki reseptör alfa ELIZA test plakasından geri alın ve seyreltilmemiş plazma kaynak plakasına geri yerleştirin.

Daha sonra, üreticinin protokolüne göre ÇED'i tamamladıktan sonra, zengin üç alfa Eliza için 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun optik yoğunluğunu okuyun, önce 10 mikrolitre seyreltilmemiş plazmayı ayrı bir görünüm alt kaynak plakasına aktarın ve ardından bir ila 10 seyreltme kaynak plakası oluşturmak için her bir oyuğa üretici tarafından sağlanan seyreltme tamponundan 90 mikrolitre ekleyin. Reg üç alfa Eliza'yı tamamladıktan sonra, üreticinin protokolüne göre, durdurma çözeltisini 384 kuyulu plakaya ekleyin ve 450 ila 620 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu okuyun. Fil ve tn FFR'nin yeniden yapılandırılması ve seyreltilmesinden sonra, üretici spesifikasyonlarına göre bir yakalama antikoru, ilgili 96 kuyulu yüksek bağlayıcı yarım kuyulu plakanın her bir oyuğunu, 50 mikrolitre yakalama antikoru ile kodlayın.

Daha sonra, kapalı test plakalarını gece boyunca fil plakası için oda sıcaklığında ve TN FFR bir plaka için dört santigrat derecede inkübe edin. IL iki reseptör alfa Eliza'yı tamamladıktan sonra, 60 mikrolitre seyreltilmemiş plazmayı yeni bir kaynak plakasına aktarın. Daha sonra, bir ila iki seyreltilmiş plazma kaynak plakası yapmak için her bir kuyucuğa PBS'de% 1 BSA'nın 60 mikrolitresinde.

Daha sonra HGF test plakasını TBS'de BLOTTO ile yıkayın ve bloke edin ve ardından sekiz noktalı standart eğri seyreltmesini ayarlayın. Plakayı yıkadıktan sonra, 50 mikrolitre bloke edici adım plakasını takiben, bir ila iki seyreltilmiş plazmanın ve EISA test plakasındaki her standardın alikotlarını çoğaltın. Daha sonra, kapalı plakayı gece boyunca oda sıcaklığında, 300 RPM ayarlı bir plaka döndürücü üzerinde inkübe edin.

Ertesi sabah, bir ila iki seyreltilmiş plazmayı HGF Eliza test plakasından geri alın ve bir ila iki seyreltilmiş plazma kaynak plakasına geri yerleştirin. ÇED'i tamamladıktan sonra, üreticinin protokolüne göre, deneyin ikinci gününde 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu okuyun. Önce 10 mikrolitre seyreltilmemiş plazmayı yeni bir kaynak plakasına aktarın ve ardından 200 mikrolitre bir ila 20 seyreltilmiş plazma yapmak için PBS'de 190 mikrolitre% 1 BSA'yı aktarın.

Daha sonra fili tamamladıktan sonra Eliza, üreticinin protokolüne göre, 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu okudu. TN FFR için Eliza önce bir ila 20 kaynak plakasına 25 mikrolitre %1 BSA ve PBS ekleyerek kuyucuk başına 125 mikrolitre bir ila 25 seyreltilmiş plazma elde eder. Daha sonra, üreticinin protokolüne göre TN FFR bir ÇED'yi tamamladıktan sonra, I-L-H-E-I-A ilk transferi için 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu okuyun, 60 mikrolitre bir ila iki seyreltilmiş plazma yeni bir kaynak plakasına ve ardından bir ila altı seyreltilmiş plazma kaynak plakası yapmak için her kuyucuğa 180 mikrolitre IL sekiz seyreltici ekleyin.

Ardından, üreticinin protokolüne göre ILH Eliza'yı tamamladıktan sonra, 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu okuyun. Son olarak, tüm Eliza tamamlandıktan sonra, kullanılmayan konuşma plazmasını düşünce Eloqua'ya yerleştirin ve ileride kullanmak üzere dondurun. Bu grafikte, ilk reg üç alfa gastrointestinal grefte karşı konak hastalığı biyobelirteç raporu için test edilen 1084 hastaya karşılık gelen üç alfa konsantrasyonunu ölçen yedi farklı ELIZA plakasının standart eğrisi için optik yoğunluklar gösterilmiştir, plakalar arasında tutarlı optik yoğunluklar gösterilir, deneyler arasında tutarlı protein konsantrasyonu ölçümleri sağlar.

Plazma numunelerindeki proteinlerin konsantrasyonları, numune optik yoğunlukları ile standart eğri optik yoğunlukları karşılaştırılarak hesaplandı. Robotik olarak temiz bir taşıma platformu, tekrarlanabilirliği daha da artırmak için kullanılabilir ve aynı zamanda Eliza ve yaratıcı form kuyusu plakaları tarafından kullanılan plazma hacmini azaltır. Bu prosedürü planlarken, önce seyreltilmemiş plazma olan EIS'leri çalıştırmak önemlidir, böylece geliştirildikten sonra geri kazanılabilir ve daha sonraki deneylerde kullanılabilir.

Bu teknik, proteomik alanındaki araştırmacıların, sıralı Eliza'ların evrensel kullanımı yoluyla ilgilenilen herhangi bir hastalıkta aday biyobelirteçleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, küçük hacimlerde plazma kullanırken ve serbest döngüleri en aza indirirken sıralı E kullanarak çoklu biyobelirteçlerin nasıl doğrulanacağını iyi anlamış olmalısınız.