Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteomik ile keşfedilen çok sayıda yeni biyobelirteci verimli bir şekilde analiz etmek için yüksek kapasiteli ardışık ELISA kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle her bir biyobelirteç için seyreltme oluşturmak ve testler arasında geri kazanılan plazmayı saklamak amacıyla örneklerin bir kaynak plakaya eklenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hasta örneklerindeki konsantrasyonlarını belirlemek için her bir protein için ELISA testleri uygulanır.

Nihayetinde, akut graft versus host hastalığının klinik belirtilerinin başlangıcında bu biyobelirteçlerin protein seviyelerindeki artış değerlendirilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, sıralı analizörlerin, çoklu analiz platformlarında her zaman mevcut olmayan birden fazla yeni proteini analiz edebilmesidir. Bu tekniğin uygulamaları, akut graft versus host hastalığının teşhisine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntemle doğrulanan biyobelirteçler şu anda klinik bakım için araştırılmaktadır. Bu yöntem, travma sonrası poetik kök hücre transplantasyonundaki komplikasyonlara dair içgörü sağlayabilse de akciğer transplantasyonu, komplikasyonlar, akciğer kanseri veya potansiyel olarak tanısal bir kan testinin yararlı olacağı herhangi bir hastalık için biyobelirteç keşfi ve doğrulamasına da uygulanabilir.

Çoklu adımların, tekrarlanabilirliği sağlamak ve parti varyasyonunu düşük tutmak için tutarlı bir şekilde uygulanması önemli olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir. Deneyden bir gün önce, pıhtıları dipte ve lipidleri üstte ayırarak plazmadan uzaklaştırmak için plazma alikot örneklerini 15.300 RCF'de ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, önceden tanımlanmış haritalara göre manuel pipetleme ile her örnekten 150 mikrolitre seyreltilmemiş plazmayı 96 kuyucuklu V tabanlı bir plakaya aktarın. Plakayı Parafilm ile sarın ve 72 saate kadar dört santigrat derecedeki bir soğutma haznesinde bekletin.

Ardından, IL iki reseptör alfa ve insan büyüme faktörü veya HGF yakalama antikorlarını üretici spesifikasyonlarına göre yeniden oluşturup seyreltedikten sonra, her bir antikordan 50 µL'lik alikotları ilgili 96 kuyucuklu yüksek bağlama kapasiteli yarım kuyucuklu plakalardaki her bir kuyucuğa ekleyin. Daha sonra bu plakaları bir plaka kapatıcı ile mühürleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Şimdi reg üç alfa'yı üreticinin kaplama tamponu ile üretici protokolüne uygun olarak seyreltin ve çözeltiden 25 µL'yi 3 84 kuyucuklu no maxor plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin.

Ardından, deneyin ilk gününde bu plakayı mühürleyerek dört derece Celsius'ta saklayın. IL two reseptör alfa test plakasını yıkayarak ve TBS içindeki blotto ile bloklayarak başlayın. Standartı yeniden çözdükten sonra, üreticinin protokolüne uygun olarak sekiz noktalı bir standart eğrisi hazırlayın.

Bir sonraki plakada, kaynak plakadan ELISA test plağına, her bir standarttan çift örneği ve 50 µL seyreltilmemiş plazmayı aktarın. Ardından, kapatılmış plağı 300 RPM'ye ayarlanmış bir plak rotator üzerinde oda sıcaklığında inkübe edin. İki saat sonra, plazmayı IL-2 reseptörü alfa ELISA test plağından geri alın ve tekrar seyreltilmemiş plazma kaynak plağına yerleştirin.

Ardından, üretici protokolüne göre EIA'yı tamamladıktan sonra, her kuyucuğun optik yoğunluğunu 450 ile 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okuyun. Reg üç alfa Eliza için öncelikle 10 µL seyreltilmemiş plazmayı ayrı bir V-bottom kaynak plakasına aktarın ve ardından 1:10 seyreltme kaynak plakası oluşturmak için her kuyucuğa üretici tarafından sağlanan 90 µL seyreltme tamponu ekleyin. Üretici protokolüne göre Reg üç alfa Eliza'yı tamamladıktan sonra, 384 kuyucuklu plakaya durdurma çözeltisini ekleyin ve her kuyucuğun optik yoğunluğunu 450 ile 620 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okuyun. Elephant ve TNF-R1 yakalama antikorlarını üretici spesifikasyonlarına göre yeniden çözüp seyreltikten sonra, ilgili 96 kuyucuklu yüksek bağlama kapasiteli yarım kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğunu 50 µL yakalama antikoru ile kaplayın.

Ardından, mühürlenmiş test plakalarını; fil plakası için oda sıcaklığında, TN FFR plakası için ise dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. IL iki reseptör alfa Eliza işlemini tamamladıktan sonra, 60 µL seyreltilmemiş plazmayı yeni bir kaynak plakasına aktarın. Daha sonra, 1:2 seyreltilmiş plazma kaynak plakası oluşturmak için her kuyuya 60 µL %1 BSA içeren PBS ekleyin.

Ardından, HGF test plağını TBS içindeki BLOTTO ile yıkayın ve bloklayın, ardından sekiz noktalı standart eğri dilüsyonunu hazırlayın. Plak yıkandıktan ve bloklama adımı tamamlandıktan sonra, EISA test plağına bir ila iki kat dilüe edilmiş plazmadan ve her bir standarttan 50 µL'lik duble alikotlar ekleyin. Daha sonra, kapatılmış plağı oda sıcaklığında, 300 RPM'e ayarlanmış bir plak rotatöründe gece boyunca inkübe edin.

Ertesi sabah, 1/2 oranında seyreltilmiş plazmayı HGF Eliza test plağından geri alın ve tekrar 1/2 oranında seyreltilmiş plazma kaynak plağına yerleştirin. Üreticinin protokolüne uygun olarak EIA işlemini tamamladıktan sonra, deneyin ikinci gününde, 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her kuyucuğun optik yoğunluğunu okuyun. Önce 10 µL seyreltilmemiş plazmayı yeni bir kaynak plağına aktarın ve ardından 200 µL 1/20 oranında seyreltilmiş plazma hazırlamak için 190 µL PBS içinde %1 BSA ekleyin.

Ardından, üretici protokolüne uygun olarak ELISA işlemini tamamladıktan sonra, 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu okudu. TNF-α FFR için ELISA, öncelikle 1'e 20 kaynak plakasına 25 µL %1 BSA ve PBS ekleyerek kuyuk başına 125 µL 1'e 25 seyreltilmiş plazma elde etti. Daha sonra, üretici protokolüne göre TNF-α FFR ELISA'yı tamamladıktan sonra, 450 ila 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her kuyuğun optik yoğunluğunu okudu; IL-8 EIA için öncelikle 60 µL 1'e 2 seyreltilmiş plazmayı yeni bir kaynak plakaya aktardı ve ardından 1'e 6 seyreltilmiş plazma kaynak plağı oluşturmak için her kuyuğa 180 µL IL-8 dilüenti ekledi.

Ardından, üretici protokolüne uygun olarak ILH Eliza'yı tamamladıktan sonra, her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu 450 ile 570 nanometreye ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak ölçün. Son olarak, tüm Eliza işlemleri tamamlandığında, kullanılmayan talk plazmayı thought Eloqua'ya geri koyun ve gelecekteki kullanımlar için dondurun. Bu grafikte, başlangıçtaki reg üç alfa gastrointestinal graft versus host hastalığı biyobelirteç raporu için test edilen 1084 hastaya karşılık gelen reg üç alfa konsantrasyonlarını ölçen yedi farklı ELIZA plakasının standart eğrisi için optik yoğunluklar gösterilmektedir; plakalar arasındaki tutarlı optik yoğunluklar, deneyler arasında tutarlı protein konsantrasyonu ölçümlerini sağlar.

Plazma örneklerindeki protein konsantrasyonları, örnek optik yoğunlukları standart eğri optik yoğunlukları ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır. ELISA ve kreatif form mikroplakaları kullanılarak, plazma kullanım hacmi azaltılırken tekrarlanabilirliği daha da artırmak için robotik bir temiz işlem platformu kullanılabilir. Bu prosedür planlanırken, önce seyreltilmemiş plazma ile EIS'lerin çalıştırılması önemlidir; böylece plazma, geliştirme sonrası geri kazanılabilir ve sonraki deneylerde kullanılabilir.

Bu teknik, proteomik alanındaki araştırmacıların, ardışık ELISA'ların evrensel kullanımı yoluyla ilgi duyulan herhangi bir hastalıkta aday biyobelirteçleri keşfetmesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, az miktarda plazma kullanarak ve serbest döngüleri minimize ederek, ardışık ELISA ile birden fazla biyobelirtecin nasıl valide edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.