Name: Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Öğrenin, TVA reseptörü ve trans-sinaptik virüs kullanarak merkezi sinir sistemindeki sinaptik bağlantılı nöronları izleme yöntemini. Bu teknik, nöron devrelerinin yüksek verimli analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz rekombinant VSV varyantları kurtarılması için yardım Sean Whelan kabul etmek ister ve teknik yardım için Didem Goz ve Ryan Chrenek olurdu. Bu eser HHMI (CLC) tarafından desteklenen ve # NS068012-01 (KTB) oldu.

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Nöral devrelerin çalışma virüsler kullanma bağlı nöronlar analiz nispeten yüksek verimlilik yöntemdir. Bununla birlikte, VSV ve RABV virionlar her ikisi de elde önemsiz değildir. CDNA&#39;dan virüsü kurtarmak için yukarıda listelenen protokol sunulmasına rağmen, hala düşük bir olasılıkta olaydır. N, P ve L plazmidlerin her birinin seviyeleri ince ayarlanması gerekir, ve pek çok deneme ve çoğaltır viral kurtarma sağlamak için yapılması gerekir. Tam VSV genom RNA içeren ribonukleotid parçacığın oluşumu düşük olasılık olay...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Doku Kültürü&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bebek Hamster Böbrek (BSRT7) hücreleri</td><td>talep üzerine temin edilebilir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>talep üzerine temin edilebilir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pN, pP, pl plazmidleri</td><td>talep üzerine temin edilebilir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T hücreleri</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC-İşlem görmüş Kültür Kabı</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Vent Kapaklı Dik Açılı Boyunlu Dikdörtgen Hücre Kültür Flaskı</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Besiyeri: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2,000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga: 5 ml Luer-Lock şırınga</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtreleri</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: Yüksek Potanslı Lineer PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Viral Santrifüjleme&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning 150 ml Tüp Üstü Vakum Filtre Sistemi, 0.45 &amp;mu;m Gözenek</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>İnce duvarlı, Ultra-Şeffaf, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultrasantrifüj rotoru</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Fare Enjeksiyonu&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kapiler mikropipetler</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaks</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Ump enjektörü</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Dört kanallı mikrodenetleyici</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>C.EMX-1 Kadran Kontrollü M.TXB Tezgahüstü Motor, 115 Volt</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 El Aparatı, Hızlı Değiştirilebilir</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Kademeli Matkap, 0.5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Mikr&amp;#8211;elektrot tutucu</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge enjeksiyon iğnesi</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Koruyucu Oftalmik Pomad</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>İyot</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cerrahi ve Diseksiyon Araçları&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Standart Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Neşter sapı</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Neşter uçları</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Sütürler</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Diseksiyon ve Antikor Boyama&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Antikorlar&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antikorlar</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-tavuk Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-tavuk Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Doku Montajı&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Superfrost plus mikroskop lamları</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Lamel cam 22 x 22, 0 kalınlık</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Silikon elastomer</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf oje</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

genetiği tanımlı nöral devre arasında tracing viral

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Nöronal devreler eğitimi için klasik yöntemlerle oldukça düşük verim vardır. Transsinaptik virüsler, devreleri çalışmak için özellikle pseudorabies (PRV) ve kuduz virüsü (RABV), ve daha yakın veziküler stomatit virüsü (VSV), giderek daha popüler hale gelmektedir. Bunlar yüksek verim yöntemler ya anterograd veya retrograd yönde nöronlar arasındaki iletimi virüsleri kullanın. Son zamanlarda, monosinaptik retrograd izleme için bir değiştirilmiş RABV geliştirilmiştir. (Şekil 1A). Bu yöntemde, glikoprotein (G) gen viral genomun silinir, ve hedef nöronları içinde sadece resupplied. Enfeksiyon özgüllüğü, normal RABV-G 1 için ASLV-A glikoprotein ve RABV-G (A / RG) ve sitoplazmik alan hücre dışı domenden oluşan bir kimerik G, ikame edilmesi suretiyle elde edilir. Bu kimerik G özellikle TVA reseptör 1 salgılayan hücrelerin bozar. Gen kodlama TVA d olmuştur edebilirsinizçeşitli yöntemlerle 2-8 ile elivered. Bir TVA-ifade nöronun RABV-G enfeksiyonu takiben RABV TVA reseptörü ile birlikte teslim oldu, kendi G doğanın bir retrograd yönde diğer Synaptically bağlı nöronlara iletebilir. Bu teknik, belli bir başlangıç ​​hücre tipi üzerine girişlerin her bir örnekleme sağlayarak, belirli bir hücre tipi üzerine giriş nispeten büyük sayıda (% 5-10) 2 etiketler. Biz son zamanlarda bir transsinaptik tracer 9 olarak VSV kullanmak için bu tekniği modifiye. VSV gen ekspresyonunun hız da dahil olmak üzere birçok avantaj sağlar. Burada ayrıntılı artan çözünürlük ile mikrodevreler problama için yararlı VSV kullanarak yeni bir viral izleme sistemi. Ederken Wickersham ve diğerleri tarafından ilk yayınlanmış stratejileri. 4 ve Beier ve ark. Başlangıçta enfekte üzerine proje TVA-hücrelerini ifade eden, burada VSV televizyon için sadece iletmek için tasarlanmış olan herhangi bir nöron 9 izin etiketlemeA-salgılayan hücre (Şekil 1B). Virüs ilk TVA-ifade nöron nöron mansap enfeksiyonu izin RABV-G ile pseudotyped edilir. Hücrelerin bu birinci popülasyon enfekte sonra, virüs sadece TVA-Salgılayan hücrelerin enfekte edebilir çıkardı. Transsinaptik virüs spread TVA-eksprese eden hücreler, hücre tiplerinden tanımlanmış bağlantı olmaması varlığı ile sınırlı olduğu için, yüksek çözünürlüğe sahip keşfedilebilir. Bu deneylerin bir deneysel akış şeması Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Burada bir model devresi göstermek, fare retinada yön seçiciliği olduğunu. Biz retina ganglion hücrelerinin (RGCs) için starburst amacrine hücrelerinin bağlantısı (SAC) inceleyin.

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Nöronal devrelerin incelenmesine yönelik klasik yöntemler oldukça düşük kapasitelidir. Transsinaptik virüsler, özellikle de pseudorabies (PRV) ve kuduz virüsü...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, merkezi sinir sistemindeki mikrodevrelerin analizi için yeni bir teknik geliştirmektir. Bu, öncelikle TVA reseptörünün ekspresyonu aracılığıyla enfeksiyon için bir nöron popülasyonunun tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, seçilen birincil nöronları enfekte eden trans-sinaptik virüs MSS'ye enjekte edilir.Ardından virüs, yalnızca TVA reseptörü eksprese eden bağlantılı nöronlara trans-sinaptik olarak yayılacaktır. Bu nöronların birbirine bağlı olup olmadığını incelemek için, bilinen bağlantılı mikrodevrelerin etiketlenmesinin doğrulanmasına dayanarak, bu tekniğin mikrodevre analizinde kullanılabileceğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin elektrofizyoloji ve mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronal devrelerin analizi için yüksek kapasiteli (high throughput) bir yöntem olmasıdır.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, Wickersham ve meslektaşlarının mono-sinaptik olarak kısıtlanmış viral izleme üzerine yaptıkları ilk çalışmayı okuduğumuzda edindik. Virüslerin, bağlantılı nöronları yeni yöntemlerle incelemek için daha fazla mühendislik işleminden geçirilebileceğini düşündük. Pasajlama için hücreler üretmek amacıyla, VACCINIA T seven sistemi kullanılarak CD NA'dan VSV geri kazanımına ilişkin detaylar için lütfen yazılı protokole bakınız.Öncelikle, bir önceki gün ekilmiş olan dört adet %80 konfluensli 10 santimetre TV eight 800 hücre plağından medyayı aspire edin ve beş mililitre takviyesiz DMEM ile değiştirin. Standart prosedürlere uygun olarak, seçilen glikoproteini kodlayan plazmidin beş mikrogramını her bir plağa transfekte edin. Transfeksiyondan yaklaşık altı saat sonra, medyayı %10 FBS takviyeli DMEM ile değiştirin; glikoproteinin ekspresyonu ve yüzeyde birikimi için plakları 34 °C'ye ve %5 karbondioksite ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından medyumu aspire edin ve yerine %10 FBS içeren beş mililitre DMEM ekleyin; ardından her bir plaketi 0,01 ila 0,1 enfeksiyon çokluğu ile MA kuduz G kimera glikoproteini içeren VSV ile enfekte edin ve gece boyunca 34 °C'de inkübe edin. 24 saat sonra her bir plaketin enfeksiyon seviyelerini floresan mikroskobu ile kontrol edin. Hücrelerin %50'sinden fazlası enfekte olmuşsa medyumu toplayın.Beş mililitre taze besiyeri ile değiştirin ve ardından toplanan besiyerini -80 °C'de dondurun. Toplama prosedürünü bundan sonraki üç gün boyunca her 24 saatte bir tekrarlayarak toplam dört günlük toplama işlemi gerçekleştirin. Son alikvot -80 °C'de tamamen donduktan sonra toplanan besiyerinin her bir alikvotunu dondurun; bu noktada toplanan tüm besiyeri alikvotları 37 °C'de olmalıdır. Toplamda 80 mililitre toplanan besiyeri olmalıdır; toplanan besiyerini buz üzerinde 0,45 micron filtrelerden geçirin.Ardından, 36 mililitre virüsü bir Beckman santrifüj tüpüne paylaştırın ve süpernatantı 4 °C'de 90 dakika boyunca 80.000 ×g hızında ultrasantrifüj ile konsantre edin. Santrifüj işlemi sonrası rotorun düzgün şekilde dengelendiğinden emin olun; ardından tüpü %10 çamaşır suyu içeren bir behere aktarın ve bir aspiratör kullanarak tüpün yan taraflarındaki sıvıyı uzaklaştırın. Daha sonra, virüs içeren tüpleri 4 °C'de bir saat boyunca 120 RPM hızında çalkalayın ve viral peleti genellikle 30 µL civarında olan mümkün olan en küçük hacimde yeniden süspanse edin.Virüs yeniden süspande edildikten sonra, 293T hücreleri içeren 24 kuyucuklu bir plakayı 1 ile 1 milyon arasında on katlık dilüsyon serileri ile enfekte ederek ve enfeksiyondan yaklaşık iki gün sonra titre belirleyerek virüs titresi ölçülür. Standart prosedürlere göre, viral olarak enfekte olmuş hücreler floresan ile tespit edilebilir. Bu deneyler için doğru hücre hattının kullanılması önemlidir.Amaç, TVA reseptörünün haritalanması istenen hücre tiplerinde eksprese edilmesini sağlamaktır. Bu, TVA reseptörünün viral yöntemlerle veya transgenik bir alel aracılığıyla ekspresyonu ile gerçekleştirilebilir. Bu deneyde altı ila 10 haftalık üçlü transgenik fareler kullanılmaktadır.Koşullu bir TVA alleli eksprese eden fareler, chat, Cree alleli eksprese eden farelerle çaprazlanacaktır. Ardından bu fareler, floresan TD tomato alleli eksprese eden bir hatla çaprazlanmıştır. Nihai transgenik fare, ilgi odağı olan starburst omicron hücreleri de dahil olmak üzere, Cree eksprese eden tüm hücrelerde TVA ve koşullu bir TD tomato alleli eksprese eder.Ve bu ekspresyon floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. Bir fare beyin atlasından ilgilenilen bölge için stereotaksik koordinatları kontrol edin; mikro enjektör kontrolörünü açıp pistonu ve elektrot tutucuyu yerlerine yerleştirerek stereotaksik düzeneği hazırlayın. Ardından, virüsle bir ara yüz sağlamak için iğneyi mineral yağ ile doldurun ve iğne içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olarak iğneyi pistonun üzerine yerleştirin.Virüsü çözdürün ve buz üzerine yerleştirin. Mikro enjektörü çekme konumuna ayarlayın ve virüs tüpünü mikro enjektördeki kılcal borunun altına getirin. Kılcal borunun ucunu virüsün içine daldırın ve deney için gerekli miktarda virüsü çekin.Preoperatif buprenorfin dozu uygulandıktan sonra, hayvan kurumsal kılavuzlara uygun olarak uygun şekilde anestezi altına alınır. Bir ayak parmağı sıkıştırma testi uygulayın ve refleks yanıtın olmadığını doğrulayın. İşleme başlamadan önce.Anestezize edilmiş fareyi, konumlandırma için hareketli bir stand üzerine yerleştirilmiş bir ısıtma pedine yerleştirin. Hayvan anestezize olduğu süre boyunca korneanın kurumasını önlemek için göz merhemi uygulayın. Şimdi, kulak barlarını nazikçe kulak kanalına yerleştirerek fareyi stereotaksik cihaza sabitleyin.Başın stereo attacks tabanına paralel olduğundan ve yanlara doğru hareket etmediğinden emin olun. Ardından, başı stabilize etmeye yardımcı olmak için ısırma çubuğunu ayarlayın. İnsizyon bölgesindeki tüyleri temizleyin.Ardından bu bölgeyi üç kez etanol ile, ardından üç kez iyot ile yıkayın. Kafatasını açığa çıkarmak için bir makas yardımıyla ciltte sagital bir insizyon yaptıktan sonra, cildi el yapımı cerrahi kancalarla geri itin. Daha sonra mikro kapileri bgma ile sabitleyin ve mikro enjektörü lateral gent çekirdeği koordinatlarına taşımak için kadranları kullanın.LGN konumlandırıldıktan sonra, enjeksiyon bölgesinin üzerindeki kafatasına küçük bir delik açın. Kılcal boruyu deliğin üzerine yerleştirin ve yavaşça beyin yüzeyinin hemen dorsal konumuna kadar indirin. Burası, dorsal ventral koordinatının sıfır noktasıdır.Mikro kapiler, fare durasını delecek kadar keskin olmalıdır. Bu nedenle, kapileri yavaşça 2.75 milimetre derinliğe indirin ve gerekli miktardaki virüsü dakikada yaklaşık 100 litrelik bir hızla enjekte edin. Virüsün enjeksiyon yerinden yayılmasına izin vermek ve virüsün iğne boyunca yukarı doğru hareket etmesini önlemek için iğneyi yaklaşık yedi dakika boyunca beyinde bırakın.Ardından, iki dakikalık bir süre boyunca çok yavaş bir şekilde, iğneyi enjeksiyon bölgesinden ve beyinden yukarı kaldırın. Son olarak, cerrahi bölgeyi sütüre edin ve hayvanlar anesteziden çıkana kadar onları izleyin. İki gün boyunca her 12 saatte bir buprenorfin uygulayın.Genel olarak, VSV trans-sinaptik yayılımı enjeksiyondan yaklaşık 24 saat sonra gözlemlenebilir. Bununla birlikte, bekleme süresinin uzaması yayılımın artmasını sağlayacaktır. Fareyi karbondioksit inhalasyonu ile ötanize ettikten sonra, gözü dikkatlice çıkarıp %4 formaldehite yerleştirin ve gözün tamamen batmış olduğundan emin olarak bir saat boyunca inkübe edin.Ardından gözü, PBS içeren bir Petri kabına transfer edin. Korneayı hızlıca çıkarmak ve retinayı diğer dokulardan ayırıp diseke etmek için 55 numara bir pens kullanın. Tüm mount (whole mount) analizi.Retinayı, düz bir şekilde yatması için bir cam lam üzerinde kesin. Retine kesitlerinin analizi için, cam lam örtüsünün kenarlarının etrafına uzun süreli altın montaj medyumu ile silikon ara parçalar yerleştirin ve ardından sıfır kalınlıkta bir cam kapatma camı ile kapatın. Retinayı, tamamen batana kadar PBS içindeki %30'luk sükroz çözeltisine yerleştirin.Ardından retinayı, OCT ile %30'luk sükroz çözeltisinin bire bir oranındaki karışımında üç saat boyunca bekletin. Son olarak retinayı şok dondurun ve kesit almaya hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Bu görüntü, vsv A/rg ile TVA 800 hücrelerinin ve 2 9 3 T hücrelerinin enfektivitesini gösteren bir zaman seyri deneyini göstermektedir.Üst paneller, enfeksiyondan sonraki altı saat, bir gün ve iki gündeki TVA 800 hücrelerini göstermektedir. Alt paneller ise aynı zaman noktalarındaki 2 9 3 T hücrelerini göstermektedir. Virüs, TVA eksprese eden hücreler arasında birkaç saat içinde yayılırken, TVA reseptörünü eksprese etmeyen 2 9 3 T hücrelerinde yayılım gerçekleşse de çok daha yavaş gerçekleşmektedir.Ölçek çubuğu 100 mikronu temsil etmektedir. Bu görüntü, TVA eksprese etmeyen farelerin retinal ganglion hücrelerinin temsili bir enfeksiyonunu göstermektedir. Hayvanların LGN bölgesine vsv A/RG virüsü enjekte edilmiştir.R-A-B-V-G ile psödotipleme yapılmış ve enjeksiyondan iki gün sonra doku hasadı gerçekleştirilmiştir. Burada, sarı ok ucuyla belirtilen retinal ganglion hücrelerinin olduğu seyrek bir enfeksiyon görülmektedir. Bu görüntü ise daha yoğun bir enfeksiyonu göstermektedir.Bu durum, burada görüldüğü gibi, virüsün daha yüksek bir TI değeri ve kaliteli bir enjeksiyon ile sağlanabilir. Küçük arbor ganglion hücreleri, tip bir melanopsin ganglion hücreleri, yön seçici ganglion hücreleri veya DS GC'ler ve on-off DS GC'ler dahil olmak üzere farklı retinal ganglion hücresi türleri morfolojilerine göre tanımlanabilir. Burada, TVA eksprese eden bir fareden alınan aşağıdaki görüntülerde görüldüğü üzere, ölçek çubuğu 50 mikronu temsil etmektedir.On-off DS GC'lerden Starburst omiclerine VSVA/RG iletimi beklenen paterni takip eder. Beyaz ok ucu ile belirtilen ve yeşil dolgulu olan on-off DS GC'ler, sarı ok ucu ile belirtilen birden fazla starburst omicine virüs iletir. Burada görüldüğü üzere, DS GC olmayan tüm yeşil hücreler, TVA eksprese eden Starburst omicleri olduklarını gösteren Cree raporlayıcısı ile birlikte etiketlenmiştir.Yeşil dolgulu beyaz ok başlarıyla belirtilen DS GC'ler ve sarı ok başlarıyla belirtilen starburst omics, retinal iç pleksiform tabakasının (IPL) uygun sohbet katmanlarını katmanlandırmaktadır; virüsün iletildiği hücreler hem on hem de off hücrelerini içerir. Starburst omicron. Bu şekildeki sayılar IPL katmanlarını belirtmektedir. Uzmanlaşıldığında, tüm deney uygun şekilde yürütülürse bir veya iki günde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından VSV'nin hızı, onun temel avantajlarından biridir. Viral devre izlemeyi doğrulamak ve bu sinaptik bağlantıların özelliklerini analiz etmek için channel red veya opsin tabanlı devre haritalama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, virüs üretimi ile in vivo enjeksiyondan, floresanla işaretlenmiş nöronların analizine kadar viral devre izlemede yer alan farklı adımların çoğunluğu hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz teslim izleyiciler için pratik bir...

Çok Renkli Sinir Devre Topografya Revealing

Transsinaptik izleme, çoklu sinaptik devreler aracılığıyla periferik hedefleri düzenleyen merkezi eferentleri analiz etmek için güçlü bir araç haline gelmiştir. Burada, işlevsel bir beyin devresini tanımlamak ve lokalize etmek için transsinaptik psödorabies virüsünü kullanan bir protokol sunuyoruz, ardından tanımlanmış nöron grupları arasındaki devredeki belirli bağlantıları doğrulamak için klasik yol izleme teknikleri sunuyoruz.

Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies&#39;e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

İkili bir genetik stratejiden yararlanarak, Cre aracılı rekombinasyondan sonra tamamlayıcı transsinaptik izleyicileri eksprese eden farelerde nöral devre izleme için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlandığından, deneysel yaklaşımımız, murin embriyonik beyin gelişimi sırasında tek hücre çözünürlüğünde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını incelemek için uygundur.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Bu protokol değiştirilmiş kuduz virüsü floresan işaretlerini ifade ve bağımsız, tarafsız küme farklı nöronal alt sınıfları arasında morfolojik metrik kapsamlı karakterizasyonu olanak analizleri ile retrograd enfeksiyonu takiben etiketli seçici nöronal popülasyonlarının büyük ölçekli rekonstrüksiyon açıklar.

Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

Nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendisliğine dayanarak, vahşi tip beyinleri ve "test" ve "kontrol" türevlerinin eş-transplantasyonu, bu yöntem, neokortikal in vivo gen kontrolünde doğru modelleme sağlar basit ve ekonomik bir şekilde nöron morfoloji.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Bu protokol, beyinde AAV tabanlı bir viral sistem ve hücre tanımlaması ve daha fazla analiz için izin veren bir FLEX synapsin odaklı GFP muhabiri kullanarak doğrudan yeniden programlanmış internöronlar içinde vivo üretmeye yönelik hedefler.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin, TVA reseptörü ve trans-sinaptik virüs kullanarak merkezi sinir sistemindeki sinaptik bağlantılı nöronları izleme yöntemini. Bu teknik, nöron devrelerinin yüksek verimli analizini sağlar.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Daha fazla video keşfet