Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Aşağıdaki prosedürün amacı, hücre ölümü modellerini tespit etmek için fare embriyoları ve farklılaşmış kök hücreler olmak üzere iki tip numunenin, liyo izleyici boya ile lizozomlarının nasıl sürdürüleceğini göstermektir. Embriyo örneklerini hazırlamak için, embriyolar önce cerrahi olarak izole edilir ve farklılaşmış hücreler hazırlamak için bir tabağa yerleştirilir. Embriyonik kök hücreler, embriyo gövdeleri oluşturmak için kullanılır.

Bu embriyo cisimleri süspansiyon halinde kültürlenir ve daha sonra bir oda lamı üzerinde tek tabaka olarak büyütülür. Embriyoların tümü tek tabakalı olarak satılır, ot tracker kırmızısında inkübe edilebilir ve daha sonra durulanabilir ve sabit numuneler daha sonra Liso Tracker'ı gösteren boyama sonuçlarını incelemek ve ölçmek için fotoğraflanabilir. Boyama, embriyolarda ve kültürlenmiş hücrelerde program hücresi ölümünü test etmek için kullanılabilen basit bir prosedürdür.

Bu tekniğin tünel analizi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, OT izleyici boyasının küçük bir molekül olması nedeniyle kalın dokunun hızlı ve kolay bir şekilde test edilebilmesidir. Bu yöntem, fare embriyolarında ve farklılaşmış kültürlerde programlanmış hücre ölümü paternleri hakkında bilgi sağlayabilse de, tavuk embriyoları ve farklılaşan yetişkin kök hücreler gibi diğer doku tiplerine de uygulanabilir. Genç dişi fareleri damızlık bir erkekle eşleştirin ve sonraki sabahlar, çiftleşmenin gerçekleştiğini gösteren vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin.

Vajinal tıkacın ortaya çıktığı gün öğlen etkili bir şekilde 0,5 gündür. İlgilenilen embriyonik günde kotus sonrası, dişiyi onaylanmış protokollere göre ötenazi yapın ve uterusu Hank'in BSS'si ile 10 santimetrelik bir Petri kabına çıkarın ve kanı durulayın. Embriyoları ayırın ve rahimden çıkarın.

Ekstra embriyonik zarları çıkarın ve yabancı dokuları ve kanı çıkarmak için Hank'in BSS'si ile en az bir durulama yapın. Temizlerken disseke edilen embriyoları buz üzerinde tutun. Diğerleri.

Beş mililitre Liso tracker embriyo boyama solüsyonu hazırlayın. Bu, bir veya iki embriyo toplanması için yeterli bir hacimdir. Boyayı dağıtmak için çözeltiyi yavaşça karıştırın, daha sonra embriyoları çözeltiye aktarın ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, Hank'in BSS'sindeki embriyoları her yıkamada beş dakika boyunca dört kez nazikçe durulayın. Dokuya zarar vermemek için durulamaların nazikçe yapılması önemlidir. Sıvıyı çıkarın, hassas embriyoların nerede olduğuna yavaşça dikkat edin ve sıvının bir kısmını her zaman onları örtecek şekilde geride bırakın.

Daha sonra embriyoları ertesi gün gece boyunca% 4 para formaldehit içinde sabitleyin. Fiksatifi çıkarmak için embriyoları Hank'in BSS'sinde bir kez 10 dakika durulayın. Şimdi arka plan lekelenmesini önlemek için dokuları bir metanol serisinden kurutun.

Bu adım, depolamadan önce görüntüleme sırasında sinyal-gürültü oranını iyileştirir. Gerekirse, genetik analiz için her embriyodan bir doku örneği alın. Daha sonra, genotiplemeden önce doku örneğini yeniden sulandırın.

Embriyoları, doku örneğine uygun etiketlerle ayrı tüplere ayırın. Artık izole edilen embriyoları eksi 20 santigrat derece metanolde süresiz olarak saklamak mümkündür. Işıktan korunmalıdır.

Asılı damla yöntemi ile embriyo cisimlerini hazırlayarak başlayın. Üç gün sonra 20 mikrolitrelik damla başına 500 hücrelik bir başlangıç yoğunluğu ile, embriyo cisimciklerini 10 santimetrelik yapışmayan Petri kapları üzerindeki süspansiyon kültürlerine aktarın. Onları beş gün boyunca kültürleyin, beş gün sonra her iki günde bir medyayı değiştirin.

Embriyo gövdelerini, her odaya bir veya iki embriyo gövdesi yerleştirerek jelatinleştirilmiş sekiz odacıklı slaytlara aktarın. Embriyo cisimlerini 10 gün daha kültürleyin. Besiyerini 10 gün sonra her gün değiştirerek, mevcut besiyerini nazikçe aspire edin ve her hazneye 300 mikrolitre Lyo takip hücresi boyama solüsyonu ekleyin.

Pipet ucunu haznenin köşesine yerleştirerek ortamı manuel olarak pipetlemeye dikkat edin. Bu şekilde, yanlışlıkla cam yüzeyden her gövdeyi takarak çıkarmazsınız. Geri medyayı tekrar eklerken, pipet ucunu haznenin köşesine yerleştirin ve medyayı çok yavaş bir şekilde geri ekleyin.

Odaları 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ardından, durulama başına beş dakika boyunca DPBS ile iki kez durulayın. Şimdi hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraldehit içinde sabitleyin.

Daha sonra sabitleyiciyi DPBS ile iki beş dakikalık durulama ile çıkarın. Embriyoları monte etmek için, onları derin bir çöküntü cam slaytına veya küçük bir Petri kabı enfekte edici kalkanına yerleştirin. DPBS'yi aspire ederek hücre örneklerini mikroskopi için hazırlayın.

Hazneyi kaydıraktan çıkarın ve yaklaşık beş dakika kurumaya bırakın. Fluro'yu korumak için folyo ile örtün. Ardından, dappy ile vektör kalkanı gibi sulu bir montaj ortamı ekleyin ve üstüne bir kapak fişi yerleştirin.

Artık sürgü monte edilmiştir ve görüntüleme için hazırdır. Numuneleri bir çubuk, domin veya Texas kırmızı filtresi ile donatılmış bir diseksiyon veya bileşik mikroskop ile görselleştirin. Boyama tipik olarak oldukça parlaktır, bu nedenle manuel modda genellikle uzun pozlamalar gerekli değildir.

Aynı maruz kalma koşulları altında tüm numunelerin dijital fotoğraflarını çekin. Görüntüleri ölçmek için Adobe Photoshop veya benzer bir görüntüleme programında açın. Lyo tracker boyama miktarını belirlemek için kırmızı kanalı seçin.

Histogram işlevi tarafından gösterilen tüm görüntünün piksel sayısına dikkat edin. Sonraki eşik, kırmızı lekelenme artık beyaz piksellerle temsil edilecek şekilde görüntü. Bu, görüntüyü siyah beyaza dönüştürür.

Bir eşik düzeyi seçin ve kümedeki tüm görüntüler için bu düzeyi kullanın. Renk aralığı aracını kullanarak beyaz pikselleri seçin ve toplam beyaz piksel sayısını elde etmek için histogram işlevini kullanın. Alandaki çekirdek sayısını saymak için mavi kanalı kullanın.

Görüntüye açıklama ekleyerek sayımın kaydını tutmak, değerleri kaydetmek ve bunları hücre başına ortalama boyama seviyesini hesaplamak için kullanmak yararlı olabilir. Kalan tüm görüntüler için aynı eşik ayarıyla bu analizi tekrarlayın. Örneklemek için, sonik kirpi mutant embriyolarını boyamak için ly o tracker kullanıldı.

ly O izleyici, kotus programlanmış hücre ölümünden 10.5 gün sonra boyandığı gibi, bütün bir embriyonun derinliklerinde küçük, oldukça yayılabilir bir molekül alanı olduğundan, sonik kirpi boş mutant embriyolarda, özellikle uzuvda ve dolayısıyla bölgelerde PCG büyük ölçüde artmıştır. Uzuv tomurcukları, genel modeli değerlendirmek için daha yüksek büyütmede delik yuvalarında görüntülendi. Diseke edilen kısımlar ayrıca titreşimli bir mikroton ile bölümlere ayrıldı.

Ok ucu, kriyostat tünel boyaması ile elde edilen kesitlerde sonik kirpi boş distal ucunda artan lekelenmeye işaret eder, bu dilimlerde OT Tracker ile birlikte kullanılmıştır, ancak lyo tracker ile tünel boyama arasında kesin bire bir korelasyon olmamasına rağmen, PCD'nin genel bölgeleri daha yüksek büyütme altında önemli ölçüde örtüşür. Tünel tahlili ile pozitif olarak boyanan delinmeyi görmek mümkündür, ancak sadece lira kalıbı ile lekelenen otra kalıbı delinmesi ve üst üste binen lekelenmeye sahip delinmeyi görmek mümkün değildir. 10 günlük embriyo vücut kültüründen sonra hücreler, nöronlar, kas hücreleri ve kardiyomiyositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaştı.

Diferansiye ES hücrelerinin normal kültüründe, lyo tracker ve tünel testleri ile tespit edildiği gibi PCD uygulanan birkaç hücre vardır. Sonraki hücreler, oksidatif stres hücresi ölümünü indüklemek için hidrojen peroksit ile muamele edildi. Düşük dozda hidrojen peroksit, hiçbir tedaviye kıyasla hem lyo tracker hem de tünel boyamasını artırdı.

Embriyodaki sonuçlara benzer şekilde, her iki leke de ortak ve benzersiz hücreleri etiketledi. Yüksek dozda hidrojen peroksit, hücre küçülmesine ve daha yaygın OT izleyici ve tünel pozitifliğine neden oldu. Karşılaştırma için, bir saatlik serum açlığından sonra otofajiyi indüklemek için serum açlığı kullanıldı.

OT izleyici lekelenmesi arttı. Ancak tünel pozitifliği normal seviyelerde kaldı. Bu nedenle, reer kolay ve kullanışlı olsa da, numuneler ölçüldükten sonra boyamanın apoptozu mu yoksa otofajiyi mi temsil ettiğini belirlemek için ek tahlilleri takip etmek önemlidir.

Daha önce gösterilen basit Photoshop yöntemini kullanarak, sonuçlar, artan hidrojen peroksit konsantrasyonlarının daha yüksek düzeyde lys tracker boyaması ile sonuçlandığını doğruladı. Hücre ölümünün tipini doğrulamak için NX in five veya lc three immün boyama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Şu anda Trecker yeşilinin yalnızca canlı hücrelerde çalıştığını unutmayın, bu nedenle Reca kırmızısı, sabitleme gerektiren numuneler için en iyi seçeneğinizdir.