Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Bu prosedürün genel amacı, tekrarlayan herpes simplex virüsü veya HSV enfeksiyonunu incelemektir. Bu, öncelikle farelerin kornea hasarı oluşmadan latent enfekte olacak şekilde enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Latans tamamen kurulduktan sonraki adım, virüsü UVB ışığına maruz bırakarak yeniden aktive etmektir; son adımda ise viral dökülmenin tespiti için gözyaşı filmi toplanır ve ardından hastalığı izlemek için fare en az beş hafta boyunca gözlemlenir.

Nihayetinde, farelerde meydana gelen hastalığın boyutu, Herpetik stromal keratit hastalık skorlaması ile değerlendirilebilir. Bu, dünya çapında birçok kişiyi etkileyen bir hastalıktır. Bu spesifik hastalık, enfeksiyona bağlı körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir.

Bu özel hastalığı taklit etmek için farelerde kullandığımız bir modelimiz var. Bu hastalığı taklit edebilen başka modeller de mevcut, ancak bunun bu özel hastalığın en iyi temsili olduğunu düşünüyoruz. Bugün birkaç dakikanızı ayırarak bu videoda göreceğiniz kişileri tanıtmak istiyorum.

Bu, son birkaç aydır benimle çalışan Chloe. Bu da laboratuvarda çalışan yaz öğrencisi Nippo. Deneye, HSV-1'i bir T150 flask içerisinde Vero hücrelerinde üç ila dört gün boyunca %80 konfluense ulaşana kadar büyüterek başlayın.

Hücreler bu süre zarfında yuvarlaklaşmış olacak ve flaska vurularak kolayca yerinden ayrılacaktır. Hücre süspansiyonunu steril 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve ardından hücreleri 15 dakika boyunca santrifüjleyin. İşlemi, bir masaüstü santrifüjde dört derece Celsius'ta 1.510 ×g hızında gerçekleştirin.

Ardından, süpernatantı 50 mililitrelik steril oak ridge tüplerine aktarın ve ardından resüspansiyon için konik tüplerin her birine toplam beş mililitre medya paylaştırın. Büyük peletleri süspande edin, ardından resüspande edilen peletleri iki adet 32'lik patlamalar halinde bir dakika boyunca sonike edin. Süpernatant yüksek hızlı bir masaüstü santrifüjde santrifüj edildikten sonra, küçük bir viral pelet elde edilir.

Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, hücre çökeleklerini küçük viral peletlerle birleştirin ve 45 saniye boyunca tekrar sonike edin. Ardından, sonike edilmiş hücre ve virüs çözeltisini masaüstü santrifüjde beş dakika boyunca 280 ×g ve 4 °C'de tekrar santrifüjleyin ve ardından süpernatanı, viral stok olarak -70 °C'de saklamak veya titrasyon plakasına aktarmak için alikotlara ayırın.

Virüs stok süpernatantından 10⁰'den 10⁻⁸'e kadar on katlı dilüsyonlar, iki ayrı dilüsyon setinden ikişer kez, 12 kuyucuklu steril plaklardaki Vero hücrelerine uygulanır; enfeksiyon prosedürüne fare anestezi edilerek başlanır. Virüsün, fare uyanmadan önce emilmesi için farenin 20 ila 30 dakika boyunca tamamen anestezi altında kalması gerekir.

Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, sağ gözün korneasını çizmek için 30 gauge bir iğne kullanın. Şimdi hayvanı kulak delme yöntemiyle numaralandırın. Sonrasında, primer enfeksiyon sırasında korneaları hasardan korumak için fareye bir mililitre havuzlanmış insan serumu enjekte edin.

Ardından, çizilmiş göze 10⁶ plak oluşturan birim enfekte etmek için 20 µL'lik bir pipet kullanın ve enfeksiyonu doğrulamak amacıyla hayvan anestezi altındayken diğer gözun nemli kalması için içine 5 µL HBSS yerleştirin. Steril bir pamuklu aplikatörü 1 mL Vero besiyeri ile nemlendirin. Enfeksiyondan üç gün sonra, enfekte gözü aplikatörle sürüntüleyin ve ardından sürüntülenen besiyerinden 100 µL'yi, primer enfeksiyondan en az beş hafta sonra 48 kuyucuklu plakalarda büyütülmüş Vero hücrelerine aktarın.

Anestezi uygulanmış farenin enfekte gözünü az önce gösterildiği şekilde sürüntüyle örnekleyin. Spontan göz kırpmaları kontrol etmek için 48 kuyucuklu plaka kapağına sürüntü işlemini sıfırıncı gün olarak işaretleyin. Ardından fareyi, sadece tek bir gözün UVB ışığına maruz kalacağı şekilde 302 nanometre pik dalga boyunda UVB yayabilen bir transilüminatöre yerleştirin ve fareyi santimetrekare başına 250 milijoule UVB ışığına maruz bırakın.

Ardından, birinci günden yedinci güne kadar gözü günlük olarak sürüntüyle örnekleyin. Enfeksiyöz virüs içeren bu sürüntülerin UVB ışınlaması sonrası virüs miktarını, fareleri klinik göz hastalığı açısından değerlendirmek için 12 kuyucuklu plakalar kullanarak standart bir plak sayım testi ile belirleyin. Fareyi binoküler bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Kornea opasitesi sıfırdan dörde kadar olan bir ölçekle değerlendirilir; burada sıfır berrak stromayı, bir hafif stromal opasifikasyonu belirtir. İki, belirgin iris ile birlikte orta dereceli opasiteyi ifade eder. Üç, pupil kenarları hariç belirgin iris detaylarının kaybı ile birlikte yoğun opasiteyi, dört ise posterior görünümün olmadığı tam opasiteyi belirtir.

Neovaskülarizasyon, kornea dört eşit kadrana bölünerek ve bu kadranların her birindeki vaskülarizasyon derecesi belirlenerek bir ila sekiz arasındaki bir ölçekte değerlendirilir. Bu ilk şekilde, latent enfeksiyonu olan farelerde UVB ışınlaması ile reaktivasyon tetiklenmiş ve ardından fareler 35 gün boyunca kornea opasitesi açısından izlenmiştir. Bu veriler, 14 ile 35. günler arasında dişi C 57 black six farelerde virüs kaynaklı hastalığın anlamlı derecede daha şiddetli seyretmesi nedeniyle, erkek C 57 black six farelerin dişi C 57 black six farelere kıyasla anlamlı derecede daha az kornea opasitesi sergilediğini göstermektedir.

Benzer şekilde, korneal neovaskülarizasyon aynı deneysel koşullar altında değerlendirildiğinde, erkek farelerin korneada dişi farelere göre anlamlı derecede daha az yeni damar büyümesi gösterdiği ve bir kez daha, 14. ile 28. günler arasında dişi C 57 black six farelerde virüs kaynaklı hastalığın anlamlı derecede daha şiddetli olduğu görülmüştür. Bu prosedürü uygularken, farelerin 20 ile 30 dakika arasında uykuda kalmaları için onları tamamen anestezi altına aldığınızdan emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, bu insan hastalığını incelemek için rekürren stromal keratit fare modelinin nasıl kullanılacağı konusunda bilgi sahibi olduğunuzu umuyorum.