Name: Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Keşfedin fare modelinde doku mühendisliği yöntemlerini; organoid üniteleri ve iskelet yapı kullanarak fonksiyonel bağırsak dokusu oluşturma tekniğini öğrenin. Bu protokol rejeneratif tıp ve hastalık modelleri için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel ve Frédéric G. Sala California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM), hibe numaraları RN2-00946-1 (TCG) ve TG2-01168 (ERB, FSG) tarafından desteklenmektedir. Allison L. Speer Üniversitesi Cerrahlar Ethicon bilgin bir Derneği&#39;dir. Yashuhiro Torashima Bir Çocuk Hastanesi Los Angeles Saban Enstitüsü Araştırma Kariyer Geliştirme Bursu tarafından finanse edilmektedir.

1. Organoid Üniteleri Hazırlık <ol><li> Fare diseksiyon (makas ve forseps) için uygun Araçlar otoklav ile sterilize edilmelidir. </li><li> Insanca yerel IACUC protokollere göre donör fare ötenazi. Hayvan geçmeden önce ölü olduğundan emin olun. </li><li> Periton boşluğuna erişmek için bir orta hat kesi olun. Pozlama geliştirmek için gerektiği gibi cilt flepleri yansıtılabilir. </li><li> Ince bağırsak canı çıksın ve Treitz ligamanı hemen distalinde bölün. Keskin ve yumuşak künt diseksiyon kullanarak mezenterden ince bağırsak ayırın. Ileoçekal bileşke belirlemek ve bu proksimal ince barsak 5 mm bölün. </li><li> Makas kullanılarak, (Invitrogen, anti-anti) 10 ml 4 ° C, steril Hanks &#39;tamponlu salin (HBSS, Invitrogen, Carlsbad, CA) / 1X-antifungal antibiyotik olan bir Petri tabağına antimezenterik sınır boyunca uzunlamasına çözelti bağırsak açın. Ile açılmış bağırsak dışkı TemizleYumuşak ajitasyon sonra, 10 ml 4 ° C, steril HBSS / 1X anti-anti ile bir 15 ml santrifüj tüpüne açılmış bağırsak aktarın. </li><li> 4 10 ml açılmış bağırsak üç kez yıkayın ° C arasında, bir test tüpü içinde anti-anti steril HBSS / 1X. Her yıkama 30 sn için 15 ml tüp hafif sallama ile gerçekleştirilebilir. Çalkaladıktan sonra, bağırsak doku tüpün altına düşer. Mezenkimal debris yüzen madde, atın. Bir pipet yardımıyla dikkatlice yıkanması çözüm çıkarın. </li><li> 4 10 ml bir Petri kabındaki yıkanmış bağırsak Kıyma ° C, steril HBSS / makas kullanılarak en az 1 mm kare parçalara 1X anti-anti. Otomatik bir pipet yardımıyla kıyma malzeme toplamak ve bir test tüpüne yerleştirin. </li><li> 8 dakika boyunca 500 rpm&#39;de tüp santrifüjleyin. Yağ ve mezenşimi içeren süpernatant, atın. </li><li> Steril HBSS / 1X anti-anti artı 0.125 mg / ml dispase (Invitrogen) ve 800 birim / m ile 10 ml kıyılmış ve yıkanmış malzeme, Digestl kollajenaz tip 1 (Worthington, Lakewood NJ). Sindirim çözelti, 40 ml hazırlamak için, dispase, kollajenaz 142 mg 5 mg tartmak, ve 40 ml bir hacme kadar steril HBSS kadar ekleyin. Her defasında taze organoid birimleri hazırlanan bu çözüm hazırlayın ve kullanmak için 4 ° C kadar hazır tutun. Adım 1.8 &#39;den direkt olarak pelet sindirim solüsyonu eklenir. </li><li> 20 dk için 37 ° C &#39;de sindirim çözelti ile kıyılmış ve yıkanmış malzeme içeren test tüpü inkübe edin. </li><li> Test tüpü ayrıca alma ve 10 ml lik bir pipet ile tritürasyon ile sindirilmiş doku bozar. Düzgün bir görüntü elde edilinceye kadar 20 ila 50 kez arasında tekrarlayın. </li><li> 800 rpm&#39;de 5 dakika süreyle test tüpü santrifüjleyin. Tek hücre içeren süpernatant, atın. </li><li> 4 ° C, steril Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM, Invitrogen) artı% 10 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (HI-FBS, Invitrogen) 10 ml sindirim reaksiyonu durdurun. Pelle süspanset ve tüp sallayın. </li><li> 800 rpm&#39;de 5 dakika süreyle test tüpü santrifüjleyin. Son birkaç damla kadar otomatik bir pipet yardımıyla dikkatlice Süpernatantı. Pelet resuspending önlemek için son birkaç damla için tek kullanımlık plastik pipet kullanın. </li></ol> 2. Poliglikolik Asit İskele yüklenmesi <ol><li> Gibi Ref tarif; nonwoven poliglikolik asit (porozite&gt;% 95, Concordia Elyaf, Coventry RI 2 mm sac kalınlığı, 60 mg cm-3 yığın yoğunluğu) gelen Form 2-mm uzunluğunda, 5 mm dış çaplı silindirik iskelelerinin. 4. </li><li> Distile su içinde% 70 etanol ile hazırlanmış makasla Öneri atılabilir 1.000 mikrolitre pipeti distal 2 mm kesin. </li><li> 4 kuyu kültür plaka içine iskele yerleştirin. Birinci lümen içine ve daha sonra dış yüzey üzerine, 1.000 mikrolitre pipeti ile iskele üzerine organoid birimleri yerleştirin. Lümeninin kaplama sağlamak için bir forseps kullanın. Bozabilir veya polimer silindir şeklinde açık bozmayın. </li&gt; </ol> 3. Makine Fare içine İmplantasyonu <ol><li> Donör varsa aynı arka plan üzerine bir singenik ana farenizi kullanın. Aksi takdirde, bir immün obez olmayan diyabetik (Jackson Laboratuvarları, Sacramento CA) hayvan / ağır kombine immün yetmezliği veya NOD / SCID kullanır. </li><li> Izofluran ile genel anestezi øndükle. , Hazırlık Tıraş ve fare karın asmak. </li><li> Periton boşluğuna giriş kazanmak için 5 mm&#39;lik bir orta hat kesi olun. Belirleyin ve dikkatlice omentum bağırsaklarını. Omentum üzerine yüklenen polimer yerleştirin ve doku ile sarın. Omentum yırtmayın. </li><li> 5-0 monocryl sütür ile omentuma polimer sabitleyin. Yavaşça kendi anatomik pozisyonuna sarılmış polimer ile omentum değiştirin. </li><li> 4-0 vikril sütür kullanarak kat insizyon kapatın. Kas kapatma çalıştırın ve kesi altında abdominal organları kesmemeye dikkat edin. Cilt için suturlarla kullanın. </li><li> Kesi bitişik bir subkutan kabarıklık olarak steril su içinde 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Hayvan Sağlığı) ile postoperatif analjezi Yönet. Hayvanlar günlük olarak değerlendirilmelidir ve hayvan ağrı veya acı belirtileri gösteren ise, ketoprofen, ek bir doz ameliyat sonrası 2. günde tatbik edilebilir. Ameliyat sonrası üçüncü gününde, hayvan tam ağrı veya sıkıntı olmaksızın iyileşti edilmelidir. Ağrı veya sıkıntı post operatif 3. gün devam ederse, bu anormal kabul edilir ve IACUC ve hayvan bakım tesisi protokoller çerçevesinde ele alınmalıdır. </li><li> Iyileşmek için fare ve doku mühendisliği bağırsak dört hafta boyunca büyümeye izin verin. Kemirgen chow (Lab Diyet 5001, PMI Beslenme, St Louis MO) ve 5 ml (Hi-Tech Pharmacol, Amityville NY) 1:100 dilüsyon başına Septra 200 mg / 40 mg ile su hayvan ad libitum erişimi verin. </li></ol> 4. Hasat <ol><li> Humanely dört hafta implantasyonu sonrası ana hayvan ötenazi. </li><li> Orijinal kesi yeniden açın ve cilt yansıtan periton boşluğuna ulaşımı kolaylaştırmak için sefalad. </li><li> Kas tabakası açın ve doku bir küre olarak doku mühendisliği yapı tanımlar. </li><li> Keskin diseksiyon kullanarak intraabdominal organlar gelen yapı yapıştıkları aşağı atın. </li><li> Montaj sonra parafin için formalin yapı Fix, ya da real-time PCR veya protein izolasyonu gibi biyokimyasal testler için taze doku kullanın. </li></ol>

<ol><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).</li>
<li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).</li>
<li>Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+method+for+the+preparation+of+rat+intestinal+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures.</a> J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicellular+approach+forms+a+significant+amount+of+tissue-engineered+small+intestine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse.</a> Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).</li>
<li>Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tissue-engineered+stomach+demonstrates+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation.</a> J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).</li>
<li>Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cell+proliferation+is+dependent+on+the+site+of+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection.</a> Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).</li>
<li>Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+corrective+pullthrough+surgery+in+a+mouse+model+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease.</a> J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).</li>
<li>Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).</li>
<li>Shew, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+concerns+in+malrotation+and+midgut+volvulus%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus.</a> Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).</li>
<li>Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+long-term+results+and+prognostic+factors+after+conservative+surgery+for+small+bowel+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).</li>
<li>Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+after+surgery+for+acute+mesenteric+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia.</a> Surgery. , 121-239 (1997).</li>
<li>Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+biopsy-proven+parenteral+nutrition-associated+liver+fibrosis+and+biochemical+cholestasis+in+children+with+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome.</a> J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).</li>
<li>Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+short+bowel+syndrome%3A+the+cost+of+comprehensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care.</a> Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).</li>
<li>Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+and+multivisceral+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Intestinal and multivisceral transplantation in children.</a> Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).</li>
<li>Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+intestinal+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Current status of intestinal transplantation in children.</a> J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşım kullanarak fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bir protokol mevcut. En kritik adımlar organoid birimlerin hazırlanması olanlardır. Bakım yeterince temiz ve mekanik doku işleme alınmalıdır, ancak sindirim gerçekleştirildikten sonra eşit bakım (adım 1.11) organoid birimleri overdigest ya overtriturate için değil alınmalıdır. Eğer bu yapılırsa, organoid birimleri adım 1.12 süpernatant içinde kaybolmuş olabilir tek hücreler, azaltılmış, ve doku mühendisliği bağırsak üre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 114170-112 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Gibco </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip 1 </td><td> Worthington </td><td> LS004194 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM Yüksek Glikoz 1X </td><td> Gibco </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Isı inaktif FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td></td></tr><tr><td> Biofelt 100% PGA </td><td> Concordia Tıp </td><td> FELT01-1005 </td><td> Referans olarak polimer hazırlanması için.4 </td></tr><tr><td> Poli-L-laktik asit </td><td> Durect </td><td> B6002-1 </td><td> Referans olarak polimer hazırlanması için. 4 </td></tr><tr><td> I Kollajen, sıçan kuyruğu yazın </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3867-1VL </td><td> Referans olarak polimer hazırlanması için. 4 </td></tr><tr><td> Ketoprofen 100 mg / ml </td><td> Fort Dodge Hayvan Sağlığı </td><td> 71-KETOI-100-50 </td><td></td></tr><tr><td> LabDiet 5001 kemirgen chow </td><td> LabDiet </td><td> 5001 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml, USP Septra başına 200 mg / 40 mg </td><td> Hi-Tech Pharmacol </td><td> 50383-824-16 </td><td></td></tr><tr><td> İzofluran, USP </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-507-06 </td><td></td></tr></tbody></table>

bir fare modelinde bağırsak doku mühendisliği

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Doku mühendisliği ince bağırsak (TESI) başarıyla 40 gün içinde ameliyat öncesi ağırlıklarına dönmek sonuçlanan masif ince barsak rezeksiyonu sonrası Lewis fareleri kurtarmak için kullanılır olmuştur. İnsanlarda 1, masif ince barsak rezeksiyonu kısa barsak sendromu, fonksiyonel malabsorbtif neden olabilir önemli morbidite, mortalite ve parenteral beslenme bağımlılığı, karaciğer yetmezliği ve siroz ve multivisceral organ nakli ihtiyacı. 2 Bu yazıda da dahil olmak üzere sağlık giderleri bahşeder devlet, bir fare modelinde doku mühendisliği bağırsak oluşturmak için bizim protokol tanımlamak ve belgelemek çok hücreli organoid üniteleri-on-iskele yaklaşım. Organoid adet mukozal ve mezenkimal hem elementleri içeren bağırsak türetilen çokhücreli agrega, 3 intestinal kök hücre niş korur aralarında ilişki vardır. Süregelen ve gelecekteki araştırmalarda 4, içine bizim tekniği geçişiFare bu türün mevcut transgenik araçları kullanarak TESI oluşumu sırasında söz süreçlerin incelenmesi için izin verecektir. immünkompromize fare suşları 5 durumu da bize insan intestinal doku tekniği uygulamak ve bir insan TESI oluşumunu optimize etmek için izin verir insanlar içine onun geçiş öncesi fare ksenogreft. Bizim metodumuz iyi üretim uygulamaları (GMP) reaktifleri ve zaten insan hastalarda kullanım için onaylanmıştır ve bu nedenle decellularized hayvansal dokular güvenmemeniz yaklaşımlar üzerinde önemli bir avantaj sunuyor oylandı malzemeler kullanmaktadır. Bu yöntemin nihai hedefi kısa barsak sendromu için bir rejeneratif tıp tedavi stratejisi olarak insanlar onun çevirisidir.

Şekil 1 burada belgelenen protokolü için genel bir şema göstermektedir. Bu protokolün sonuç aynı yapı görüntüleyen bir lümen, mukoza, submukoza ve muskularis. Şekil 2A çevreleyen bir başlangıç ​​polimer iskele. Şekil 2B karşılaştırıldığında tipik bir dünya gösterir ile doku mühendisliği murin bağırsağın bir dünya veya küresel bir yapıdır keskin onun lümen ortaya bivalved. Şekil 3 inkübasyondan 4 hafta sonra tipik başarılı yapı bir Hematoksilen / eozin b...

Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Doku mühendisliği ile üretilmiş ince bağırsak (TESI), masif ince bağırsak rezeksiyonu sonrası Lewis sıçanlarını kurtarmak için başarıyla kullanılmış ve ... geri dönüşüyle sonuçlanmıştır.

Bu video, iskele destekli bir organoid birimleri yaklaşımı kullanarak farede doku mühendisliği ile küçük bağırsak üretme tekniğimizi gösterecektir. Bu deneyde, hayvanlara kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi ile Los Angeles Çocuk Hastanesi Savon Araştırma Enstitüsü Hayvan Bakım Tesisi kılavuzlarına uygun olarak işlem yapılmıştır. İlk adım, fare bağırsağının tamamının temin edilmesidir.İnsani yöntemlerle ötanazi uygulanmış fare ve aletler, suda %70 etanol ile hazırlandıktan sonra, periton boşluğuna girmek için orta hat üzerinden bir insizyon yapılır. İnce bağırsak, ligamentum trites'in hemen distalinden evisere edilir ve kesilir. Ardından bağırsak, mezenter ve damarlarından keskin ve künt diseksiyonla ayrılır.Son olarak, ileum ileosekal valvin beş milimetre proksimalindenle kesilmiştir. Toplanan ince bağırsak ölçekli olarak gösterilmektedir. Burada, bağırsak, 1X antibiyotik antifungal çözeltili Hank's dengeli tuzlu solüsyonu içerisinde antimesenterik kenarı boyunca boyuna olarak açılır.Ardından bağırsak, kap içindeki dışkı materyalinden temizlenir ve ardından bir test tüpü kullanılarak HBSS ile üç kez tekrarlı yıkama yapılır. Bağırsak dokusu tüpün dibine çöker; yüzeyde yüzen materyaller mezenkimal debris'dir ve atılabilir. Yıkama solüsyonu bir pipet yardımıyla dikkatlice uzaklaştırılır.Ardından bağırsak, makas kullanılarak bir milimetrekareden daha küçük parçalar halinde kıyılır. Kıyılmış materyal otomatik bir pipetle toplanır. Kıyılmış yıkama materyali artık sindirim işlemi için hazırdır.Sindirici solüsyon, antibiyotik-antifungal içeren HBSS içerisinde mililitre başına 0,125 miligram DASE ve mililitre başına 800 ünite kollajenaz içerir. Sindirici solüsyonun renginin, antibiyotik-antifungal içeren HBSS ile karşılaştırıldığında kahverengimsi olduğuna dikkat edin. Taze olarak hazırlanan bu solüsyondan 10 mililitre, kıyılmış materyale eklenir.Bu karışım, bir rotatör üzerinde 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edilir. Doku, burada gösterildiği gibi bir pipetle tekrarlanan emme ve püskürtme işlemleriyle daha fazla parçalanır. Homojen bir görünüm elde edilene kadar bu işlem 20 ila 50 kez tekrarlanır.10 mililitrelik pipet ucu ideal boyuttadır. Bunun için reaksiyon, %10 fetal bovine serum içeren 4 °C'ye getirilmiş 3 mililitre DMEM ile durdurulur. Materyal 10 dakika boyunca santrifüj edilir.500 RPM'de, süpernatan atılır ve pelet 10% fetal bovine serum içeren 4 °C'deki 10 mililitre DMEM yıkama solüsyonunda yeniden süspande edilir. Ardından, süpernatanda kalan ve atılan tekil hücreler dışındaki tüm dokuları geri kazanmak için beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüj edilir. Pelet; organoid ünitelerini, üstteki daha hafif materyali (pensle gösterilen) ve atık materyali içerir.Bu tabakanın altında kalan serumlu DMEM, bir pipetle uzaklaştırılır. Peletin pipetle süspande edilmemesine dikkat edilir. Son birkaç damla, tek kullanımlık plastik pipetle daha güvenli bir şekilde alınabilir.Burada, deneylerimizde kullanılan poliglikolik asit veya PGA polimer iskele gösterilmektedir. Tek kullanımlık 1000 microliter pipet ucunun distal iki milimetresi steril makasla kesilir. Materyalin polimerden uzaklaşarak yayılmasını en aza indirmek için, polimeri dört duvarlı kültür plaklarındaki organoid birimlerle doldururuz.Organoid birimleri, pipet yardımıyla önce lümene, ardından dış yüzeye gelecek şekilde iskeleye yüklenir. Lümenin yeterli düzeyde kaplandığından emin olmak için ikinci bir pens kullanılır; polimerin silindirik şeklinin bozulmamasına dikkat edilir. Transgenik bir donör kullanıldığı durumlarda, konakçı fare olarak immün yetmezlik durumundaki obez olmayan diyabetik fare kullanılır.Ağır kombine immün yetmezliği gama zinciri eksik veya NSG fareleri. Diğer durumlarda, implantasyon için sinjenik konaklar kullanılabilir. Genel anestezi indükte edildikten sonra, abdomen tıraş edilir, hazırlanır ve örtülür.0,5 santimetrelik bir orta hat insizyonu yapılır. Büyük omentum belirlenir ve dikkatlice dışarı çıkarılır. Yüklü polimer omentuma sarılır ve beş sıfır Monocryl sütür ile sabitlenir.Omentumun yırtılmaması kritik öneme sahiptir, aksi takdirde hücreler peritona sızabilir. Yüklü polimerle sabitlenmiş omentum karın boşluğuna yerleştirilir ve karın tabakalar halinde kapatılır. Kapatma işlemi için kesikli dikiş yöntemiyle 4-0 Vicryl sütür kullanılır.Postoperatif analjezi için önce kas tabakasına, ardından deriye kilogram başına iki miligram ketoprofen steril su içerisinde, insizyonun yanına subkütan olarak enjekte edilir. İmplantasyondan dört hafta sonra, konak hayvan insancıl yöntemlerle ötanize edilir ve orijinal insizyon tekrar açılır. Doku mühendisliği ürünü, küre şeklinde tanımlanır ve mideye ile intraabdominal viseral organlara yapışmış olabilir.Yapışıklıklar keskin bir şekilde ayrılır ve doku mühendisliği ile üretilmiş bağırsaktan bir segment geri alınır. Burada, hasat edilen segment başlangıç polimeri ile doğrudan karşılaştırılmıştır. Bu görüntüde, mühendislik ürünü bağırsağın lümeni, iç kısmını ortaya çıkarmak için keskin bir şekilde açılmıştır.Doku, histolojik analiz için fikse edilebilir veya diğer yayınlarımızda gösterdiğimiz gibi çeşitli moleküler biyolojik assayler için taze olarak kullanılabilir. Burada, tipik bir başarılı doku mühendisliği küçük bağırsak konstrüktünün düşük büyütmeli hematoksilin ve eosin boyama mikrografı gösterilmiştir. Soldaki ok, intestinal mukoza ile döşeli lümeni, sağdaki ok ise konak pankreası göstermektedir.Konstrükte yapışmış olan.

tissue-engineering-of-the-intestine-in-a-murine-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, bir fare modelinde bağırsak rezeksiyonu için ayrıntılı protokol açıklanmaktadır. Bu teknik, fare bağırsağında ileektominin neden olduğu safra emilim bozukluğu, aşırı birikim ve toksisite hakkında bilgi sağlar.

Murin İleal Rezeksiyon Modeli: Murin Modelinde İleektomi ile İndüklenen Safra Metabolizmasının İncelenmesi

Bu video, bir fare modelinde bağırsak geçirgenliğini incelemek için bir ileal döngü modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Bu yöntem, epitelyal bariyer fonksiyonunu ve buna bağlı immün yanıtı anlamak için canlı bir model sağlar.

Fare ileal döngü modeli: farede bağırsak geçirgenliğini incelemek için cerrahi bir model

Makalede, sıçan bağırsaktan bir hücresel olmayan matrisinin üretimi için bir yöntem anlatılmaktadır. Bağırsak iskelelerinin türetme hücre biyolojisi ve uyuşturucu testi kök, doku mühendisliği gelecekteki uygulamalar için önemlidir.

Doğal Aselüler Bağırsak Matrix&#39;in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

Küçük hayvan görüntüleme teknikleri seri tetkikler ve in vivo terapötik müdahaleyi sağlar. Son zamanlarda, uygulamaların kapsamı önemli genişletmiştir ve şu anda kolon tümör gelişiminin değerlendirilmesi, yara iyileşmesi ve enflamasyon izleme içerir. Bu protokol kemirgen endoskopi bu çeşitli potansiyel uygulamaları göstermektedir.

Murin için Endoskop In Vivo Karsinojenez ve bağırsak Değerlendirilmesi Multimodaller Görüntüleme Yara İyileşmesi ve İltihap

Bağırsak epitel kök hücreler (ISCs) Paneth hücreleri ile iç içe. Bu hücreler ISCs destekleyen ve antibakteriyel koruma sağlamak ISC, soyunu ayırt edilirler. İşte biz Paneth hücrelerinin bağırsak epithelia sürdürmek çok önemli bir rol oynadığını kurmak için transgenik fare koşullu modellerini nasıl kullandıklarını göstermektedir.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller<em&gt; Cre-lox</em&gt; Fare Modelleri

Burada tarlada bu tekniğin standardizasyonu teşvik etmek mortalite olmadan tekrarlanabilir yaralanma ile sonuçlanan farelerde bağırsak iskemi-reperfüzyon ayrıntılı prosedürü açıklar. Bağırsak iskemi-reperfüzyon hasarının Bu model yaralanma ve yenilenme hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Bağırsak İskemi-reperfüzyon Hasarı Murin Modeli

Bir kısmi veya tam tıkanma Şiddetli karın ağrısı, bulantı, kusma ve dışkı geçiş engelleme neden olabilir bağırsak bağırsak engelleri vardır. Bağırsak kısmi obsructions farelerde oluşturmak için bu yordamı patolojik hücre büyümesi ve ölüm bağırsak temel mekanizmaları eğitim güvenilirdir.

Bağırsak kısmi tıkanıklık bir fare modeli

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

Bu çalışmada, intestinal manipülasyon ile oluşturulan postoperatif ileusun bir murin modeli tanımlanmıştır. Gastrointestinal geçiş fonksiyonu, patolojik değişiklikler ve immün hücre aktivasyonu ameliyattan 24 saat sonra değerlendirildi.

Ameliyat Sonrası İleus Murin Modeli

Keşfedin fare modelinde doku mühendisliği yöntemlerini; organoid üniteleri ve iskelet yapı kullanarak fonksiyonel bağırsak dokusu oluşturma tekniğini öğrenin. Bu protokol rejeneratif tıp ve hastalık modelleri için temel oluşturur.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Daha fazla video keşfet