RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

Maksimum Verim sağlamak için, bitkilere bir dizi besin sağlanması gerekir, besin eksiklikleri, soğuk veya aşırı sıcaklık gibi stresler, kuraklık veya patojenler her yıl mahsul veriminde büyük kayıplara neden olur. Bu sorunların çoğunun kökeni genellikle yeraltında yatmaktadır. Kök, bitkinin fiziksel çapasıdır, ancak aynı zamanda su alımından ve azot, fosfor sülfat ve birçok eser element gibi mineral besin maddelerinin alımından sorumlu olan organdır.

Yüksek mahsul verimi elde etmek için sürdürülebilir yaklaşımlar geliştirmek istiyorsak, köklerin nasıl geliştiğini, bu geniş besin yelpazesini nasıl aldığını ve simbiyotik ve patojenik organizmalarla nasıl etkileşime girdiğini daha iyi anlamamız gerekir. Bunu yapmak için, bariz nedenlerden dolayı mikroskobik düzeyde kökleri keşfedebilmemiz gerekir. Köklerin biyolojisini incelemek, bitkinin hava kısımlarını incelemekten her zaman daha zor olmuştur.

Kökler genellikle yeraltında saklandığından, mikroskobik çalışmalar için kolayca erişilebilir değildir. Topraktan uzaklaştırma, kök sisteminde ciddi hasara neden olur ve bu nedenle davranışlarını incelemek için iyi bir yol değildir. Kökleri daha erişilebilir hale getirmenin bir çözümü, onları jeed üzerinde yetiştirmektir veya bu örnekte hidroponik ortamda gösterilmiştir.

Jöleli ortamda veya hidroponik ortamda yetiştirme planları birçok kök çalışmasında çok başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ancak bu yöntemlerle, büyüyen köke mümkün olduğunca yaklaşmak ve görüntüleme hazırlığından kaynaklanan herhangi bir fiziksel stresi önlemek için kökleri mikroskobik ayrıntılarda ve uzun süreler boyunca incelemek hala çok zordur. Kökleri büyütmemize ve görüntülememize izin veren ve aynı zamanda köklerin mikro çevresini çok yüksek hassasiyet ve hızla kontrol etmemize ve değiştirmemize izin veren bir platform oluşturuyoruz. Bu platforma kök çip adını verdik. Kök çipi, silikon bazlı bir organik polimer olan PDMS'den üretilen mikroakışkan bir cihazdır.

Çip, bir tavşan opsis fidelerinden köklerin büyümesi ve görüntülenmesi için gözlem odalarına sahiptir. Tohumlar ilk olarak katı ortamlarla doldurduğumuz plastik pipet uçlarından üretilen plastik konilerde çimlenir. Kök ucu daha sonra ortam boyunca büyür ve odadaki koşulları koruyarak sürekli bir sıvı ortam akışı yaşadığı odaya ulaşır.

Steve Quake'in Stanford Üniversitesi'ndeki laboratuvarı tarafından geliştirilen sabit mikro mekanik valfler burada kırmızı kontrol ile gösterilmiştir. Çip, tipik olarak mikroskopi için kullanılan şeffaf bir kapak camına monte edildiğinden, gözlem odasındaki tüm işlemler ters çevrilmiş bir mikroskopta izlenebilir. Akışkan akışını yönlendiren çatallı kanal yapısı mikroskop altında görülebilir.

Kök çipi iki katmandan oluşur, büyüme ortamı test çözeltilerinin gözlem odalarına aktığı kanalları içeren bir akış katmanındaki valfleri içeren bir kontrol katmanı. Bu odaların hacmi yaklaşık 400 nanolitredir. Bu, yalnızca çok küçük miktarlarda çözeltiye ihtiyaç duyulduğu ve koşulların çok hızlı bir şekilde değiştirilebileceği anlamına gelir.

Bu protokol, sekiz veya Arabidopsis fidesinin canlı köklerinin, kök çipi üzerinde paralel mikroskobik görüntüleme için nasıl hazırlandığını ve üç güne kadar gözlemlendiğini, 10 milimetrelik bir Petri kabının, ortam hala sıvı haldeyken %1 agar içeren büyüme ortamı ile doldurulmasıyla nasıl başladığını açıklar. Çok kanallı bir pipet kullanarak 10 mikrolitrelik pipet ucunu Petri kabından beş mikrolitre ortamla doldurun. Doldurulan uçlar, ortam katılaşana kadar pipet ucu kutusunda saklanır.

Daha sonra dört milimetre uzunluğunda plastik koniler halinde kesin ve katı büyüme ortamı içeren bir Petri kabına dik olarak yerleştirin. Yüzey sterilizasyonundan sonra, ortam dolgulu konilerin üzerine tek tohumlar yerleştirilir. Çanak daha sonra mikro gözenekli bantla kapatılır ve çimlenmeyi senkronize etmek için plaka dört derecede saklanır.

Üç gün sonra, plakalar çimlenmeye başlamak için bir büyüme kabinine aktarılır. Bu deneydeki büyüme koşullarımız 23 derecedir. Çimlenmeden beş ila yedi gün sonra 16 saatlik bir vurgu, sekiz saatlik karanlık döngüsünde, fide kök yonga fide sağlığı kök uzunluğuna transfer için hazır olmalı ve varsa, bir floresan işaretleyicinin ifadesi diseksiyon mikroskobu altında kontrol edilmelidir.

Fidelerin kök uçları plastik koninin alt çıkışına ulaşır ulaşmaz, tek tek fideler çip üzerine aktarılmak üzere işaretlenir. 10 ya da daha fazla: Kök çipini sterilize etmek için transfer sırasında birinin zarar görmesi durumunda bitki fidanları seçilmelidir. Uzun süreli deneyler için, cihaz dokuya sarılır, bir cam Petri kabına ve otoklava yerleştirilir.

Bu çip daha önce otoklavlandı. Buz soğuduktan sonra deney, çip sıvı büyüme ortamı ile kaplanır. Talaş tamamen örtülmelidir, ancak sıvı seviyesi talaş yüzeyi üzerinde üç milimetreden daha yüksek olmamalıdır.

Ortamı Kök girişinden ve hazne çıkışından çekmek için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanılır. Bu gözlem odasını doldurur. Ortamla, seçilen plastik koniler artık kök çipe takılır.

Koni girişlere sıkıca oturmalıdır. Kök çip ince bir optik cam tabakası üzerine monte edildiğinden, çipe çok fazla basınç uygulamamaya dikkat edilmelidir. Bu adım sırasında, çip artık çipin yüzmesini önlemek için Sıvı ortam içinde bir gece boyunca inkübasyon için hazırlanır.

Çipin üzerine biri ikiye kesilmiş iki cam slayt yerleştirilir. Manyetik bir karıştırma çubuğu eklenir ve çanak kapatılır. Düzenek şimdi, çıkışlara doğru kök büyümesini kolaylaştırmak için ortamı nazikçe çalkalayacak olan manyetik bir karıştırmaya aktarılır.

Kök çipin. İstenilen yönde büyümeyi daha da desteklemek için girişler belirli bir açıyla delinir. Çipin çıkışların karşısındaki tarafını kaldırarak düzeneği hafifçe eğin.

Çip ile aydınlatılır halka lamba Aydınlık karanlık ritmi korumak için bir zamanlayıcı anahtarına bağlanır. Gece boyunca inkübasyondan sonra, sıvı büyüme ortamı, sızdırmaz bir basınçlı şişede hazırlanır. Fidanların kurumasını önlemek için aşağıdaki adımlar hızlı ve kesintisiz bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

Çip şimdi sıvı ortamdan çıkarılır ve yine ters çevrilmiş olan talaş taşıyıcının alt açıklığına baş aşağı yerleştirilir. Çip, kontrol katmanı girişlerini içeren taraf, basınç hattının yan tarafına bakacak şekilde yönlendirilmelidir. Taşıyıcı yan duvarda iki büyük konektör.

Çipin altındaki kapak camı, kağıt mendil ile hafifçe lekelenerek kurutulur ve taşıyıcıya yapıştırılır. Bantla, tüm montaj daha sonra ters çevrilir. Boru konektörleri bir şırınga kullanılarak su ile doldurulur ve her bir boru konektörü ilgili girişe takılır.

Çip üzerinde. Boru, ortama ve çözeltiye takılıdır. Daha sonra flakon ve hava şırınga ile çözelti safrasına basınç uygulanarak hatlardan uzaklaştırılır, taşıyıcı şeffaf plastik ile kaplanır.

Düzenekte yüksek nemi korumak için, taşıyıcı mikroskop tablasına yerleştirilir. Sahnenin Çentiklerine tam olarak oturmalıdır. Talaş valfleri ve ortamın talaştan akışı hava basıncı ile kontrol edilir.

Regülatörlü iki hat, bir ana basınç hattından dallanır. Biri sıvı akışını kontrol etmek için kullanılır, diğeri ise solenoid hava valflerine bağlanır. Bu valfler, USB valf kontrolörü aracılığıyla bilgisayardan çalıştırılır ve çip üzerindeki valflerin çalıştırılmasından sorumludur.

Çip bağlanmadan önce her iki basınç regülatörü de kapatılmalıdır. Borular, konektörler ve çözelti şişeleri artık ilgili basınç hatlarına bağlanmıştır. Taşıyıcının rezervuarlarına birkaç mililitre su eklenir.

Bu adımın daha uzun deneyler boyunca tekrarlanması gerekebilir. Nemi yüksek tutmak için, mikroskoba dökülebilecek olası sıvı miktarını en aza indirmek için hacim yükünü koruyun. Deney başlayana kadar açık karanlık döngüsünü korumak için halka ışığı çip üzerindeki konumuna getirilir.

Çip üzerindeki vanalar basınç uygulanarak kapatılır, bu durumda selenoid hava vanaları açılarak yapılır. Laboratuvar görünümü arayüzü, valf numarasının altındaki düğmeye tıklayarak valflerin kontrol edilmesini sağlar. Parlak yeşil, basınç uygulandığını ve bir talaş valfinin kapandığını gösterir.

Bu şema, valf sisteminin organizasyonunu gösterirken, dört ila sekizinci valfler tek valf olarak işlev görürken, valf sıfırdan üç eyleme kadar hareket eder. Bu sisteme sahip gruplarda, ayrı bir oda, bir valf kombinasyonunun aktive edilmesiyle ele alınabilir, örneğin, sıvı akışını yalnızca üst valflerden üçüncü odaya yönlendirmek için sıfır, üç ve dört kapatılmalıdır. Ek olarak, altı, yedi ve sekizinci vana, A, B ve C girişlerini yıkamak için hangi çözeltinin kullanılacağını kontrol eder ve şimdi bunları kapatmak için üç çözelti giriş valfini de etkinleştirir.

Kontrolör arayüzü, sistemin durumunun izlenmesini sağlayan bir geri besleme döngüsüne sahiptir. Bu özellik, geri oku düğmesine tıklanarak etkinleştirilebilir. Kontrol katmanı için basınç regülatörü önce açılır ve 15 PSI'ye ayarlanır.

Daha sonra akış tabakası için regülatör açılır ve beş PSI'ye ayarlanır. Tercih edilen büyüme ortamı için giriş vanası açılır ve odacıklar ortamla yıkanır, akış yolları mikroskop altında kontrol edilmelidir. Çoğu durumda, hava kanallarda sıkışır ve çıkarılması gerekir.

Ek olarak, kontrol havasının kanalları hala dışarı atılması ve boru konektörlerinden gelen su ile değiştirilmesi gereken hava içerir. Bu işleme çıkmaz dolgu denir. Her iki görev de, tüm hava kanallardan PDMS'ye zorlanana kadar sekiz bölmenin her birinin birkaç kez yıkanmasıyla gerçekleştirilir.

Sistem, deneyleri otomatikleştirecek şekilde programlanabilir. Bu tür rutinler çipin gazını almak için de kullanılabilir. Kök çipin temel amacı, bir görüntüleme platformunu ve bir füzyon sistemini tek bir cihazda birleştirmektir.

Köklerin mikro çevresinin manipülasyonunu göstermek için, odaları boya ile yıkadık ve odalar içindeki sıvı değişimini ölçtük. Önerilen beş PSI basınçta, dakikada yaklaşık 1,5 mikrolitre hesaplanan akış hızında 10 saniye içinde tam bir değişim ölçtük. Bu durumda karanlıkta yetişen ve harici bir enerji kaynağı olarak 10 milimolar glikoz ile beslenen fidelerin kök büyümesini de gözlemledik.

Işık ve ortamın bileşimi gibi büyüme koşullarına bağlı olarak, bitkiler kök yongasında üç güne kadar gözlemlenebilir. Bu sistem, genetik olarak kodlanmış nanosensörleri ifade eden köklerde hücre içi glikoz ve galaktoz seviyelerini izlemek için kullanılmıştır. Birinci veya rezonans enerji transferine veya perdeye dayalı bu sensörler Fromer laboratuvarında geliştirilmiştir.

Bu deney için, çipteki kökler, kare glikoz darbeleri veya galaktoz çözeltisi ile perfüze edildi. Hücre içi şeker seviyeleri izlendi ve burada, alıcı floro dört sitrinin yoğunluğunun soldaki donör ECFP'nin yoğunluğuna bir oranı olarak ifade edildi. Kök ucunun ortasındaki veya oran metrik görüntüsündeki sensör sitrin miktarını gözlemliyoruz ve sağda, kırmızı ile gösterilen yeşil ve galaktozda tekrarlanan üç kare glikoz darbesine yanıt olarak şeker miktarını izliyoruz.

Orandaki artış, şeker birikimini gösterir. Kök çipinin geleneksel büyüme yöntemlerine göre temel avantajları, mikroskopi için minimal invaziv hazırlık, kök ortamını geri dönüşümlü ve tekrar tekrar değiştirme yeteneği ve gelişimsel olarak yetkin ve fizyolojik olarak sağlıklı dokuyu günler boyunca sürekli gözlemleme kapasitesidir. Bir diğer gerçekten önemli avantaj, köklere zaman içinde gerekli tüm besinleri sağlamak için yalnızca minimum miktarda sıvıya ihtiyaç duyulmasıdır.

Bu, özellikle pahalı reaktifler uygulandığında, kök yongasını çok uygun maliyetli hale getirir. Kök yongasını optimize etmeye ve kullanılabilirliğini genişletmeye devam ediyoruz çünkü bu önemli organı tedaviler ve gözlem için daha erişilebilir hale getirerek, kök yongası gibi mikroakışkan araçların potansiyel olarak bitki araştırmalarında yeni boyutlar açacağına inanıyoruz. Bir kök çip sisteminin nasıl oluşturulacağı hakkında daha fazla bilgiyi web sitemizde bulabilirsiniz.

Cipsler Stanford Foundry'den sipariş edilebilir.