Name: Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, büyük ünilamellar veziküller kullanarak BCL-2 aile proteinlerinin mitokondriyal membran etkileşimlerini incelemeyi. Bu biyokimyasal yöntem, apoptoz düzenlenmesi ve membran geçirgenliği araştırmalarında değerli bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Meslektaşlıkları ve destekleri için Chipuk Laboratuvarı'nın tüm üyelerine teşekkür ederiz. Ayrıca, bu çalışmanın deneysel temelini geliştirdikleri için Tomomi Kuwana ve Donald Newmeyer'a şükranlarımızı sunarız. Bu çalışma şunlar tarafından desteklenmiştir: NIH CA157740 (J.E.C.'ye) ve NIH P20AA017067'den bir pilot proje (J.E.C.'ye). Bu çalışma ayrıca kısmen March of Dimes Foundation'dan alınan 5-FY11-74 numaralı Araştırma Bursu (J.E.C.'ye) ile desteklenmiştir.

1. Lipidleri Birleştirin ve Bir Lipid Film Oluşturun
<ol>
	<li>Minimum aydınlatmanın olduğu bir çeker ocakta çalışırken, kloroformda çözünmüş lipidler, kloroformla durulanmış bir Hamilton gaz sızdırmaz cam şırınga kullanılarak 1.5 ml amber renkli cam flakona aktarılır. Bu kombinasyon yaklaşık 4 mg lipid sağlayacaktır (Şekil 1A).
	<ul>
		<li>Kardiyolipin 10 mg/ml (CL) - 63 μl</li>
		<li>Fosfatidilkolin 10 mg/ml (PC) - 84 μl</li>
		<li>Fosfatidiletanolamin 10 mg/ml (PE) - 125 μl</li>
		<li>Fosfatidilinositol 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl</li>
		<li>Fosfatidilserin 10 mg/ml (PS) - 65 μl</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Kloroformu uzaklaştırmak için flakona hafif bir inert gaz (örneğin, azot veya argon) akımı uygulayın. Kuruduğunda, genellikle 2 - 3 saat süren bu işlem sonucunda flakonun alt ve yanlarında bir lipid filmi görünür hale gelecektir (Şekil 1A).</li>
</ol>
2. Lipozom Çözeltisinin Hazırlanması
<ol>
	<li>1.7 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde, LUV tamponu (0.2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) içerisinde 500 μl 12.5 mM ANTS ve 500 μl 45 mM DPX hazırlayın (Şekil 1B).</li>
	<li>ANTS ve DPX çözeltilerini birleştirin, 1 dk boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında 1 dk boyunca sonikasyon uygulayın. Sonikasyon, ultrasonik bir su banyosunda gerçekleştirilir (örneğin, Branson 3510MTH, herhangi bir ayar yapmadan, sadece 'açık' konumda). Bu işlem, çözeltilerin tamamen çözünmesini ve homojen hale gelmesini sağlar.</li>
	<li>ANTS/DPX çözeltisini lipid filme ekleyin ve flakonu parafilm ile mühürleyin (Şekil 1B).</li>
	<li>Lipid filme yukarıdaki su banyosunda 5 dk boyunca sonikasyon uygulayın. Sonikasyon sonrası çözelti sütlü bir görünüm alacaktır. Lipid filmin tamamen çözündüğünden emin olun, çünkü küçük lipid agregatları sonraki aşamaları olumsuz etkileyecektir. Ayrıca, kalan lipid film olmadığından emin olmak için flakonun yanlarını ve tabanını kontrol edin (Şekil 1B).</li>
</ol>
3. Lipozomların Ekstrüzyonu ve Saflaştırılması
<ol>
	<li>Ekstrüderi, filtre desteklerini ve polikarbonat membranı nemlendirmek için LUV tamponu kullanarak üretici kılavuzuna göre monte edin. Ekstrüzyon sırasında hacim kaybı olmayacak şekilde ünitenin gövdesini sıkın, ancak membranı yırtacak kadar aşırı sıkmayın. Sızıntı veya sorun olmadığını doğrulamak için ekstrüderi LUV tamponu ile test etmek de yerinde olacaktır.</li>
	<li>Lipid çözeltisi sağ şırıngadayken başlayın, lipid çözeltisini 31 kez ekstrüde edin; LUV'lar sol şırıngada toplanacaktır; bu, tüm lipidlerin membrandan en az bir kez geçtiğinden emin olmanızı sağlar. İlk birkaç seferde membrandan geçmek için biraz daha fazla basınç gerekebilir. Çözelti aniden membrandan hızla geçerse, membranda yırtılma olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse değiştirin (Şekil 1C).</li>
	<li>10 ml'lik bir Sepharose S-500 yerçekimi akış kolonu (1,0 cm x 20 cm, 10 ml boncuk hacmi) hazırlayın. 3 kolon hacmi LUV tamponu ile yıkayın, kolon akışının durmasını bekleyin ve kapağını kapatın. Bu adım zaman aldığı için, yıkama işlemine lipidler kurutulmak üzere birleştirildiğinde başlamak tercih edilir. Kullanmaya hazır olana kadar kolonun kapağını kapalı tutun.</li>
	<li>Ekstrüde edilmiş LUV'ları tek bir adımda kolona ekleyin, boncuk arayüzünü bozmaktan kaçının. Tamponun kolondan tamamen akmasını bekleyin, akış durduğunda tıkacı takın. Kolonu nazikçe LUV tamponu ile doldurun. Boncukların yerinden oynamaması için tampon eklerken tekrar dikkatli olun (Şekil 1C).</li>
	<li>Tıkacı çıkarın ve 6 x 1 ml fraksiyon toplayın. LUV'lar normalde 3. ve 4. fraksiyonlarda elüe olur ve bulanık görünümle tanımlanabilir. Fraksiyonlar toplandıktan sonra kolonu 5 hacim su ve 2 hacim %20 etanol ile yıkayın. Kolonu 4 °C'de saklayın (Şekil 1C).</li>
	<li>Fraksiyonları test edilene kadar 4 °C'de, karanlıkta saklayın.</li>
</ol>
4. Kolon Fraksiyonlarının Test Edilmesi
<ol>
	<li>Kolon fraksiyonları, LUV tamponu ile 0,5% CHAPS eklenmiş LUV tamponu karşılaştırılarak floresan açısından test edilir. CHAPS varlığı nedeniyle floresansı artan fraksiyonlar LUV içerir. Altı kuyucuğun her birine 100 μl LUV tamponu veya LUV tamponu + 0,5% CHAPS pipetleyin, uygun fraksiyondan 5 μl ekleyin ve karıştırın. Tüm LUV çalışmaları için opak, siyah, işlem görmemiş 96 kuyucuklu plakalar kullanın (Şekil 1D).</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de şu parametrelerle okuyun: Eksitasyon dalga boyu: 355 nm; Emisyon dalga boyu: 520 nm; Kazanç (voltaj): 125; Optik konumu: Üst; Okuma yüksekliği: 5,5 mm. Bu kurulum, Gen 5 2.0 yazılımı kullanan BioTek H1 Synergy cihazı içindir (Şekil 1D).</li>
	<li>3. ve 4. fraksiyonlar genellikle floresansta 5 - 10 kat artış gösterir. Analiz edildikten sonra, LUV içeren fraksiyonları birleştirin ve 4 °C'de karanlıkta saklayın; yaklaşık 2 ml ~ 2 mM lipid saflaştırılmış olacaktır (Şekil 1D).</li>
</ol>
5. LUV'ler Kullanılarak BCL-2 Ailesi Çalışmaları
<ol>
	<li>BCL-2 proteinlerinin LUV permeabilizasyonunu doğrudan indükleme yetenekleri ve permeabilizasyon aktivitesinin regülasyonu test edilir. LUV analizleri normalde 37 °C'de, 100 μl hacimlerde gerçekleştirilir ve ya 30 - 60 dk sonraki tek bir zaman noktasında (Şekil 2A-C, 3A-B) ya da 1 saate kadar her 1 - 2 dk'da bir kinetik çalışmalar aracılığıyla (Şekil 2D) analiz edilebilir. Bileşenleri, stok/final konsantrasyonlarını ve ekleme sırasını açıklayan temsili bir analiz tasarımı sunulmuştur (Tablo 1). Ayrıca, mikroplaka okuyucunun her okuma öncesinde plakayı hafifçe sallaması önerilir. İlk birkaç dakika genellikle sporadik okumalar verir (muhtemelen sıcaklık değişimleri, karıştırma vb. nedeniyle), bu nedenle kinetik bir çalışmadaki veri noktalarını genellikle 2 - 3 okumadan sonrası için dikkate alırız. Ayrıca, LUV partileri arasındaki değişkenlik ve aktivasyon veya inhibisyonun sınır konsantrasyonlarındaki protein etkileşimlerinin verimliliği nedeniyle bazı koşullar için büyük hata çubuklarının oluşması da yaygındır.</li>
	<li>BCL-2 ailesi protein stokları, LUV tamponu içinde 100x konsantrasyonda seyreltilmeli ve BID yokluğunda minimal BAX-bağımlı LUV permeabilizasyonunu saptamak ve BAX ile BID arasında anlamlı bir sinerji bulmak için gerekli olan en düşük konsantrasyonları belirlemek amacıyla BAX, BID ve diğer tüm proteinlerin gerekli titrasyonları yapılmalıdır. Ayrıca, protein israfını azaltmak ve sonraki protein eklemelerinin konsantrasyonlarını minimize etmek için diğer tüm proteinlerin titrasyonları gereklidir.</li>
</ol>
6. Temsili Sonuçlar
LUV permeabilizasyonunun BCL-2 ailesine bağımlı regülasyonunu gözlemlemek ve incelemek için çok sayıda seçenek mevcuttur. LUV permeabilizasyonu pozitif kontrolü oluşturmak için deterjanla aktive edilmiş BAX12 kullanıyoruz. Deterjan n-oktil-β-D-glukozid (OG), BAX aktivasyonunu yapay olarak tetikler (100 μl 2,3 μM OG-BAX için: LUV tamponu içerisinde 5 μg BAX + %0,7 OG, 4 °C'de 60 dk inkübe edin, alikotlayın ve -80 °C'de saklayın); bu nedenle OG-BAX (10 - 100 nM) güvenilir bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Not olarak, %0,025'in altındaki OG konsantrasyonları LUV permeabilizasyonunu doğrudan etkilemez. Deney başına maksimum LUV floresans miktarını belirlemek için %0,5 CHAPS uygulaması kullanılır ve bu değer %100 değerini belirler. Tüm uygulamalar üç tekrarlı olarak hazırlanmalıdır. Örnek bir LUV kontrol deneyi kurulumu Tablo 1'de gösterilmiş olup, ilgili veriler Şekil 2A'da sunulmuştur.
BCL-2 ailesi proteinleri ile LUV permeabilizasyonunu çalışmak için gerekli olan başlangıç noktası, optimal salınımı teşvik edecek BAX ve BID konsantrasyonlarını belirlemektir. Münferit protein preparasyonları farklı arka plan permeabilizasyon aktiviteleri göstereceğinden, daha karmaşık analizler kurulmadan önce titrasyon yapılması önerilir. BAX (50 - 200 nM) ve BID (0 - 10 nM), sırasıyla Şekil 2B-C'de gösterildiği gibi, minimum arka plan salınımı ve optimal sinerji için titre edilmelidir. BID proteininin çeşitli formları R&amp;D Systems'dan satın alınabilir; alternatif olarak, BID BH3 domain peptidi Anaspec'den temin edilebilir. LUV assayleri için uygun olan ticari bir BAX formu bulunmamaktadır, bu nedenle yayınlanmış yöntemler kullanılarak eksprese edilmeli ve saflaştırılmalıdır3,13.
BAX ve BID konsantrasyonları ile sinerji belirlendikten sonra, yaygın bir analiz yöntemi, anti-apoptotik proteinlerin BAX ve BID bağımlı LUV permeabilizasyonu üzerindeki etkisini belirlemektir. BCL-xL, ticari olarak temin edilebilen anti-apoptotik bir BCL-2 üyesidir ve doz bağımlı bir şekilde, genellikle BAX veya BID'nin 5 - 10 kat molar fazlası aralığında BAX ve BID aktivitesini inhibe eder (Şekil 3A). Bu inhibisyon etkisi, BCL-xL'ye bağlanan ve böylece BAX ve BID'nin sinerji göstermesine ve LUV'leri permeabilize etmesine olanak tanıyan sonraki BH3-yalnız proteinlerin (BCL-xL'ye 2 - 5 kat molar fazlalık) veya BH3 domain peptidlerinin (BCL-xL'ye 5 - 10 kat molar fazlalık) eklenmesiyle geri döndürülebilir (Şekil 3B). Şekil 3B'de, tam uzunluktaki rekombinant insan PUMAβ'nın etkisini gösteriyoruz; PUMA BH3 domain peptidi fonksiyonel olarak benzerdir (veriler gösterilmemiştir)8. PUMA proteini, BCL-xL'nin BAX ve BID üzerindeki inhibisyon etkisini ortadan kaldırdığı için bu deney yaygın olarak bir 'de-represyon analizi' olarak adlandırılır. İdeal olarak, de-represyon yapan BH3-yalnız protein/peptid eklemesinin BAX aktivasyonu üzerinde minimum etkiye sahip olması gerekir14.
<img alt="Lipid synthesis and purification process diagram; chromatography and fraction analysis steps detailed." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Şekil 1. (A) Kloroformda çözünmüş lipidler birleştirilir, bir lipid film oluşturmak için kurutulur ve kapatılır. (B) ANTS ve DPX çözeltileri hazırlanır, birleştirilir ve tam çözünme ile homojenizasyonu sağlamak için sonikasyona tabi tutulur. Çözelti lipid filme eklenir, flakon parafilm ile kapatılır ve bir su banyosunda 5 dakika boyunca sonike edilir. Çözelti bu aşamadan sonra sütümsü bir görünüm alacaktır. (C) Sonikasyona tabi tutulmuş lipid çözeltisi mini-ekstrüdere yüklenir, 31 kez işleme tabi tutulur ve ardından saflaştırma işlemi için hazırlanmış bir Sepharose S-500 kolonuna eklenir. (D) Boyut dışlama kromatografisi sonrası elde edilen fraksiyonlar, LUV tamponu ile LUV tamponu + %0,5 CHAPS içerisindeki bağıl floresan birimlerinin (RFU) karşılaştırılmasıyla analiz edilir. "LUV tamponu" okuması, bozulmamış LUV'ların arka plan floresansını gösterir; "LUV tamponu + %0,5 CHAPS" koşulu ise LUV'ların göstergesi olan, lizis kaynaklı floresans artışını gösterecektir. LUV'lar genellikle 3. ve 4. fraksiyonlarda bulunur ve analizden sonra birleştirilir. 5. ve 6. fraksiyonlar, bünyeye katılmamış ANTS (yani, (ekstrüzyon sonrası LUV'lerin içinde değil), CHAPS'ten bağımsız olarak yüksek floresans göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4291/4291fig1large.jpg" target="_blank"> Şekli büyütmek için buraya tıklayın</a>.
<img alt="BAX ve BID titrasyon etkilerini gösteren LUV permeabilizasyon sütun grafikleri; zamana karşı floresan yoğunluğu grafiği." fo:content-width="5.45in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. LUV'ler kullanılarak yapılan BCL-2 ailesi kontrol deneyleri ve BAX/BID titrasyonları. (A) Kontrol deneyleri. LUV'ler yalnızca LUV tamponu, %0,025 oktilglukozid "OG", 50 nM BAX veya 50 nM OG-BAX ile işleme tabi tutulmuştur. LUV'ler 37 °C'de 60 dk inkübe edilmiştir. Permeabilizasyon yüzdesi (%), tüm örneklerdeki floresans değerinden tampon uygulamasındaki floresansın çıkarılmasıyla belirlenmiştir; %100 permeabilizasyon, %0,5 CHAPS ile solubilize edilmiş bir örnekle belirlenmiştir; % LUV permeabilizasyonunu elde etmek için deneysel değerler CHAPS değerine bölünmüştür. OG-BAX, deterjanla aktive edilmiş BAX'tır ve LUV permeabilizasyonu için güvenilir bir pozitif kontroldür. (B) Optimal BAX konsantrasyonunun belirlenmesi. LUV'ler, 10 nM C8-BID "BID" varlığında artan BAX konsantrasyonları (50 - 200 nM) veya yalnızca tampon ile işleme tabi tutulmuştur. (C) Optimal BID konsantrasyonunun belirlenmesi. LUV'ler, 100 nM BAX varlığında artan BID konsantrasyonları (0 - 10 nM) ile işleme tabi tutulmuştur. (D) Bir LUV permeabilizasyon kinetik veri seti örneği. LUV'ler BAX (100 nM) ± BID (10 nM) ile işleme tabi tutulmuştur. Ölçümler 30 dk boyunca her iki dakikada bir, her okuma öncesinde iki saniyelik hafif plaka sallama işlemi ile gerçekleştirilmiştir. İlk üç okuma (0, 2 ve 4 dk) grafiğe dahil edilmemiştir. Minimum ve maksimum bağıl floresan birimleri (RFU), bölüm 4.3'te açıklandığı şekilde belirlenmiştir. Şekil 2A-C'deki hata çubukları, üç tekrarlı verilerin standart sapmasını temsil etmektedir. 2D'deki veriler, çift tekrarlı bir analizi temsil etmektedir.
<img alt="LUV permeabilizasyon sütun grafikleri; BID/BAX/BCL-xL ve PUMA etkisi; deneysel analiz." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. LUV'lar kullanılarak incelenen yaygın BCL-2 ailesi etkileşimlerine örnekler. (A) BAX ve BID aracılı LUV permeabilizasyonu, BCL-xL tarafından inhibe edilir. LUV'lar 100 nM BAX, 10 nM BID ve artan konsantrasyonlarda BCL-xL (0 - 500 nM) ile inkübe edilmiştir. LUV'lar 37 °C'de 60 dk boyunca inkübe edilmiştir. (B) PUMA, BAX ve BID fonksiyonunu desteklemek için BCL-xL'nin baskılamasını kaldırır. LUV'lar 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL ve (0 - 2.5 μM) PUMA kombinasyonları ile 37 °C'de 60 dk boyunca inkübe edilmiştir. Yalnızca BAX ile birlikte 2.5 μM PUMA kullanılmıştır. Hata çubukları, üç tekrarlı verilerin standart sapmasını temsil etmektedir.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ekleme sırası:</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOŞULLAR</td>
			<td>LUV 
			Tamponu</td>
			<td>OG 
			(0.7%)</td>
			<td>BAX 
			(2.3 μM)</td>
			<td>OG-BAX 
			(2.3 μM)</td>
			<td>CHAPS 
			(10%)</td>
			<td>LUV'ler 
			(2 mM)</td>
			<td>TOPLAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampon</td>
			<td>95 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG (0.015%)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAX (50 nM)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td>-</td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG-BAX (50 nM)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS (0.5%)</td>
			<td>90 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. OG-BAX'ın LUV geçirgenleşmesi üzerindeki etkisini belirlemek için bir kontrol deneyi örneği.

<ol><li>Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCL-2+family+reunion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The BCL-2 family reunion.</a> Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+ten+minutes+to+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: ten minutes to dead.</a> Cell. 121, 671-674 (2005).</li>
<li>Gavathiotis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAX+activation+is+initiated+at+a+novel+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAX activation is initiated at a novel interaction site.</a> Nature. 455, 1076-1081 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+trigger+apoptosis%2C+Bak+exposes+its+BH3+domain+and+homodimerizes+via+BH3%3Agroove+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions.</a> Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bak+activation+for+apoptosis+involves+oligomerization+of+dimers+via+their+alpha6+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices.</a> Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).</li>
<li>Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-triggered+structural+reorganization+drives+the+activation+of+proapoptotic+BAX%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX.</a> Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+apoptosis+induction+by+inhibition+of+the+anti-apoptotic+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).</li>
<li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+BH3+domains+either+sensitize+or+activate+mitochondrial+apoptosis%2C+serving+as+prototype+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipids+cooperate+to+form+supramolecular+openings+in+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane.</a> Cell. 111, 331-342 (2002).</li>
<li>Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+by+tBid+initiates+an+ordered+series+of+events+culminating+in+membrane+permeabilization+by+Bax%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax.</a> Cell. 135, 1074-1084 (2008).</li>
<li>Hsu, Y. T., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonionic+detergents+induce+dimerization+among+members+of+the+Bcl-2+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family.</a> J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bax%3A+coregulation+of+dimer+formation+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization.</a> Cell. 103, 645-654 (2000).</li>
<li>Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+other+than+Bim+and+Bid+can+directly+activate+Bax%2FBak%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak.</a> J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

LUV'lerin oluşturulması için açıklanan bu yöntem, çeşitli BCL-2 ailesi proteinlerinin, peptidlerin ve ilgili reaktiflerin fonksiyonlarını, OMM'ye benzer biyokimyasal olarak tanımlanmış bir membran ortamında test etmek için hızlı ve verimli bir yol sunar. LUV permeabilizasyonunu belirlemek için uç nokta değerleri kullanılıyorsa, tek bir gün içinde yüzlerce koşulu analiz etmek üzere birden fazla plaka hazırlanabilir. Bu analizlerde sınırlayıcı reaktiflerin genellikle rekombinant proteinlerin kalitesi ve miktarı olduğunu gö...

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-Glisero-3-Fosfo&amp;#8211;etanolamin &quot;PE&quot;</td><td>Avanti</td><td>850725C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidilkolin (Yumurta, Tavuk) &quot;PC&quot;</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidilinozitol (Karaciğer, Sığır) &quot;PI&quot;</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidilserin (Beyin, Domuz) &quot;PS&quot;</td><td>Avanti</td><td>8400320</td><td></td></tr><tr><td>Kardiyolipin (Kalp, Sığır - Sodyum Tuzu) &quot;CL&quot;</td><td>Avanti</td><td>840012C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-ekstrüder seti</td><td>Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>PC membran 0.2 mM</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Costar siyah 96 kuyucuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td></td></tr><tr><td>Kaspaz-8 ile kesilmiş insan BID</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>882-B8-050</td><td></td></tr><tr><td>İnsan BCL-xL (C-terminus hariç)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>894-BX-050</td><td></td></tr><tr><td>BID/PUMA BH3 domain peptidleri</td><td>Anaspec</td><td>61711/62404</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 hibrit çok modlu mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Yok</td><td></td></tr></tbody></table>

büyük ünilamellar veziküller ile incelenmesi bcl-2 aile fonksiyonu

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

BCL-2 (B hücresi CLL/Lenfoma) ailesi, hücre sağkalımını sürdürmek veya apoptozu başlatmak için birlikte çalışan yaklaşık yirmi proteinden oluşmaktadır1Hücresel stres sonrası (örneğin, DNA hasarı), pro-apoptotik BCL-2 ailesi efektörleri BAK (BCL-2 antagonist killer 1) ve/veya BAX (BCL-2 ilişkili X proteini) aktive olur ve mitokondriyal dış membran permeabilizasyonu (MOMP) olarak adlandırılan süreç aracılığıyla dış mitokondriyal membranın (OMM) bütünlüğünü bozar1MOMP gerçekleştikten sonra, pro-apoptotik proteinler (ör. sitokrom c) sitoplazmaya geçer, kaspaz aktivasyonunu teşvik eder ve hızla apoptoz gerçekleşir2.
BAK/BAX'ın MOMP'yi tetikleyebilmesi için, BID (BH3-etkileşimli alan agonisti) gibi BCL-2 ailesinin pro-apoptotik başka bir alt kümesi olan BCL-2 homoloji alanı 3 (BH3)-yalnızca proteinleri ile geçici etkileşimlere girmeleri gerekir3-6. Anti-apoptotik BCL-2 ailesi proteinleri (örneğin, BCL-2 ilişkili gen, uzun izoform, BCL-xL; myeloid hücre lökemisi 1, MCL-1), BAK/BAX ve BAK/BAX aktivasyonunu doğrudan tetikleyebilen BH3-yalnızca proteinler arasındaki etkileşimleri sıkı bir şekilde kontrol ederek hücresel sağkalımı düzenler7,8. Ek olarak, anti-apoptotik BCL-2 proteininin kullanılabilirliği; anti-apoptotik üyelere bağlanarak onları inhibe eden BAD (BCL-2 antagonist of cell death) veya PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis) gibi sensitize edici/de-represör BH3-yalnızca proteinler tarafından da belirlenir7,9. Anti-apoptotik BCL-2 repertuvarının çoğu OMM'de lokalize olduğu için, hücrenin sağkalımı sürdürme veya MOMP'yi tetikleme kararı, bu membrandaki çoklu BCL-2 ailesi etkileşimleri tarafından yönetilir.
Büyük unilamelar veziküller (LUV'ler), BCL-2 ailesi etkileşimleri ile membran geçirgenleşmesi arasındaki ilişkileri incelemek için kullanılan biyokimyasal bir modeldir10. LUV'ler, solventle ekstrakte edilmiş Xenopus mitokondrilerinin lipid kompozisyon çalışmalarında belirlenen oranlarda birleştirilmiş tanımlı lipidlerden (46,5% fosfatidilkolin, 28,5% fosfatidiletanolamin, 9% fosfatidilinositol, 9% fosfatidilserin ve 7% kardiyolipin) oluşur10. Protein ve lipid bileşenleri tamamen tanımlanmış ve yönetilebilir olduğundan, bu sistem BCL-2 ailesi fonksiyonlarını doğrudan incelemek için uygun bir modeldir; bu durum primer mitokondrilerde her zaman geçerli değildir. Kardiyolipin düzeyi OMM boyunca genellikle bu kadar yüksek olmasa da, bu model BCL-2 ailesi fonksiyonunu desteklemek için OMM'yi sadık bir şekilde taklit eder. Ayrıca, yukarıdaki protokolün daha yeni bir modifikasyonu, polyanyonik bir boya (ANTS: 8-aminonaftalin-1,3,6-trisülfonik asit) ve katyonik sönümleyici (DPX: p-ksilen-bis-piridinyum bromür) içeren LUV'lere dayalı olarak, protein etkileşimlerinin kinetik analizlerine ve membran geçirgenleşmesinin gerçek zamanlı ölçümlerine olanak tanır11. LUV'ler geçirgenleştiğinde, ANTS ve DPX birbirinden uzaklaşır ve floresan artışı tespit edilir. Burada, ANTS/DPX içeren LUV'ler kullanılarak gerçekleştirilen, yaygın olarak kullanılan rekombinant BCL-2 ailesi protein kombinasyonları ve kontrolleri açıklanmaktadır.

Biyokimyasal olarak tanımlanmış büyük tek tabakalı veziküller (LUV'ler), BCL-2 ailesi etkileşimlerini analiz etmek için uygun bir model sistemdir ve apoptozun mitokondriyal yolunun daha iyi anlaşılmasında doğrudan etkileri vardır. LUV üretme yöntemiyle birlikte, LUV permeabilizasyonunu incelemek için standart BCL-2 ailesi protein kombinasyonları ve kontroller sunulmaktadır.

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

BCL-2 (B hücresi CLL/Lenfoma) ailesi, hücre sağkalımını sürdürmek veya başlatmak için birlikte çalışan yaklaşık yirmi proteinden oluşmaktadır...

Büyük Ella Veziküllerinden oluşan bu biyokimyasal olarak tanımlanmış model sistem, BCL 2 proteinlerinin in vitro fonksiyonlarını gözlemlemek için dış mitokondriyal membranı taklit eder. İlk olarak, lipidleri birleştirin ve sızdırmaz bir flakon içerisinde lipid film oluşturun. Ardından taze LUV çözeltisi hazırlayın ve lipid filmi çözünürlüğe kavuşturun.Ardından, lipid çözeltisini ekstrüde edin ve büyük LUV'leri jel filtrasyonu ile saflaştırın. Son adım, LUV'lerin deterjan kaynaklı floresans artışı açısından analiz edilmesidir. Nihayetinde, LUV model sistemi, rekombinant BCL 2 proteinleri gibi membran geçirgen proteinlerin fonksiyonunu ve düzenlenmesini değerlendirmek için kullanılır.Büyük unilameller veziküllerin kullanıldığı bu yaklaşımın, mitokondri gibi mevcut sistemlere göre çeşitli avantajları vardır. Bunlar, proteinlerin yokluğunda saflaştırılmış lipidlerle oluşturuldukları için hem bileşim hem de boyut açısından biyokimyasal olarak tanımlanmışlardır.Soruşturmanızdaki tek proteinlerin sizin ekledikleriniz olması, sonuçların net bir şekilde yorumlanmasına olanak tanır. Bu yöntem, BCL 2 ailesinin dış mitokondriyal membran bütünlüğünü düzenleme yeteneğine dair mekanistik içgörüle

examining-bcl-2-family-function-with-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Ayrılmış faz dev unilamellar veziküller (GUVs) üzerinde deneyler sık fizyolojik çözüm koşulları ihmal. Bu çalışma yüksek tuzluluk arabellek etkisi ücret uygulamasının GUVs trans-membran çözüm asimetri ve sıcaklık sıvı-sıvı faz ayrılmaya bir fonksiyonu olarak çalışmaya yaklaşımlar sunar.

Şarj edilmiş veziküller Floresans mikroskobu ile izlenen simetrik ve asimetrik çözüm koşullarda davranışını faz

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Burada, hücre dışı veziküllerde (EV'ler) otofagozom belirteç LC3-II seviyelerini immünoblotlama ile özlü bir şekilde değerlendirmek için metodolojiyi sunuyoruz. EV'lerde, otolizozom oluşumunda ve omegazom oluşumunda LC3-II seviyeleri için analiz, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II-pozitif EV'lerin salınmasında STX6'nın yeni rolünü göstermektedir.

Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

MEG küçük çocuklar için ölçekli sistemleri gelişiyle beyin gelişimini incelemek için önemli yeni fırsatlar açılır. Çocukların kapasitelerini deneysel gereksinimleri hizalar bir protokol ile birlikte yeni sistem, üç ila altı yaş arasındaki sağlıklı, uyanık çocukların bilişsel ve dil süreçleri incelemek için kullanılabilir.

Özel Ölçekli MEG ile Okul Öncesi Çocuk Neuromagnetic Beyin Fonksiyonu Ölçümleri

Öğrenin, büyük ünilamellar veziküller kullanarak BCL-2 aile proteinlerinin mitokondriyal membran etkileşimlerini incelemeyi. Bu biyokimyasal yöntem, apoptoz düzenlenmesi ve membran geçirgenliği araştırmalarında değerli bir platform sunar.

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

Daha fazla video keşfet