Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

Büyük Ella Veziküllerinden oluşan bu biyokimyasal olarak tanımlanmış model sistem, BCL 2 proteinlerinin in vitro fonksiyonlarını gözlemlemek için dış mitokondriyal membranı taklit eder. İlk olarak, lipidleri birleştirin ve sızdırmaz bir flakon içerisinde lipid film oluşturun. Ardından taze LUV çözeltisi hazırlayın ve lipid filmi çözünürlüğe kavuşturun.

Ardından, lipid çözeltisini ekstrüde edin ve büyük LUV'leri jel filtrasyonu ile saflaştırın. Son adım, LUV'lerin deterjan kaynaklı floresans artışı açısından analiz edilmesidir. Nihayetinde, LUV model sistemi, rekombinant BCL 2 proteinleri gibi membran geçirgen proteinlerin fonksiyonunu ve düzenlenmesini değerlendirmek için kullanılır.

Büyük unilameller veziküllerin kullanıldığı bu yaklaşımın, mitokondri gibi mevcut sistemlere göre çeşitli avantajları vardır. Bunlar, proteinlerin yokluğunda saflaştırılmış lipidlerle oluşturuldukları için hem bileşim hem de boyut açısından biyokimyasal olarak tanımlanmışlardır.

Soruşturmanızdaki tek proteinlerin sizin ekledikleriniz olması, sonuçların net bir şekilde yorumlanmasına olanak tanır. Bu yöntem, BCL 2 ailesinin dış mitokondriyal membran bütünlüğünü düzenleme yeteneğine dair mekanistik içgörüler sağlayabilir. Ayrıca, membran yeniden şekillenmesi ve geçirgenlik aktivitesini araştıran diğer sistemlere de uygulanabilir.

Buna mitokondriyal dinamik mekanizması veya bakteri şeklinde oluşan toksinler dahil olacaktır. Minimum aydınlatmanın olduğu bir çeker ocakta çalışın. Hamilton Gast tipi bir cam şırıngayı kloroform ile durulayın.

Ardından, 1,5 mililitrelik bir GL cam şişede, kloroform ile çözünmüş dört miligram lipidi birleştirin. Daha sonra kloroformu uzaklaştırmak için azot veya argon gibi inert bir gazla hafif bir akım uygulayın. İki ila üç saat sonra, LUV tamponu içindeki şişenin alt ve yanlarında kuru bir lipid film oluştuğunu doğrulayın.

Polyaniyon boya ve CAS iyonik söndürücünün 500 microliter çözeltilerini hazırlayıp vortexleyin. Çözeltileri karıştırın. Ardından A NTS ve DPX çözeltilerini birleştirip bir dakika boyunca vortexleyin ve çözeltilerin tamamen çözündüğünden ve homojen olduğundan emin olmak için ultrasonik su banyosunda sonikasyon uygulayın.

Şimdi A-N-T-S-D-P-X çözeltisini lipid filmine ekleyin ve şişeyi parafilm ile kapatıp lipid filmini beş dakika boyunca sonikasyona tabi tutun; sonikasyon sonrası çözelti sütümsü bir görünüm alacaktır. Küçük lipid agregatları sonraki adımları olumsuz etkileyeceğinden, çözeltinin tamamen çözündüğünden emin olun. Ayrıca, şişenin alt ve yan kısımlarında kalan lipid filmi olup olmadığını kontrol edin.

Filtre desteklerini ve polikarbonat membranı nemlendirmek için LUV tamponu kullanarak ekstrüderi üretici kılavuzuna göre monte edin; ekstrüzyon sırasında hacim kaybı yaşanmaması için ünitenin gövdesini sıkın, ancak membranı yırtmamak için aşırı sıkmayın. Sızıntı veya sorun olmadığından emin olmak için ekstrüderi LUV tamponu ile test edin. Şimdi sağ şırıngayı lipid solüsyonu ile doldurun ve büyük ELLA veziküllerinin membrandan en az bir kez geçmesi için 31 kez ekstrüzyon yapıp sol şırıngada toplayın. Solüsyon aniden hızlı bir şekilde membrandan geçerse, ilk birkaç ekstrüzyon biraz daha fazla basınç gerektirebilir.

Membranı yırtılma açısından kontrol edin ve gerekirse değiştirin. Kolona tek seferde ekleyin. Boncuk arayüzünün bozulmamasına dikkat edin.

Tampon çözeltinin kolondan akıp bitmesini bekleyin. Akış durduğunda, kolonu tıkayın ve boncukları yerinden oynatmadığınızdan emin olarak nazikçe LUV tamponu ile doldurun. Ardından tıkacı çıkarın ve altı adet bir mililitrelik fraksiyon toplayın.

AUV'ler normalde üçüncü ve dördüncü fraksiyonlarda elüe olur ve bulanık görünümle tanımlanabilir; kolon yıkamasını geri dönüştürmek ve dört degrees Celsius'ta saklamak için bu durum kullanılır. Kolon fraksiyonundaki UUV'ler, chaps varlığına bağlı olarak floresan artışı ile tespit edilir. Tüm LUV çalışmaları için siyah opak 96 kuyucuklu plakalar kullandığınızdan emin olun.

Altı kuyucuğun her birine 100 µL LUV tamponu veya %0,5 chaps içeren LUV ekleyin. Her birine uygun fraksiyondan 5 µL ekleyin ve biotech H one synergy için karıştırın. Gen five 2.0 yazılımını açın, eksitasyon dalga boyunun 355 nm ve emisyon dalga boyunun 520 nm olduğunu doğrulayın.

Üst kısımdaki 125 optik konumunda kazanç voltajını ayarlayın ve okuma yüksekliğini 5,5 milimetreye yükseltin. Şimdi plakayı 37 °C'de okuyun ve LUV içeren fraksiyonları belirleyin. Saflaştırılmış LUV fraksiyonlarını çekin.

Bu analizler, BCL 2 proteinlerinin LUV permeasyonunu doğrudan indükleme yeteneğini ve ayrıca permeasyon aktivitesinin düzenlenmesini ölçmek için tasarlanmıştır. Analiz bileşenlerini ekleme sırasına göre birleştirin. BS ve bid proteinlerinin titrasyonlarına ilişkin detaylar ekteki makalede sunulmuştur.

Reaksiyonları, analiz zaman noktaları boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakayı, daha önce gösterildiği gibi plakayı sallayacak ve floresan ölçümü yapacak olan mikroplaka okuyucuya yerleştirin. Bu deneyde, LUV permeasyon pozitif kontrolü oluşturmak için OG deterjanı ile aktive edilmiş keseler kullanılmaktadır.

Dikkat edilmesi gereken husus, %0,025'in altındaki OG konsantrasyonlarının burada LUV permeasyonunu doğrudan etkilememesidir. Ayrıca, assay başına maksimum LUV floresansı miktarını belirlemek için %0,5 chaps uygulaması kullanılmaktadır. BCL-2 ailesi proteinleri ile LUV permeasyonunu incelemek için gerekli olan başlangıç noktası, optimal salınımı teşvik edecek Bak ve Bid konsantrasyonlarını belirlemektir.

Sırasıyla arka plan ve bid'e ait bu titrasyon eğrileri, minimal arka plan salınımını ve optimal sinerjiyi göstermektedir. Alternatif olarak, LUV geçirgenliği kinetik olarak ölçülebilir. Bu okumalar, her okumadan önce plakanın iki saniye hafifçe sallanmasıyla birlikte, 30 dakika boyunca her iki dakikada bir gerçekleştirilmiştir.

Bu deney, antiapoptotik bir proteinin Bax ve Bid bağımlı LUV permeasyonuna etkisini belirlemektedir. BCL-XL, Bax ve Bid aktivitesini doz bağımlı bir şekilde inhibe eder. Bir D baskılama analizinde, inhibisyon etkisi sonradan eklenen BH3-yalnızca proteinler ile geri döndürülebilir.

Örneğin, puma beta BCL xl'ye bağlanır, böylece backs ve bid'in sinerji oluşturmasına ve permeabilizasyon yapmasına olanak tanır. Büyük ELLA vezikülleri oluşturma tekniğinde uzmanlaşmak, BCL two ailesi proteinlerinin, peptitlerin ve küçük moleküllerin, dış mitokondriyal membrana benzer biyokimyasal olarak tanımlanmış bir ortamda etkili ve hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Önemle belirtmek gerekir ki bu analiz, hem uç nokta hem de kinetik parametreler kullanılarak yüzlerce koşulun hızlıca analiz edilmesine olanak tanır.

Hem UUV'lerin hem de BCL iki proteinin deterjan kaynaklı artefaktlara karşı oldukça hassas olduğunu unutmayın. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için deterjan içermeyen temiz ekipmanlar kullanın.