Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu deney, çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında renal proksimal tübül hücrelerindeki mitokondriyal ve hücresel fonksiyonlarını belirlemek için protein kinaz C ISO xms'lerin seçici modülasyonunu kullanır. İlk olarak, renal korteksten primer renal proksimal tübül hücrelerini veya renal proksimal tübüllere benzeyen oksidatif metabolizmaya sahip RPC'leri izole edin.

RPC'leri, protein kinaz C'nin aktif ve inaktif isozim formlarını eksprese eden adenoviral vektörlerle in vivo olarak enfekte edin. Ardından, isozimin mitokondriyal ATP sentezleme ve hücre ölümünü önleme yeteneği üzerindeki etkisini belirlemek için farklı mitokondriyal fonksiyonları ve hücre canlılığını analiz edin. Ayrıca, birlikte alınan hücresel lizatlarda fosforile olmuş ve toplam protein kinaz C epsilon için immünoblot analizi gerçekleştirin.

Sonuçlar, protein kinaz epsilon aktivasyonunun mitokondriyal ATP üretme kapasitesini negatif yönde düzenlediğini, hücresel ATP seviyelerini ve renal proksimal tübül hücrelerinin canlılığını azalttığını göstermektedir. Hücre hatları gibi mevcut tekniklerimize kıyasla bu tekniğin temel avantajı, renal proksimal tübül hücrelerinin primer kültürlerinin, renal proksimal tübüle özgü diferansiye fonksiyonları ve oksidatif metabolizmayı korumasıdır. Protein kinazlar hedef ve potansiyel terapötik ajanlar olarak kullanılabildiğinden, bu tekniğin etkileri tedaviye, böbrek hasarının önlenmesine veya hasar sonrası böbrek iyileşmesinin hızlandırılmasına kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem, hasar ve iyileşme mekanizması hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, her bir böbreğin korteksini toplamak için sırasıyla 50 mililitre steril D-M-E-M-F 12 besiyeri, steril fosfat tamponlu salyangoz çözeltisi, pH 7.4 ve PBS demir oksit çözeltisi ile taze izole edilmiş tavşan böbreklerine uygulanabilir.

Önce dokuyu 15 mililitrelik alt homojenizatör kullanarak homojenize edin. Ardından homojenatı iki steril ağ süzgeçten geçirerek bir litrelik steril bir behere aktarın. Süzgeçlerde kalan hücreleri deferoksamin içeren tamponla durulayın.

Altta kalan tüm dokuyu, konik santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 40 mililitre deferoksamin içeren tampona, 85 mikronluk elek aracılığıyla aktarın. Hücre süspansiyonunu güçlü mıknatıs ile nazikçe karıştırın.

Demir yüklü glomerülleri yakalayın ve mıknatısa tutunan demiri aspire edin. Hücre süspansiyonunun hacmini 40 mililitreye ayarlayın ve kollajenaz içeren bir mililitre sindirim medyumu ekleyin. Oda sıcaklığında 17 dakika boyunca inkübe edin.

Süspansiyon nazikçe karıştırılır. Birkaç yıkama işleminin ardından, hücreler 4 °C'de iki dakika boyunca 50 ×g'de santrifüj edilerek hasat edilir. Hücre peleti, glikoz içermeyen 46 ml besiyerinde yeniden süspanse edilir.

Primer RT PC'ler, orbital bir sarsıcı üzerinde 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında, iki mililitre glukozsuz D-M-E-M-F 12 medium içerisinde, kap başına bir miligram protein yoğunluğunda kültüre edilir. Besiyeri yenilendikten sonra, konfluen RPT hücreleri, ya konstitütif olarak aktif protein kinaz C epsilon ya da dominant negatif protein kinaz C epsilon taşıyan adenovirüsle enfekte edilir; 24 saat inkübe edilir, besiyeri yenilenir ve transfekte edilmiş primer RPC'ler 24 saat daha kültüre edilir. Primer hücre monokatmanının mitokondriyal morfolojisini görselleştirmek için besiyerini yenileyin, MitoTracker Red CMXR ekleyin ve kapları 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Ardından, canlı tek katmanları su daldırma objektifi kullanarak floresan mikroskobunda inceleyin. Objektif iki. Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için, RPTC süspansiyonunun durum 3 solunumunu, Clark tipi elektrotla donatılmış bir oksijen tüketim odasında değerlendirin.

Öncelikle, bir DP yokluğunda durum iki solunumunu ölçün. Ardından, 0,4 millimolar son konsantrasyona ulaşacak şekilde bir DP ekleyin. Durum üç solunumunu başlatın ve ardından durum dört solunumu için mililitre başına 0,5 micrograms son konsantrasyonda oligomisin ekleyin.

Durum üçte solunum yapan hücrelere 0.5 µM FCCP ekleyerek eşleşmemiş solunum için de bir ölçüm dahil edin. Her bir RPTC kültür plağına 20 µL 0.5 mM JC-1 çözeltisini yavaşça ekleyin ve boyanın iyice karışması için çalkalayın. Plakları 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Ardından, kültürleri buza yerleştirin ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkama yapın. Sonra hücreleri hasat edin. RPT hücrelerini bir eppendorf tüpüne aktarın ve pipetleme yaparak monokatmanları tek hücre süspansiyonuna dönüştürün.

488 nanometrelik bir argon iyon lazeri ile eksitasyon kullanarak floresan analizini akış sitometrisi ile gerçekleştirin. Ardından, izole edilmiş mitokondrilerin mitokondriyal membran potansiyelini hesaplayın. Solunum zincirinin bütünlüğünün değerlendirilmesini kolaylaştırın.

RPTC monokatmanları buz gibi soğuk PBS tamponu ile iki kez yıkandıktan sonra, hücreleri toplayın ve santrifüj ederek çöktürün. Çökeltiyi bir mililitre tampon A ile bir kez yıkayın, ardından homojenat içindeki hücrelerin çoğu mikroskop altında incelendiğinde parçalanmış görünene kadar hücreleri bir down homogenizer ile homojenize edin. Daha sonra, düşük hızlı santrifüj ile hücresel kalıntıları uzaklaştırın.

Kaba mitokondriyi, supernatanttan 4 °C'de 10 dakika boyunca 15,000 ×g'de pelletleyin ve pelletlenmiş mitokondrileri tampon c ile üç kez yıkayın; mitokondri pelletini 50 ila 100 µL analiz tamponu içinde yeniden süspande edin ve NADH ubiquinone oxidoreductase aktivitesini analiz etmek için sıvı azot içinde dondurun. Analiz tamponunun 500 µL'sini eklemelerle birlikte mitokondrilerle karıştırın; ayrıca tüm eklemelerin bulunduğu ancak mitokondri içermeyen bir boş örnek (blank) ekleyin. Plakayı karıştırarak 30 °C'de beş dakika boyunca dengeleyin.

Ardından, plakayı spektrofometreye yerleştirin ve her kuyucukta reaksiyonu başlatmak için 10 µL 3,25 mM ubikinon ekleyin. Absorbansı 340 nm'de, üç dakika boyunca 22 saniyelik aralıklarla kaydedin. Benzer bir analizde, ATP sentaz reaksiyonu için substrat olarak indirgenmiş sitokrom C kullanarak sitokrom C oksidaz aktivitesini ölçün.

Her bir tedavi grubunun toplam APA aktivitesini ve oligomisin duyarsız APA aktivitesini analiz etmek için karışımları hazırlayın. Örnekleri reaksiyon karışımı içinde 31 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. TP substratı ekleyerek reaksiyonu başlatın ve 31 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon karışımının 200 µL'sini, 50 µL üç molar TCA içeren bir tüpe aktarın ve proteinleri buz üzerinde 10 dakika boyunca çöktürün. Ardından santrifüj ile peletleyin. Sonra, 96 kuyucuklu bir plakaya her bir fosfat standardından 50 µL ve her bir örnek süpernatantından ikişer kez (duplicate) 50 µL yükleyin.

Ardından her kuyucuğa 250 µL Sumner reaktifi ekleyin ve 30 °C'de 15 dakika inkübe edin. Daha sonra 595 nm'de absorbansı kaydedin. RPTC monotabanlarını buz gibi soğuk PBS tamponu ile iki kez yıkayın.

Hücreleri bir mililitre PBS içerisinde toplayın ve hücre süspansiyonunu bir eppendorf tüpüne aktarın. RPTC örneklerini santrifüjle çöktürün ve bir ATP biyolüminesans analiz kiti ile lusiferaz yöntemini kullanarak TP içeriğini belirleyin. 35 milimetrelik kaplarda hücre canlılığı analizi için; onosis pozitif hücreler, apoptoz pozitif hücreler için üç kontrol işlem grubu ve iki kap için boyanmamış bir kontrol olmak üzere beş RPTC monokatmanı kullanın.

İkinci sete iki µL 50 mM cisplatin ekleyin. İki µL 500 mM tert-bütil hidroperoksit ekleyin. Hücreleri, ekteki metinde detaylandırıldığı şekilde propidyum iyodür kullanarak boyadıktan sonra, monokatmanları bağlama tamponu ile yıkayın.

Ardından, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde, ZI ile konjuge edilmiş ANNEXIN five kullanarak hücreleri boyayın. Daha sonra hücreleri nazikçe toplayın ve 500 µL bağlanma tamponu içinde süspande edin. Bir kauçuk polisman kullanın.

Hücreleri tek hücre süspansiyonu haline getirmek için bir pipet kullanın ve hücre süspansiyonunu akış sitometrisi tüplerine aktarın. Hücreleri tek hücre süspansiyonu haline getirin. PI ve FE floresan miktarını akış sitometrisi ile belirlemek için derhal işleme geçin; CD NA kaplı adenoviral iletimin protein kinaz C epsilon'un konstitütif aktif ve inaktif mutantları için RPTC'de ve mitokondride protein kinaz C epsilon protein seviyelerini anlamlı ölçüde artırdığı görülmüştür.

Beklendiği üzere, enzimin konstitütif olarak aktif formu RP tcs'lerde fosforile olurken, dominant negatif enzim fosforile olmamaktadır. Aktif protein kinaz C epsilon varlığı, mitokondrileri enerjilendirmek için kullanılan substrattan bağımsız olarak RPTC'lerde mitokondriyal respirasyonu azaltır. Ancak inaktif protein kinaz C epsilon'un mitokondriyal respirasyon üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.

İlginç bir şekilde, RP TCS'de protein kinaz C epsilon aktivasyonu, kompleks birin dörtte birinin aktivitesini azaltır. RPTC solunumundaki bu azalma, mitokondriyal membran potansiyelindeki artışlarla ilişkilidir. Dominant negatif mutantın böyle bir etkisi yoktur.

Bu değişikliklere, aktif protein kinaz C epsilon'u aşırı eksprese eden RPTC'den izole edilen mitokondrilerde bir TP sentaz aktivitesindeki azalma da eşlik etmektedir. Sonuç olarak, aktif protein kinaz C epsilon'u aşırı eksprese eden RPTC'nin ATP içeriği azalır; protein kinaz C epsilon'un sürekli aktivasyonu, mitokondriyal fragmantasyon ile kanıtlandığı üzere mitokondriyal morfoloji üzerinde derin etkilere sahiptir.

Protein kinaz C aktivasyonu, ancak inhibisyonu değil. Ayrıca, hücre büzülmesine ve sağ kalan hücrelerin uzamasına neden olan RPTC morfolojisinde değişikliklerle sonuçlanır. RPC'lerde aktif protein kinaz C epsilon'un aşırı ekspresyonunun bu mitokondriyal etkileri, hem nekroz hem de apoptoz yoluyla gerçekleşen hücre ölümü ile de korele olmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, adenoviral teknik kullanarak primer kültürlerde proteinlerin nasıl aşırı eksprese edileceği ve TP sentezi için mitokondriyal kapasitenin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir. Ayrıca, adenovirüslerle çalışmanın risk taşıdığını unutmayın, bu nedenle uygun önlemleri aldığınızdan emin olun.