Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, bölünen hücrelerde viral genomların bölüştürülmesini gözlemlemektir. Bu, öncelikle floresan mikroskobu ile görüntülenebilen bir plazmit oluşturularak gerçekleştirilir. Burada, laktoz operatör dizisinin veya LAC O'nun tandem tekrarlarını içerecek şekilde bir plazmit tasarlanır. İkinci adım, plazmitin bölünen hücrelere aktarılması ve ardından hücrelerin, floresan bir proteine kaynaştırılmış laktoz represörünü veya lac eye kodlayan bir retrovirüs ile enfekte edilmesidir.

Laktoz represör füzyon proteinleri, plazmid altındaki laktoz operatör dizilerine spesifik olarak bağlanacaktır. Bireysel plazmidleri birden fazla hücre döngüsü boyunca takip etmek için hücreler floresan mikroskobu ile izlenir. Son olarak, elde edilen görüntüler viral genomların bölünen hücrelerde nasıl korunduğunu belirlemek için işlenir.

Bu tekniğin kantitatif PCR, Southern blotting veya floresan yerinde hibritleme (FISH) gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekil plazmitlerin farklı zaman noktalarında gözlemlenmesine olanak tanımasıdır. Plazmitin floresan mikroskobu ile görüntülenmesini sağlamak için, laktoz operatör dizisinin veya LAC O'nun yaklaşık 250 kopyasını içeren bir DNA fragmanını plazmite aktarmak amacıyla standart moleküler klonlama teknikleri kullanılır. Bu örnekte plazmit, Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsünün veya KSHV'nin tüm genomunu içeren ve higromisin direncini kodlayan, yaklaşık 170 kilobaz çiftlik bir BACMID'dir.

LAC O içeren plazmit DNA'yı transfeksiyon yoluyla HeLa ve SLK memeli hücrelerine aktarın. 60 mm'lik kaplarda hücreleri 10 µg saflaştırılmış plazmit DNA, 25 µL Lipofectamine 2000, 0,5 mL Opti-MEM ve 3,5 mL DMEM ile dört saat boyunca inkübe edin. Besiyerini %10 fetal sığır serumu içeren DMEM ile değiştirin ve hücrelerin 48 saat boyunca toparlanmasını sağlayın.

Ardından, transfekte edilen hücreleri düşük yoğunlukta büyük kaplara ekimleyin ve girilen plazmidi seçmek için %10 fetal bovine serum ve 300 micrograms per milliliter higromisin içeren DMEM içinde üç hafta boyunca kültüre edin; higromisinle dirençli kolonileri yeni kültür kaplarına aktarmak için steril uç parçaları ve ıslatılmış filtre kağıtları kullanın. Transfekte klonlar kabı dolduracak kadar büyüdüğünde, bir ila iki hafta sonra kapları inkübatöre yerleştirin; LAC O plazmidinin polimerinin homojen ve beklenen boyutta olduğundan emin olmak için restriksiyon sindirimi ve Southern blotting için DNA izole edin. Bu örnek blot, birinci klondaki LAC O polimerinin homojen olduğunu ve pozitif kontrol ile aynı olduğunu göstermektedir.

Yedinci şeritte, plazmit laktoz baskılayıcı lacI füzyonunu ifade edecek şekilde tasarlanmamışsa, lacI'nin tdTomato gibi kırmızı floresan bir proteine füzyonlandığı bir retrovirüs ile uygun klonları enfekte edin; uzun süre boyunca tekrarlanan pozlamalardan kaynaklanacak fototoksisiteyi en aza indirmek için yeşile daha yakın floresan veren proteinler yerine tdTomato seçilmiştir. lacI füzyon proteini aktarıldıktan sonra, füzyon proteinlerinin DNA'ya bağlanmasını engellemek için hücreleri 200 µg/mL IPTG varlığında kültüre edin. Bu prosedürün en kritik yönlerinden biri, uygun floresans yoğunluğuna sahip klonlar elde etmektir.

Optimal floresan kültürüne sahip olanları belirlemek için çok sayıda klon taranmalıdır. LAC eye TD tomato proteininin ekspresyonuna izin vermek için hücreleri en az üç gün boyunca kültüre edin; bağlı olmayan füzyon proteininin arka plan seviyelerinin minimum olduğu ve belirgin sinyaller veren optimal lac eye TD tomato seviyelerine sahip klonları tarayın. Görüntülemeden 24 ila 48 saat önce, LAC I TD tomato eksprese eden hücreleri %10'dan düşük konfluens yoğunluğunda 35 milimetrelik cam tabanlı bir kaba ekin. Bu, görüntüleme başlangıcından bir ila üç saat önce, hücre çiftlerinin birbirinin üzerine binmeden sekiz ila 16 hücreli kolonilere bölünmesine olanak tanıyacaktır.

Plakayı, hem seçici ilaçlardan hem de IPTG'den yoksun kültür medyumu ile üç kez durulayın. Bu işlem, canlı olmayan hücreleri uzaklaştırır ve lac göz füzyon proteinlerinin plazmidlerdeki LAC sitlerine bağlanmasını sağlar. Kültür medyumunu, %10 fetal bovine serum ve 25 millimolar Hippies içeren iki mililitre DMEM ile değiştirin ve bir ila üç saat inkübe edin; görüntülemeden hemen önce, kültür kabının üst kısmını 35 milimetrelik bir kap için montaj halkasına gerilmiş kültür folyosu ile değiştirin.

Bu kapak, zamanla tuz konsantrasyonunu artırıp hücreleri öldürebilecek olan kültür ortamının buharlaşmasını önleyecektir. Bu deneyde kullanılan görüntüleme sistemi, motorlu bir sahne ve sinyallerin hassas tespiti için bir EM CCD kamera ile donatılmış bir Zeiss Axio 200 M ters mikroskoptan oluşmaktadır. Floresan eksitasyon ışığı, bir Collibra sisteminin nötr beyaz LED'i tarafından sağlanmaktadır.

Görüntüleme sistemi, çoklu Z yığınları ile uzun zaman aralıklarında otomatik görüntü alımları gerçekleştiren bir yazılım tarafından kontrol edilir. Hücreleri nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C sıcaklıkta ve %5 ila 10 karbondioksit ortamında tutmak için tabla üstü bir inkübatör kullanılır. Objektifin siphoning yapmasını önlemek için yağlı objektif için ısıtmalı bir kolye kullanın.

Sistemin stabil bir sıcaklığa ulaşması için numuneyi yeterli süre boyunca ısıtın. Deney sırasında hareket artefaktlarını minimize etmek için görüntüleme sistemi, titreşimlerden izole edilmek amacıyla bir hava tablası üzerine yerleştirilmelidir. Etiketli DNA'nın görselleştirilmesi prosedürüne başlamak için hücreleri görüntülemek ve her bir görüş alanındaki hücrelerin üst ve alt kısımlarının odak düzlemlerini belirlemek amacıyla DIC görüntüleme kullanın; her alanda, hücrenin üst kısmından yaklaşık üçte bir oranında aşağıda olan bir odak düzlemine gidin ve x, y, Z koordinatlarını kaydedilmiş sahne konumları listesine kaydedin.

Kaydedilen bu konumların her biri, mikroskop kontrol yazılımında hücreyi görüntülemek amacıyla yakalanacak bir Z-yığınının (Z-stack) merkezi olacaktır; kaydedilen her sahne konumunda gerçekleştirilecek bir Z-yığını tanımlayın ve hücrelerin bulunduğu düzlemlerin altına ve üstüne ek dilimler ekleyerek tüm hücrenin yakalanmasını sağlayacak kadar dilim belirleyin. Z boyutunda yaklaşık Nyquist örneklemesine izin vermek için 0,35 ile 0,50 mikron arasında bir Z adım boyutu seçin. Bu dilimler, hücre döngüsü sırasındaki hücre hareketlerinin takibine olanak tanır ve ayrıca görüntü yığınlarının çekim sonrası işlemesinde kullanılır.

Bu işlem, hücrelerin kalınlığına bağlı olarak 40 ila 60 görüntüden oluşan bir yığınla sonuçlanacaktır. Zacks'lerin 30 dakikalık aralıklarla parlak alan görüntülerinin ve 10 ila 60 dakikalık aralıklarla floresan görüntülerinin toplanması için bir zaman serisi deneyi tanımlayın. Deney sırasında DIC görüntüleme kullanmayın; çünkü DIC, standart parlak alan görüntülemeden daha fazla ışık gerektirir ve bu durum, uzun süreli deneyler boyunca hücreleri gereksiz yere fototoksisiteye maruz bırakabilir.

Yazılım kontrollü deneyi başlatın. Deney sırasında sistemin hiçbir şekilde rahatsız edilmediğinden emin olun. Deneye ait tüm görüntüler elde edildikten sonra, her bir Z-yığını (Z-stack) ve zaman noktası için görüntüleri inceleyin ve bilgisayar işlem süresini azaltmak için görüntülerin gereksiz alanlarını kırpın.

Bir sonraki adımda, her Z yığındaki sinyal yoğunluğu başlangıç pikseline yeniden atanır. Görüntüleme sisteminin ölçülen nokta yayılım fonksiyonuna dayalı olarak Axio vision yazılımındaki bir dekonvolüsyon algoritması kullanılır. Dekonvolüsyonun sonucu burada gösterilmiştir.

Hücre döngüsü sırasındaki plazmidlerin yoğunluk değişimlerini ve hareketlerini ve plazmidlerin yavru hücrelere paylaştırılmasını izlemek için görüntüleri inceleyin. Farklı sinyallerin bulunduğu çoklu Z düzlemlerini içerecek şekilde bilgisayar ortamında oluşturulan bu görüntüler, LAC eye TD tomato eksprese eden HELOC hücrelerinin çekirdeklerinin, füzyon proteinindeki nükleer lokalizasyon sinyali nedeniyle floresan özellik gösterdiğini ve bu sinyalin proteini çekirdeğe lokalize ettiğini göstermektedir. I-P-T-G yokluğunda, LAC O dizilerini kodlayan K-S-H-V genomları, floresan proteinin birçok kopyasını toplar ve çekirdeğin arka plan yoğunluğu üzerinde parlak sinyaller olarak belirginleşir.

Buna karşılık, IPTG varlığında, LAC göz floresan proteinlerinin tanıma dizisi olan lacO'ya bağlanması engellenir; Panel A'da görülen hücredeki floresan işaretli viral genomların beş farklı zaman noktasındaki maksimum yoğunluk projeksiyonları bu şekilde elde edilmiştir. Temsili bir deneyden alınan görüntüler bu şekilde gösterilmiştir. Panel A'da hücre içerisinde görülen floresan işaretli viral genomlar, Panel B'de gösterildiği şekilde sentezlenir. Viral genomlar daha sonra, Panel C, D ve E'de gözlemlendiği üzere, hücre bölünmesi sırasında yavru hücrelere paylaştırılır. Sağlıklı HELOC hücreleri için hücre döngüsü yaklaşık 24 saat sürer ve yavru hücreler tipik olarak birbirine yakın bölgelere tutunarak bir sonraki hücre döngüsünde aynı anda bölünmeye devam ederler.

Bu protokol kullanılarak, prosedür uygulanırken hücrelerdeki viral genomlar birden fazla nesil boyunca takip edilebilir. Deney süresince hücrelerin sağlıklı olduğundan emin olmak için nesil süresi boyunca hücre morfolojisinin izlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir.