Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü Plasmodium falciparum ile enfekte Eritrosit

Bu prosedür, klinik veya laboratuvar plazmodyum yalancı parem izolatlarının trombosit aracılı topaklanma testlerini gerçekleştirmek için bazı standart kılavuzlar sunar. İlk olarak, enfekte bir hastadan kan toplayın ve santrifüjleme ile parazitlenmiş eritrositleri toplayın, ardından aseksüel olgun aşamaları kültürleyin ve saflaştırın. Daha sonra, trombositten zengin plazmayı santrifüjleme ile hazırlamak ve standardize etmek için sağlıklı bir donörden kan alın.

Topaklanma testi için hem trombositleri hem de parazitlenmiş eritrositleri birleştirin. İmmünofloresan mikroskobundan elde edilen sonuçlar, trombositlerin aracılık ettiği P Fal sperum kümelerini gösterebilir. Bu teknik, kaynakların yetersiz olduğu bir ortamda plasmodium sra.Clinical izolatlarının topaklanma fenotipini ölçmek için özel olarak tasarlanmıştır

. Prosedürlerdeki minimal değişikliklerin, tarlada topaklanan asidin sonucundaki etkiyi artırdığı bildirilmiştir. Bu nedenle, sıtma endemik tarla sahalarında standartlaştırmak için düşük kaynak ayarlarına uyarlanmış açık ve takip etmesi kolay bir protokole ihtiyaç vardı: Bir sodyum sitratta, vakutainer, sıtma naif bir konakçıdan yaklaşık beş mililitre tam kan veya CM veya SM sıtma hastalarından 2,5 mililitre kan toplar.

Tam kanı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 Gs'de santrifüjleyin. Ardından bulanık süpernatanı dikkatlice 15 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın. Trombositlerin sıcaklık, değişimler ve fiziksel şoklarla kolayca aktive olduğunu unutmayın.

Rahatsız edici bower, hemo sitometre kullanarak PRP süspansiyonunu numaralandırın ve 10 dakika boyunca 1500 GS'de santrifüjleme ile PRP fraksiyonunun bir kısmından trombositlerin çoğunluğu olan trombositten fakir plazma peletini elde etmek için PBS ile istenen konsantrasyona ayarlayın. PRP ve PPP fraksiyonlarını sekiz ila 10 güne kadar dört santigrat derecede saklayın. Topaklanma testi için ideal olarak taze trombositlerin kullanılması.

Peletlenmiş periferik kırmızı kan hücrelerini bir kültür şişesinde beş ila 10 mililitre RPMI 1640 ile üç kez yıkayın % 5 hematokrit elde etmek için standart sıtma kültürü, orta ve taze enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ile PRBC takviyesi. Kültür şişelerine %92,5 azot, %2,5 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı ile nüfuz edin. Daha sonra hasta pbc'lerinden olgun parazitler için mühür ve kültür.

Kültür şişesini% 5 karbondioksitte 37 santigrat derece inkübatörde 24 ila 36 saat inkübe edin. Düz bir yüzeye oturan buzlu cam sürgünün bir ucuna yaklaşık 10 ila 15 mikrolitre kan yerleştirin. İkinci slaytı 45 derecelik bir açıyla tutarken, kan ikinci slaytın kenarına eşit şekilde yayılana kadar ikinci slaytın kenarıyla kan damlasına dokunun.

Hızlı ama nazikçe, ilk slayta çok fazla baskı uygulamadan, kanı ilk slayta eşit şekilde yayın. Daha sonra ince kan filmini havayla kurutun, numune alanını 10 saniye boyunca metanol ile kurutun. Daha sonra havayla kurutun, numuneyi% 2 keem ile daldırın.

En az 10 dakika devam ettirin. Su berraklaşana ve hava kuruyana kadar iyice durulayın. Numuneleri bir ışık mikroskobu üzerinde 100 x yağ emülsiyon merceği altında inceleyin.

Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi olgun PFS parum, PRBC'yi saflaştırın ve senkronize edin. Hepsi kültürü temiz, steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarır. Hücreleri oda sıcaklığında 370 GS'de beş dakika santrifüjleyerek peletleyin.

Şimdi peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire edin. Daha sonra hücreleri, toplam hacmin yarısı jöle kaynaştıracak şekilde yeniden askıya alın. İkinci yarının üçte biri proteinsiz ortam, ikinci yarının üçte ikisi ise pbcs'dir.

Süspansiyonu steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve üst ve alt seviyeler arasında net bir sınır oluşana kadar 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 15 ila 20 dakika inkübe edin. Üst tabakayı dikkatlice taze steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 370 ila 430 GS'de 10 mililitre taze RPMI santrifüjü ekleyin. Sonra süpernatanı dikkatlice atın.

Şimdi parsit ve gelişim aşamasını ince kan yayması ile değerlendirin ve daha önce tarif edildiği gibi ışık mikroskobu altında inceleyin. Plazma jel yüzdürme işleminden sonra elde edilen P RBC süspansiyonunu, 1,5 mililitrelik taze bir tüpte mikrolitre başına bir kez 10 ila sekizinci P RBC'ye ayarlayın. PBCS'yi mililitre başına 20 mikrogramda% 5 hematokrit aine portakal veya atherium bromürde, son konsantrasyonda ve PRP'yi toplam hacmin% 10'unda askıya alıyoruz.

Benzer şekilde, PBC'nin topaklanmasında trombositlerin rolünü belirlemek için enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerini ve PPP ile PRP ve PRBC'yi kontrol edin. Şimdi süspansiyonu iki mililitrelik vidalı kapaklı bir şişeye aktarın. Topak oluşumunu kontrol etmek için şişeyi oda sıcaklığında 10 ila 12 RRP'de yuvarlayarak, 15 ila 20 dakikalık aralıklarla toplam 120 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.

Numunenin 10 mikrolitresini bir cam slayt üzerine pipetleyin ve floresan altında incelemek için bir cam astar ile örtün, Bir küme, üç veya daha fazla enfekte eritrositin bir toplamı olarak kabul edilir. Bu deney, plazma jeli flotasyonu ile zenginleştirildikten sonra p FAL'lerin yaklaşık %70 oranında olgunlaşmış aşamalarını test etti, kümeler normal ışık altında olduğu gibi mikroskop altında kolayca tespit edilebilir. Hücre agregaları olarak ve floresan altında yeşil veya kırmızı lekeler olarak görünürler.

Akro ve portakal veya atherium ile boyandığında bromür sırasıyla ölür. Küme boyutu, 120 dakika boyunca inkübasyondan sonra küme başına ortalama 15 pbcs'den daha fazla önemli ölçüde artar ve bazı kümeler, görsel olarak sayılamayan küme başına çok sayıda pbc içerir. Topaklanma fenotipinin sıklığı, çift tahlillerde sayılan 1000 enfekte hücre başına kümeler halinde bulunan enfekte hücre sayısı olarak hesaplanır.

Bu videoyu izledikten sonra, artık bir plasmodium falciparum, trombosit aracılı topaklanma testinin nasıl gerçekleştirileceğini net bir şekilde anlamış olmalısınız. Trombositleri sarsıntılı hareketler ve sıcaklık değişimleri ile aktive etmemeye dikkat edin. Bu test, şiddetli sıtmada trombosit aracılı topaklanma testini ölçmek için de uygulanabilir.