Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü Plasmodium falciparum ile enfekte Eritrosit

Bu prosedür, klinik veya laboratuvar ortamındaki plasmodium falciparum izolatlarının trombosit aracılı kümelenme analizlerini gerçekleştirmek için bazı standartlaştırılmış kılavuzlar sunmaktadır. İlk olarak, enfekte bir hastadan kan toplayın ve santrifüjleme yoluyla parazitli eritrositleri hasat edin, ardından aseksüel olgun evreleri kültüre edin ve saflaştırın. Daha sonra, santrifüjleme ile trombosit bakımından zengin plazmayı hazırlamak ve standardize etmek için sağlıklı bir donörden kan toplayın.

Kümeleşme analizi için trombositleri ve parazitli eritrositleri birleştirin. İmmünofloresan mikroskopi sonuçlarının, trombositler aracılığıyla gerçekleşen P Fal sperum kümelerini gösterebileceği belirtilebilir. Bu teknik, özellikle plasmodium sra'nın kümeleşme fenotipini ölçmek için tasarlanmıştır.

Kaynağı kısıtlı bir ortamdaki klinik izolatlar. Prosedürlerdeki minimal varyasyonların, sahada kümelenme asidi sonucunu etkilediği bildirilmiştir. Bu nedenle, sıtma endemik saha bölgelerinde standardizasyon sağlamak amacıyla, düşük kaynaklı ortamlara uyarlanmış, net ve takip edilmesi kolay bir protokole ihtiyaç duyulmuştur. Sodyum sitratlı bir vakuteyner ile, sıtma ile karşılaşmamış bir konakçıdan yaklaşık beş mililitre tam kan veya CM veya SM sıtma hastalarından 2,5 mililitre kan toplayın.

Tam kanı oda sıcaklığında, 250 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından bulanık süpernatantı dikkatlice temiz bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Trombositlerin sıcaklık değişimleri ve fiziksel şoklarla kolayca aktive olabileceğini unutmayın.

PRP süspansiyonunu hemositometre kullanarak sayın ve istenen konsantrasyona ulaşmak için PBS ile ayarlayın; platelet poor plasma pellet elde etmek için PRP fraksiyonunun bir kısmındaki trombositlerin çoğunluğunu 1500 GS'de 10 dakika santrifüj ederek ayırın. PRP ve PPP fraksiyonlarını 4 °C'de 8 ila 10 güne kadar saklayın. Kümeleşme analizi için ideal olarak taze trombositler kullanın.

Çöktürülmüş periferik kırmızı kan hücrelerini, bir kültür flaskında beş ila 10 mililitre RPMI 1640 ile üç kez yıkayın. %5 hematokrit değerine ulaşmak için PRBC'leri standart sıtma kültür besiyeri ve enfekte olmamış taze kırmızı kan hücreleri ile destekleyin. Kültür flasklarına %92,5 nitrojen, %2,5 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı verin. Ardından, hasta PBC'lerinden olgun parazitler elde etmek için flaskları kapatıp kültüre alın.

Kültür flaskını 37 °C'deki bir inkübatörde %5 karbon dioksit altında 24 ila 36 saat boyunca inkübe edin. Düz bir yüzey üzerinde duran buzlu cam lamın bir ucuna yaklaşık 10 ila 15 µL kan yerleştirin. İkinci bir lamı 45 derecelik bir açıyla tutarak, kan damlasına ikinci lamın kenarıyla dokunun ve kan ikinci lamın kenarı boyunca eşit şekilde yayılana kadar işlemi sürdürün.

İlk lam üzerine çok fazla baskı uygulamadan, kanı hızlıca ancak nazikçe lam boyunca eşit şekilde yayın. Ardından ince kan filmini havada kurutun ve örnek alanını 10 saniye boyunca metanol ile deplase edin. Daha sonra tekrar havada kurutun ve örneği %2'lik keem içerisine daldırın.

En az 10 dakika boyunca bekletin. Su tamamen berraklaşana kadar iyice durulayın ve havada kurumaya bırakın. Örnekleri, bir ışık mikroskobunun 100 x yağ emülsiyon lensi altında inceleyin.

Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde olgun PFS parum, PRBC'leri saflaştırın ve senkronize edin. Kültürü temiz, steril bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 370 GS ile beş dakika santrifüj ederek çöktürün.

Şimdi, pellet'e zarar vermeden süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından, toplam hacmin yarısı jello fusing olacak şekilde hücreleri yeniden süspande edin. İkinci yarının üçte biri proteinsiz ortam, üçte ikisi ise pbcs olmalıdır.

Süspansiyonu steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve üst ve alt seviyeler arasında net bir ayrım oluşana kadar 37 degrees Celsius'lik bir inkübatörde 15 ila 20 dakika inkübe edin. Üst tabakayı dikkatlice yeni bir steril 15 mililitrelik tüpe aktarın ve 10 mililitre taze RPMI ekleyip 370 ila 430 GS'de beş dakika santrifüj edin. Ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın.

Şimdi, ince kan yayması ile parazit varlığını ve gelişim evresini değerlendirin ve daha önce açıklandığı şekilde ışık mikroskobunda inceleyin. Plazma jel flotasyonu sonrası elde edilen P RBC süspansiyonunu, yeni bir 1,5 mL tüp içerisinde mikrolitre başına 1 × 10⁸ P RBC olacak şekilde ayarlayın. PBC'leri %5 hematokrit, son konsantrasyonu 20 µg/mL olan acridine orange veya ethidium bromide ve toplam hacmin %10'u kadar PRP ile süspanse ederiz.

Benzer şekilde, trombositlerin PBC kümelenmesindeki rolünü belirlemek için enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ile PRP ve PPP içeren PRBC kontrollerini hazırlayın. Ardından süspansiyonu iki mililitrelik vidalı kapaklı bir viale aktarın. Küme oluşumunu kontrol etmek için viali oda sıcaklığında, 10 ila 12 RRP hızında yuvarlayarak nazikçe karıştırın ve toplam 120 dakika boyunca 15 ila 20 dakikalık aralıklarla örnekleme yapın.

Örnekten 10 µL miktarını bir lam üzerine pipetleyin ve floresan altında incelemek için bir lameli ile kapatın. Üç veya daha fazla enfekte eritrositin birleşimi küme olarak kabul edilir. Bu deney, plazma jel flotasyonu ile zenginleştirildikten sonra p FALs parazitinin yaklaşık %70 olgun evrelerini analiz etmiştir; kümeler, normal ışık altında olduğu gibi mikroskop altında kolayca tespit edilir. Bunlar hücre agregatları olarak ve floresan altında yeşil veya kırmızı noktalar şeklinde görünürler.

Sırasıyla akridin oranj veya etidyum bromür boyaları ile boyandığında, 120 dakikalık inkübasyonun ardından küme boyutu önemli ölçüde artarak küme başına ortalama 15 pbc'den fazlaya ulaşır; bazı kümeler, görsel olarak sayılamayacak kadar çok pbc içerir. Kümeleşme fenotipinin frekansı, duble olarak gerçekleştirilen analizlerde sayılan her 1000 enfekte hücre başına kümelerde bulunan enfekte hücre sayısı olarak hesaplanır.

Bu videoyu izledikten sonra, Plasmodium falciparum platelet aracılı kümeleme analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız. Plateletleri sarsıntılı hareketlerle ve sıcaklık değişimleriyle aktive etmemeye dikkat edin. Bu analiz, ağır sıtırmada platelet aracılı kümeleme analizini ölçmek için de uygulanabilir.