In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize'a Time Lapse Mikroskopi kullanın C. elegans Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, yüksek güçlü bir mikroskopta bir gaz akışı kullanarak anoksiye maruz kalan deniz zarafeti embriyolarında hücre altı dinamikleri görüntülemek için in vivo bir tekniği tanımlamaktır. Bu, görüntüleme için uygun bir genç embriyo popülasyonu oluşturmak için önce genç yetişkin transgenik hayvanlardan bir örnek hazırlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, mikro inkübasyon odasında kullanılmak üzere ince agros ped slaytları hazırlayın.

Daha sonra deniz zarafeti uygun şekilde uyuşturulur ve gaz akışına maruz kaldığında kurumasını önlemek için halo karbon yağı ile kaplanır. Son olarak, uyuşturulmuş hayvanların bulunduğu yuvarlak kapak camı mikro inkübasyon odasına yerleştirilir. Oda daha sonra mikroskop aşamasına yerleştirilir ve anoksik bir ortam oluşturmak için nitrojen gazı ile doldurulurken, sonuçta mikro inkübasyon odasından bir gaz akışı kullanılır.

İn vivo floresan mikroskobu ile birlikte, anoksiye yanıt olarak hücre döngüsü durmasının yüksek çözünürlüklü ayrıntılı videolarına ve görüntülerine izin verir. Bu tekniğin dolaylı immünofloresan gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hayvanlar belirli koşullara maruz kaldığında hücre altı değişikliklerin in vivo olarak belgelenebilmesidir. Bu yöntem, elegans embriyolarında anoksiye bağlı askıya alınmış animasyon hakkında fikir verebilir.

Maya, hücre kültürü veya diğer küçük omurgasız veya omurgalı embriyoları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Hiperoksi sıcaklığı, stres veya küçük moleküllerle tedavi gibi ek koşullar da uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi olan Anastacia Garcia ve Mary Latt'tır Bu çalışmada ilgi duyulan uygun bir transgenik C Elgan suşu ile başlayın, TH 32 transgenik suşu, kromozomları ve sentrozomları hücre bölünmesi için belirteçler olarak görselleştirmek için kullanılacaktır.

Yerçekimi yetişkinlerini hipoklorit çözeltisinde parçalayarak senkronize bir popülasyon oluşturun ve kalan embriyoları yerçekimi yetişkinlerini tohumlanmış bir plaka ve yumurta üzerine toplayarak, bir ila iki saat yumurtlayarak veya karışık bir popülasyondan L dört larvayı yeni bir tohumlanmış plaka üzerine toplayarak kullanın. Nematodları 20 santigrat derecede GR genç yetişkinliğe kadar büyütün, bu da yumurtadan çıkmadan yaklaşık 96 saat, L bir larvadan 72 saat veya L dört tüy dökümünden 24 saat sonra alacaktır. Bu metodoloji, hücre altı ve çekirdek altı değişikliklerini görüntülemek için en uygun olan büyük küfürler ve çekirdekler içeren bol sayıda genç embriyo içeren bir genç yetişkin popülasyonu oluşturmak için bir araç sağlar.

Hazırlanan slaytları tutmak için nemli bir oda kurmak için, büyük bir Petri kabının veya yeterli büyüklükte bir kapakla kaplı çöp kutusunun içine nemli bir kağıt havlu yerleştirin. Karışımı cam eşyalarda mikrodalga fırın veya su banyosu ile ısıtarak deiyonize suda erimiş %2 aros hazırlayın. Sonraki yer, temiz bir cam mikroskobunda bir ila üç damla ılık aros Hemen aros damlalarının üzerine dik olarak ters çevrilmiş ikinci bir slayt yerleştirin ve elde edilen pedin ince ve hava kabarcıklarından arınmış olması için hafifçe bastırın.

Aros soğuduktan sonra, iki mikroskop lamını yavaşça ayırın ve aros pedini slaytlardan birinde sağlam bırakın. Aros pedinin mikroskobu odaklama yeteneğini engellemeyecek kadar ince olduğundan emin olmak önemlidir. Sonra. Aros pedini küçük kare bir mağaza haline getirmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanın.

Kullanıma hazır olana kadar hazırlanan nemli odada kayar. Aynı temiz tıraş bıçağını kullanarak, aros pedinin kenarını dikkatlice alın ve sürgüden 25 milimetrelik yuvarlak bir mikro kapak camına aktarın. Yuvarlak kapağın altında hava kabarcıklarının birikmesini önlemek için, cam mikro inkübatöre uygun şekilde sığmalıdır.

Aros pedine bir damla anestezik ekleyin. Beş ila 10 solucan seçin ve bunları anestezik damlasına yerleştirin. Solucanların hareketini durdurması için bir ila üç dakika bekleyin.

Bir pipet ucu kullanarak, hazneden gaz akarken solucanların dehidrasyonunu önlemek için solucanların üzerine bir damla kutsal karbon yağı ekleyin. Ardından, esnek plastik borunun bir ucunu hazneye bağlayın. Kapalı perfüzyon mikro inkübatörünün iki yarısını ayırın ve kapak camını dikkatlice alt halkaya dik olarak yerleştirin.

Haznenin iki tarafını sıkıca kapatın. Ardından hazneyi esnek plastik boru ile nitrojen gazı tankına bağlayın ve mikroskop tablasına yerleştirin. Embriyoları görüntülemek için borunun ve port tapalarının odanın yan tarafı boyunca güvenli bir şekilde takılmasını sağlayarak herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

İlk olarak, hayvanları daha düşük büyütme oranında bulun. Ardından uygun daha yüksek büyütme oranına geçin. Yetişkinlerde embriyonik küfürleri görüntülemek için, ilgilenilen hücrelerde GFP füzyon proteinini bulmak için 488 nanometre lazeri kullanın.

Hücre döngüsü durmasının belirli bir aşamasını görselleştirmek için, örneğin, geç faz, geç faz veya erken faz gibi hücre bölünmesinin önceki bir aşamasında bir küfür tanımlayın. Hazneyi nitrojen gazı ile perfüze edin ve nitrojen hazneyi doldururken küfürleri izlemeye devam edin ve odak düzlemini gerektiği gibi ayarlayın. Bu durumda istenen ilgi fenomenini yakalamak için hızlandırılmış görüntüleme yapın.

Profaz tutuklaması ve kromozomların iç nükleer zara kenetlenmesi. 30 dakikaya kadar her 10 saniyede bir fotoğraf çekin. Tipik olarak, anoksi kaynaklı faz durması, nitrojen gazı akışının başlamasından 20 ila 30 dakika sonra meydana gelir.

Anoksi kaynaklı tutuklama durumundan kurtarmayı belgelemek için, gazı kapatın ve hızlandırılmış bir seri kaydederken odanın normoxia'ya dönmesine izin verin. Hücre döngüsünün yeniden başlaması ve kromozomların geri alınması tipik olarak beş ila 20 dakika içinde gerçekleşir. Görüntüleri ve videoları işlemek ve bunları görüntülenmek üzere QuickTime'a aktarmak için erris image J veya Photoshop'u kullanın.

Anoksiye maruz kalan embriyo içinde, profaz kromozomları. Küfürler yoğunlaşacak ve iç nükleer çevre ile hizalanacak. Kromozomun kenetlenmesi olarak adlandırılan bir fenomen, yeniden oksijenlenme üzerine hücre döngüsü ilerlemesi devam edecek ve kromozomlar profaz olacaktır.

Küfür, nükleer çevreden ekvator plakasına doğru hareket edecek ve metafaza ilerlemeyi gösterecektir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde sahnelenmiş hayvanlar kullanılarak üç ila dört saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, deneyi tamamlamak için yeterli zaman ayırmak için yalnızca sağlıklı genç yetişkin hayvanları kullanmayı unutmamak ve uygun şekilde sahnelenmiş küfürleri seçmeyi öğrenirken sabırlı olmak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek güçlü mikroskopta GaN embriyoları ve odadan geçen bir gaz akışı kullanarak anoksi kaynaklı hücre altı olayların in vivo olarak nasıl yakalanacağını iyi anlamış olmalısınız.