Name: In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualizea Time Lapse Mikroskopi kullanın C. elegans Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, C. elegans embriyolarında anoksi altında hücre içi dinamikleri canlı görüntüleme tekniğini. Bu yöntem, mikro inkübasyon odası ve konfokal mikroskop kullanarak oksijen yoksunluğuna hücresel yanıtları incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz giriş ve Padilla Lab üyeleri yorumlarına için takdir ifade etmek istiyorum. Bu çalışmada Nematod suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Biz konfokal mikroskopi ile teknik yardım için Dr Lon Turnbull kabul ve teşekkür ederim. Bu çalışma PAP Ulusal Bilim Vakfı (NSF-IOS, KARİYER) hibe tarafından desteklenmiştir

1. Örnek Hazırlanması <ol><li> Uygun transgenik C. üretin ya da elde elegans transgenik metodolojiler kullanarak faiz veya Caenorhabditis Genetik Stok Merkezi (CGC) veya iş arkadaşından süzün. Hücre bölünmesi için belirteç olarak kromozomlar ve sentrozomlarda görselleştirmek için 5; Bu durumda biz (pasta-1 :: GFP :: H2B pasta-1 :: TBG-1 :: GFP) suşu TH32 kullanıyorsunuz. </li><li> Üç yöntemden birini kullanarak senkronize bir nüfus oluşturun: 1) hipoklorit solüsyonu içinde gebe yetişkin parçalanır ve bir numaralı seribaşı tabağa gravid yetişkin almak ve onları 1-2 saat süreyle embriyolar bırakmanı kalan embriyoların 6, 2) kullanmak, veya 3) L4 almak Yeni bir numaralı seribaşı plaka karışık bir nüfus ve hareketten larva. </li><li> 20 nematod büyümek ° C L1 larvaları veya 24 saat sonrası L4 dökücü gelen, kuluçkalık 72 saat yaklaşık 96 saat sürecektir gravid genç yetişkinlik, için. Utero Embriyolar (2-20 hücre) imag için optimum olan büyük blastomer ve çekirdekler içerening alt hücresel ve alt nükleer değişiklikler, sırasıyla. Bu metodoloji erken embriyo bol sayıda içerebilir genç yetişkinden oluşan bir popülasyon oluşturmak için bir araç sağlar. </li></ol> 2. Slayt Hazırlama ve Oksijen yetersizliği Odası Kurma <ol><li> Yeterli büyüklükte bir kapak ile örtülen geniş bir Petri kabı veya bölme içinde nemli bir kağıt havlu koyarak hazırlanan slaytlar tutmak için nemli odasına olun. </li><li> Mikrodalga veya su banyosu yoluyla cam içinde karışımın ısıtılması ile deiyonize H 2 O erimiş% 2&#39;lik agaroz hazırlayın. </li><li> Temiz bir cam mikroskop lamı üzerine sıcak agaroz 1-3 damla yerleştirin. Hemen agaroz damla (lar) üstüne dik ters ikinci bir slayt yerleştirin çıkan pad ince ve hava kabarcıkları serbest olacak, biraz böylece basın. </li><li> Serin ve yavaş slaytlar birinde agaroz ped zedelemeden iki mikroskop slaytlar parçalara ayırmak için zaman tanıyınız. Bu agaroz ped etkileşimler için yeterli değildir ince olmasını sağlamak için önemlidirDaha sonra mikroskop odaklanma yeteneği ile yeniden. Örnek görselleştirmek becerisi de mikroskoplar arasında değişebilir kullanımda hedefi özel optik mesafe bağlıdır. </li><li> Küçük bir kare içine agaroz pedi şekillendirmek için temiz bir jilet kullanın. Kullanıma hazır olana kadar hazırlanan nemli odasında saklayın. </li><li> Dikkatle, aynı temiz jilet kullanarak, agaroz altlığın kenarına almak ve yuvarlak bir 25 mm mikro coverglass üzerine slayt aktarmanızı, ped altında hava kabarcıkları birikimi kaçınarak. Kullanmak üzere seçilen yuvarlak coverglass microincubator uygun şekilde uyuyor. </li><li> Bir anestetik olarak kullanım için agaroz ped üzerine anestetik (% 0.5 tricaine, M9 tamponu içinde% 0,05 Tetramisole), bir damla ekleme. Anestezik damla içine 5-10 solucanlar ve yeri seçin. Hareketi durdurma solucanlar için 1-3 dk bekleyin. </li><li> , Yetişkin rahim içinde embriyoların gözlemleyerek, yerine disseke embriyoların gerekçesi embriyo desicca potansiyelini en aza indirmek içintion ve embriyo üzerinde azot gazı akışına bağlı hareket. </li><li> Hemen gaz odasına akardı olarak dehidratasyon solucanları önlemek için solucanlar üstüne Halokarbon bir damla yağ ekleyin. Halokarbon yağ viskoz olduğu tek solucanlar üzerine yağ ve damla toplamak için almak bir solucanın bir pipet ucu veya ipucu kullanabilirsiniz. </li><li> Solucanlar içeren dairesel coverglass hazırlandıktan sonra, Leiden iki yarısı microincubator ayrılır perfüzyon kapalı ve coverglass sonra dikkatlice alt halkaya dik yerleştirilir. Odanın iki tarafı da birbirine sıkıca kapatılır. </li><li> Oda sonra esnek plastik borular vasıtasıyla nitrojen gazı tanka bağlanmış ve mikroskop aşamada (Şekil 1C) üzerinde uygun noktaya yerleştirilir. Şu anda tüp ve microincubator dikkatle tüp ve odanın yan tarafındaki bağlantı fişleri güvenli bağlanma sağlayarak herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edilmelidir. Bir al edebilirsinizbu yüzden hafif bir sızıntı varsa oluşturacak kabarcıklar, aramak için tüp üzerinde sabun ve su küçük bir miktar yayılır. </li></ol> 3. Oksijen yetersizliği yılında Mikroskopi <ol><li> Alt büyütmede hayvanlar bulun, sonra, görüntü doku ya da bu gibi yetişkin embriyonik blastomerlerin veya oosit olarak ilgi hücreleri için uygun daha yüksek bir büyütmede (bu uygulama için 64x) getirin. GFP sinyali görüntülemek ve faiz hücre (ler) GFP füzyon proteini bulmak için 488 nm lazer açın. </li><li> Hücre döngüsü tutuklama belirli aşamasında tutuklama görselleştirmek için (örn. geç profaz) hücre bölünmesi önceki bir aşamada (örneğin geç interfaz ya da erken profaz) bir blastomer tanımlamak. Böyle sentriol konumu, kromozom kondensasyonu başlaması, kromozom konumu ve nükleer zarfın varlığı veya yokluğu gibi Hücresel belirteçler hücre döngüsü aşamada (Şekil 2A) belirlemenize yardımcı olacaktır. </li><li> Kamara, nitrojen gazı (% 99.999 ile perfüze edilmiştirN 2; &lt;2 ppm O 2). Biz 6 psi arasında bir basınç kullanımı bu durumda, ancak basınç ayarlanmış ve her bir microincubator boyutu ve kullanım boru çapına bağlı olarak, optimize edilmesi gerekebilir. Azot gerekli odak düzlemi ayarlayarak, kamara doldurur gibi blastomer (ler) izlemek için devam edin. </li><li> Bu noktada, time-lapse görüntüleme başladı. Görüntüleme iç nükleer membran kromozomların bu durumda profaz tutuklama ve yerleştirme yılında, faiz olgusu yakalamak için gerektiği kadar için yapılır. Görüntü 30 dakika daha uzun süreyle her 10 saniyede bir alınır. Görüntü yakalama ve bu kazanç ve lazer güç gibi ayarları Frekanslar gerektiğinde ayarlanmalıdır. </li><li> Embriyoların anoksik ortamda yanıt hangi zaman anoksi maruz kalan hücre döngüsü evresine göre değişebilir. Genellikle anoksi indüklenen profaz tutuklama azot gazı akışı başladıktan 20-30 dakika içinde oluşur. Biz anoksi indüklenen hücre döngüsü tutuklama occu gözlemledik&lt;20 dk içinde rring. Resimler bu süre esnasında elde edilebilir, ya da belirli görüntü daha sonra bir zaman ayarlı seri izole edilebilir. Ek bir seçenek embriyo alt hücresel yapılar görselleştirmek için video mikroskopi kullanmaktır. </li><li> Anoksi bağlı tutuklandı devleti kurtarma belgelemek için, gaz kapalı ve odasına bir time-lapse serisi kaydederken difüzyon ile normoksi dönmek için izin verilir. Kromozomların hücre siklus progresyonu ve undocking Sürmesine genellikle azot gazı kapatarak 5-20 dakika içinde gerçekleşir. </li><li> Ayrı deneylerde bir anoksi göstergesi resazurin, flow-through microchamber yerleştirildi unutmayın; bunun azot gazı akışı başladıktan sonra odasına yaklaşık 19 dakika ortalama anoksik hale belirlenmiştir. </li><li> Görüntüler ve videolar Imaris, Görüntü J veya Photoshop kullanarak işlenir ve görüntüleme için QuickTime alınır. </li></ol>

<ol><li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li>
<li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation%2C+diapause+and+quiescence%3A+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Hu, P. J. Dauer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+PJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-19 (2007).</li>
<li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+and+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Longevity and stress in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).</li>
<li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22The+Nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li>
<li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief%2C+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li>
<li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPadilla%2C+PA+%22Anoxia%22">Anoxia</a>. Padilla, P. A. , InTech. (2012).</li>
<li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPP-16%2FNup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li>
<li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li>
<li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Oksijen Yoksunluğu ve Asma Animasyon Ciddi oksijen yoksunluğu maruz bazı organizmalar için ölümcül olabilir rağmen, bazı organizmalar anoksi maruz hayatta edebiliyoruz. C. halinde elegans, anoksi maruziyet sağkalım gelişim safhasına ve anoksi yanıtın bağlıdır girişi gözlemlenebilir biyolojik süreçlerin bir dizi tutuklandı edildiği askıya animasyon bir tersinir durum içine. Oksijen ortamında 7,9 tekrar geri kadar Hücre bölünmesi, gelişme, hareket, beslenme ve üreme s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler / Ekipman </td><td></td><td></td><td> Kompozisyon </td></tr><tr><td> Hipoklorit solüsyonu </td><td></td><td></td><td> 0.7 g KOH, 12 ml% 5 NaOCİ, GKD 2 0 ile 50 ml&#39;ye getirmek </td></tr><tr><td> M9 tampon </td><td></td><td></td><td> 3 g KH 2 PO 4, 11 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 L GKD 2 O başına 1 ml (1 M) MgSO4 </td></tr><tr><td> Cam mikroskop slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;x1&quot; x1.0 mm </td></tr><tr><td> Yuvarlak mikro coverglass </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 72223-01 </td><td> 25 mm Çap </td></tr><tr><td> Halokarbon yağı 700 </td><td> Sigma </td><td> H8898-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Anestetik </td><td></td><td></td><td> % 0.5 gastrikaine,% 0.05 Tetramisole </td></tr><tr><td> Leiden Kapalı Perfüzyon Microincubator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> UHP Azot </td><td> Calgaz (Air Liquide) </td><td></td><td> &gt; 99,9990% N 2 &lt;2 ppm O 2 </td></tr><tr><td> Plastik boru </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0.062 &quot;ID x 0.125&quot; OD </td></tr><tr><td> Disk Konfokal Mikroskop Spinning </td><td> McBain Sistemleri </td><td></td><td> Zeiss optik mikroskop, Epifloresans aydınlatma sistemi, CSU-10 Yokogawa konfokal tarayıcı, Hamamatsu elektron çoğaltıcı CCD kamera ters. </td></tr></tbody></table>

in oksijen yetersizliği kaynaklı asma animasyon visualize&#39;a time lapse mikroskopi kullanın<em&gt; c. elegans</em&gt; embriyolar

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans yetişkin ve embriyo aşamalarında şeffaflık yanı sıra füzyon proteinleri 1-4 sayısız ifade genetik mutantlar ve transgenik suşların durumu kolaylaştırılır strese dayanıklılığı çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, hücre bölünmesi gibi dinamik süreçleri floresan etiketli muhabiri proteinleri kullanılarak izlenebilir. Mitoz çalışma dokunulmamış organizmalar dahil olmak üzere çok çeşitli sistemler de hızlandırılmış deneylerinin kullanılmasıyla kolaylaştırılabilir ve böylece ilk C. elegans embriyo de bu çalışma için uygundur. Yüksek güçlü bir mikroskop kurulum ile basit bir gaz akışı kullanarak stres mümkündür; Sunan burada anoksik yanıt (&lt;2 ppm O 2% 99.999 N 2) alt hücresel yapıların in vivo görüntüleme hangi bir tekniktir. Bir microincubation odasından geçen azot gazı akışı ve dönen bir disk konfokal mikroskop ile birlikte kullanılırhayvanlarda in vivo yansıması hangi kontrollü bir ortam oluşturmak için. Kullanma GFP etiketli gama tübülin ve histon, dinamikleri ve hücre bölünmesi tutuklama sırasında ve bir oksijen-yoksun ortama maruz kaldıktan sonra, önce izlenebilir. Bu tekniğin sonuçları oksijen yoksunluğu maruz embriyoların blastomer içinde yüksek çözünürlüklü, ayrıntılı video ve hücresel yapıların görüntülerdir.

Ciddi oksijen yoksunluğu (anoksi) maruz C. elegans embriyo gelişimi ve hücre bölünmesi 7 dahil biyolojik süreçleri tutuklayarak hayatta edebiliyoruz. Hücre bölünmesi anoksi indüklenen tutuklama hayvanlarda in vivo yansıması hangi kontrollü bir ortam yaratmak yoluyla azot gazı akışı ve dönen bir disk konfokal mikroskop ile birlikte bir microincubation odası kullanarak, bir alt-hücresel düzeyde, izlenebilir (Şekil 1). Ilgi Hücresel yapıları çeşitli gaz ortamlara maruz kalan em...

Bir burada tarif edilmekte<em&gt; In vivo</emBir dönen diske konfokal mikroskop ile birlikte microincubation odasından geçen bir gaz akımı kullanılarak anoksi maruz kalan hayvanlarda resim alt hücresel yapılara&gt; tekniktir. Bu yöntem basit ve deneysel parametreleri ve model sistemleri çeşitli uyacak kadar esnek.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Erişkin ve embriyo aşamalarının şeffaflığı sayesinde kolaylaşan stres direnci çalışmalarında *Caenorhabditis elegans* yaygın olarak kullanılmıştır...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek performanslı bir mikroskobun üzerinde gaz akışı düzeneği kullanılarak, anoksiye maruz bırakılan sea elegance embriyolarındaki hücresel alt yapı dinamiklerini görüntülemek için bir in vivo tekniğini tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle görüntüleme için uygun bir genç embriyo popülasyonu oluşturmak amacıyla genç yetişkin transgenik hayvanlardan bir örnek hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, mikro inkübasyon odasında kullanılmak üzere ince agros ped lamlar hazırlanır.Ardından, deniz canlıları uygun şekilde anestezi altına alınır ve gaz akışına maruz kaldıklarında kurumalarını önlemek için halokarbon yağı ile kaplanır. Son olarak, anestezi altındaki hayvanların bulunduğu yuvarlak lamel, mikro inkübasyon odasına yerleştirilir. Görüntüleme işlemi sırasında, mikro inkübasyon odası üzerinden bir gaz akışı kullanılarak anoksik bir ortam oluşturmak amacıyla oda mikroskop tablasına yerleştirilir ve azot gazı ile doldurulur.In vivo floresan mikroskopi ile birlikte kullanımı, anoksiye yanıt olarak ortaya çıkan hücre döngüsü duraklamasının yüksek çözünürlüklü, detaylı videolarının ve görüntülerinin elde edilmesine olanak tanır. Bu tekniğin indirekt immünofloresan gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hayvanlar belirli koşullara maruz bırakılırken hücre altı değişimlerin in vivo olarak belgelenebilmesidir. Bu yöntem, elegans embriyolarında anoksi kaynaklı süspansiyon durumuna (suspended animation) dair içgörü sağlayabilir.Bu yöntem ayrıca maya, hücre kültürü veya diğer küçük omurgasız ya da omurgalı embriyoları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Hiperoksi sıcaklığı, stres veya küçük moleküllerle tedavi gibi ek koşullar da uygulanabilir. Bu prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrencisi olan Anastacia Garcia ve Mary Latt'tır. Çalışmada ilgili uygun bir transgenik C Elgan suşu ile başlayın; bu çalışmada, hücre bölünmesi için işaretleyici olarak kromozomları ve sentrozomları görselleştirmek amacıyla TH 32 transgenik suşu kullanılacaktır.Hipoklorit solüsyonu ile yetişkinlerin yer çekimine bağlı çökelmesini sağlayarak onları parçalayıp senkronize bir popülasyon oluşturun; kalan embriyoları kullanmak için yer çekimine bağlı çöken yetişkinleri ekili bir plakaya aktarıp bir ila iki saat yumurta bırakmalarını bekleyin veya karma bir popülasyondan L4 larvalarını yeni ekili bir plakaya aktarın. Nematodları, yumurtadan çıkıştan itibaren yaklaşık 96 saat, L1 larvalarından itibaren 72 saat veya L4 değişiminden sonra 24 saat sürecek şekilde, GR genç yetişkinlik evresine gelene kadar 20 °C'de büyütün. Bu metodoloji, hücresel altı ve çekirdek altı değişimlerin görüntülenmesi için optimal olan geniş blastomerler ve çekirdekler içeren bol miktarda genç embriyoya sahip genç yetişkinlerden oluşan bir popülasyon oluşturma imkanı sağlar.Hazırlanan lamları muhafaza etmek için nemli bir hazne kurmak amacıyla, yeterli büyüklükte bir kapakla kapatılmış büyük bir Petri kabı veya kutunun içine nemli bir kağıt havlu yerleştirin. Karışımı bir mikrodalga fırın veya benmari vasıtasıyla cam malzemeler içerisinde ısıtarak, deiyonize su içerisinde %2 aros eritilmiş çözeltisi hazırlayın. Ardından, temiz bir cam mikroskop lamı üzerine bir ila üç damla ılık aros damlatın ve hemen üzerine ikinci bir lamı ters şekilde dik olarak yerleştirip, oluşan tabakanın ince ve hava kabarcıklarından arındırılmış olması için hafifçe bastırın.Aros yavaşça soğuduktan sonra, aros pedini lamlardan birinin üzerinde bütün halde bırakarak iki lamı birbirinden ayırın. Aros pedinin, mikroskobun odaklama yeteneğini engellemeyecek kadar ince olduğundan emin olmak önemlidir. Daha sonra, aros pedini küçük bir kare şeklinde düzeltmek için temiz bir jilet kullanın.Kullanılana kadar hazırlanan nemli oda içerisindeki lamlar bekletilir. Aynı temiz jilet kullanılarak, aros pad'in kenarı dikkatlice alınır ve lamdan 25 milimetrelik yuvarlak bir mikro kapatma camı üzerine aktarılır. Yuvarlak kapatma camının altında hava kabarcığı birikiminden kaçınılmalı ve cam, mikro inkübatöre uygun şekilde yerleştirilmelidir.Aros pedinin üzerine bir damla anestezik ekleyin. Beş ila 10 adet solucan seçin ve bunları anestezik damlasının içine yerleştirin. Solucanların hareketinin durması için bir ila üç dakika bekleyin.Gaz hazne içinden akıtılırken solucanların susuz kalmasını önlemek için, bir pipet ucu yardımıyla solucanların üzerine bir damla hallow karbon yağı ekleyin. Ardından, esnek plastik borunun bir ucunu hazneye bağlayın. Kapalı perfüzyon mikro inkübatörünün iki yarısını ayırın ve lamel camını dikkatlice alt halkanın üzerine dik konumda yerleştirin.Kameranın iki tarafını sıkıca kapatın. Ardından kamerayı, esnek plastik tüp aracılığıyla azot gaz tüpüne bağlayın ve mikroskop tablasına yerleştirin. Embriyoları görüntülemeden önce, tüpün ve kameranın yan tarafındaki port tıkaçlarının güvenli bir şekilde takılı olduğundan emin olarak herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.Öncelikle, düşük büyütmede hayvanların yerini belirleyin. Ardından uygun olan daha yüksek büyütmeye geçin. Yetişkinlerde embriyonik blasphemers görüntülemek için, ilgilenilen hücrelerdeki GFP füzyon proteinini bulmak üzere 488 nanometre lazeri kullanın.Hücre döngüsü duraksamasının belirli bir aşamasını, örneğin geç profazı görüntülemek için, geç interfaz veya erken profaz gibi hücre bölünmesinin önceki bir aşamasındaki bir blastomeri belirleyin. Hazneyi nitrojen gazı ile perfüze edin ve nitrojen hazneyi doldururken, gerektiğinde odak düzlemini ayarlayarak blastomerleri izlemeye devam edin. Bu durumda, ilgilenilen istenen fenomeni yakalamak için zaman ayarlı görüntüleme (time-lapse imaging) yapın.Profaz durması ve kromozomların iç nükleer membrana kenetlenmesi. 30 dakikaya kadar her 10 saniyede bir görüntü alın. Tipik olarak, anoksi ile indüklenen profaz durması, azot gazı akışının başlamasından sonraki 20 ila 30 dakika içinde gerçekleşir.Anoksi ile indüklenen duraklama durumundan geri dönüşü belgelemek için gazı kapatın ve zaman aşımı serisi kaydederken odanın normoksiye dönmesine izin verin. Hücre döngüsünün yeniden başlaması ve kromozomların çözülmesi tipik olarak beş ila 20 dakika içinde gerçekleşir. Görüntüleri ve videoları işlemek için erris image J veya Photoshop kullanın ve görüntüleme için bunları QuickTime'a aktarın.Anoksiye maruz kalan embriyoda, profaz kromozomları yoğunlaşacak ve nükleerB periferinin iç kısmına hizalanacaktır. Yeniden oksijenasyon üzerine kromozom kenetlenmesi (chromosome docking) olarak adlandırılan bu fenomenle birlikte hücre döngüsü ilerlemesi yeniden başlayacak ve profaz kromozomları oluşacaktır.Blasfeminin nükleer periferiden ekvatoral plağa doğru hareketi, metafaza geçişi gösterir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun evredeki hayvanlar kullanılarak üç ila dört saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, deneyi tamamlamak için yeterli zaman ayırmak adına yalnızca sağlıklı genç yetişkin hayvanlar kullanmayı ve uygun evredeki blasfemi seçimini öğrenirken sabırlı olmayı unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, yüksek çözünürlüklü bir mikroskop altında, gaz akışlı bir hücre ve GaN embriyoları kullanarak in vivo anoksi kaynaklı hücresel alt olayların nasıl görüntüleneceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız.

use-time-lapse-microscopy-to-visualize-anoxia-induced-suspended

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Bir protokol C. anoksi / açlıkla kullanan tarif edilir iskemi / reperfüzyon modeli elegans. Fonksiyonel sonuçlar artmış mortalite, GFP etiketli nöronal süreçleri görünür anormallikleri, ve nöronal fonksiyonu gerektiren bozulmuş davranışsal tepkileri içermektedir.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Burada, model nematod C. elegans'ın germ hattında eksprese edilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum raportörü kullanarak döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyumu görselleştirmek için protokoller ve araçlar sunuyoruz.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Öğrenin, C. elegans embriyolarında anoksi altında hücre içi dinamikleri canlı görüntüleme tekniğini. Bu yöntem, mikro inkübasyon odası ve konfokal mikroskop kullanarak oksijen yoksunluğuna hücresel yanıtları incelemenizi sağlar.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize'a Time Lapse Mikroskopi kullanın

Daha fazla video keşfet