In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize'a Time Lapse Mikroskopi kullanın C. elegans Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, yüksek güçlü bir mikroskop üzerinde gaz akış düzeneği kullanarak anoksiye maruz bırakılan sea elegance embriyolarındaki hücresel altı dinamikleri görüntülemek için bir in vivo tekniği tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle görüntüleme için uygun bir genç embriyo popülasyonu oluşturmak amacıyla genç yetişkin transgenik hayvanlardan oluşan bir örnek hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, mikro inkübasyon odasında kullanılmak üzere ince agros ped lamları hazırlanır.

Ardından, deniz zarifleri uygun şekilde anesteziye alınır ve gaz akışına maruz kaldıklarında kurumalarını önlemek için halokarbon yağı ile kaplanır. Son olarak, anestezi altındaki hayvanların bulunduğu yuvarlak lamel, mikro inkübasyon odasına yerleştirilir. Oda daha sonra mikroskop tablasına yerleştirilir ve görüntüleme sırasında anoksik bir ortam oluşturmak için mikro inkübasyon odasından geçen bir gaz akışı kullanılarak azot gazı ile doldurulur.

In vivo floresan mikroskopi ile birlikte kullanımı, anoksiye yanıt olarak meydana gelen hücre döngüsü durmasının yüksek çözünürlüklü, detaylı videolarını ve görüntülerini elde etmeyi sağlar. Bu tekniğin indirekt immünofloresan gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hayvanlar belirli koşullara maruz bırakılırken hücresel alt düzeydeki değişikliklerin in vivo olarak belgelenebilmesidir. Bu yöntem, elegans embriyolarında anoksi kaynaklı askıya alınmış animasyon (suspended animation) hakkında bilgi sağlayabilir.

Ayrıca maya, hücre kültürü veya diğer küçük omurgasız ya da omurgalı embriyoları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Hiperoksi sıcaklığı, stres veya küçük moleküllerle tedavi gibi ek koşullar da uygulanabilir. Bu prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrencisi olan Anastacia Garcia ve Mary Latt'tır. Çalışmada ilgi duyulan uygun bir transgenik C Elgan suşu ile başlayın; bu çalışmada, hücre bölünmesi için belirteç olarak kromozomları ve sentrozomları görselleştirmek amacıyla TH 32 transgenik suşu kullanılacaktır.

Hipoklorit çözeltisi içinde yerçekimi yetişkinlerini parçalayarak senkronize bir popülasyon oluşturun ve geri kalan embriyoları ekimli bir plakaya alarak yerçekimi yetişkinlerinin bir ila iki saat yumurtlamasını sağlayın veya karışık bir popülasyondan L4 larvalarını yeni ekimli bir plakaya seçin. Nematodları, yumurtlamadan yaklaşık 96 saat, L1 larvalarından 72 saat veya L4 dökümünden 24 saat sonra gerçekleşecek olan erken yetişkinlik dönemine kadar 20 °C'de büyütün. Bu metodoloji, hücre altı ve çekirdek altı değişimlerin görüntülenmesi için uygun olan büyük blastomerler ve çekirdekler içeren çok sayıda genç embriyoya sahip genç yetişkin popülasyonu oluşturma imkanı sağlar.

Hazırlanan lamları muhafaza etmek için nemli bir oda kurmak amacıyla, yeterli büyüklükte bir kapakla örtülmüş geniş bir Petri kabının veya kutunun içine nemli bir kağıt havlu yerleştirin. Karışımı bir cam kap içerisinde mikrodalga fırın veya benmari yardımıyla ısıtarak, deiyonize su içinde %2'lik erimiş aros hazırlayın. Ardından, temiz bir cam mikroskop lamı üzerine bir ila üç damla sıcak aros damlatın; hemen ardından ikinci bir lamı aros damlalarının üzerine ters ve dik bir şekilde yerleştirin ve oluşan tabakanın ince ve hava kabarcıklarından arınmış olması için hafifçe bastırın.

Aros yavaşça soğuduktan sonra, aros pedini slaytlardan birinin üzerinde bırakacak şekilde iki mikroskop lamını birbirinden ayırın. Aros pedinin, mikroskobun odaklama yeteneğini engellemeyecek kadar ince olduğundan emin olmak önemlidir. Daha sonra, temiz bir jilet kullanarak Aros pedini küçük bir kare şeklinde düzeltin.

Slaytlar, kullanıma hazır olana kadar hazırlanan nemli odada bekletilir. Aynı temiz jilet kullanılarak, aros pedinin kenarı dikkatlice alınır ve slayttan 25 milimetrelik yuvarlak bir mikro lam üzerine aktarılır. Yuvarlak lamın altında hava kabarcığı birikmesinden kaçınılmalı ve cam, mikro inkübatöre uygun şekilde yerleştirilmelidir.

Aros pedinin üzerine bir damla anestezik ekleyin. Beş ila 10 adet solucan seçip anestezik damlasının içine yerleştirin. Solucanların hareketinin durması için bir ila üç dakika bekleyin.

Gaz hazne üzerinden akıtılırken solucanların dehidrasyonunu önlemek için bir pipet ucu yardımıyla solucanların üzerine bir damla hallow karbon yağı ekleyin. Ardından, esnek plastik borunun bir ucunu hazneye bağlayın. Kapalı perfüzyon mikro inkübatörünün iki yarısını ayırın ve lamel camı dikkatlice alt halkanın üzerine dik olarak yerleştirin.

Hücrenin iki yanını sıkıca kapatın. Ardından, hücreyi esnek plastik boru aracılığıyla nitrojen gaz tankına bağlayın ve mikroskop tablasına yerleştirin. Embriyoları görüntülemek için, borunun ve hücre yanındaki port tıpalarının güvenli bir şekilde takılı olduğundan emin olarak sızıntı kontrolü yapın.

Öncelikle, hayvanları düşük büyütmede bulun. Ardından uygun olan daha yüksek büyütmeye geç. Erişkinlerdeki embriyonik blasphemers'ları görüntülemek için, ilgili hücrelerdeki GFP füzyon proteinini tespit etmek amacıyla 488 nanometre lazeri kullan.

Hücre döngüsü duraksamasının belirli bir evresini, örneğin geç profazı görselleştirmek için, geç interfaz veya erken profaz gibi hücre bölünmesinin önceki bir evresindeki bir örneği belirleyin. Hazneyi azot gazı ile perfüze edin ve azot hazneyi doldururken, gerektiğinde odak düzlemini ayarlayarak örnekleri izlemeye devam edin. Bu durumda, ilgilenilen istenen fenomeni yakalamak için zaman ayarlı (time lapse) görüntüleme yapın.

Profaz durması ve kromozomların iç nükleer membrana kenetlenmesi. 30 dakikaya kadar her 10 saniyede bir görüntü alın. Genellikle, anoksia ile indüklenen profaz durması, azot gazı akışının başlamasından sonraki 20 ila 30 dakika içinde gerçekleşir.

Anoksi ile indüklenen duraklama durumundan iyileşmeyi belgelemek için gazı kapatın ve zaman ayarlı bir seri kayıt alırken odanın normoksiye dönmesini sağlayın. Hücre döngüsünün yeniden başlaması ve kromozomların eski haline dönmesi tipik olarak beş ila 20 dakika içinde gerçekleşir. Görüntüleri ve videoları işlemek için erris image J veya Photoshop kullanın ve bunları görüntüleme için QuickTime'a aktarın.

Anoksiye maruz kalan embriyoda, profaz kromozomları yoğunlaşacak ve nükleer periferin iç kısmıyla hizalanacaktır. Reoksijenasyon üzerine kromozom kenetlenmesi (chromosome docking) olarak adlandırılan bu fenomenle birlikte, hücre döngüsü ilerlemesi yeniden başlayacak ve profaz kromozomları oluşacaktır.

Blasphemy'nin nükleer periferden ekvatoral plakaya doğru hareket etmesi, metafaza geçişi gösterir. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun evredeki hayvanlar kullanılarak üç ila dört saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, deneyi tamamlamak için yeterli zaman ayırmak adına yalnızca sağlıklı genç yetişkin hayvanların kullanılması ve uygun evredeki blasphemers'ları seçmeyi öğrenirken sabırlı olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, GaN embriyoları ve yüksek güçlü bir mikroskop üzerindeki gaz akışlı bir hazne kullanarak in vivo anoksi kaynaklı hücre altı olayların nasıl yakalanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.