An

Bu prosedürün genel amacı, beslenme motor programları sırasında sinirlerden, kaslardan ve nöronlardan gelen elektriksel aktiviteyi ve beslenme aparatının buna karşılık gelen hareketlerini kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle anestezi uygulanmış bir plegia'dan bukkal kütlenin çıkarılması ve ana sinir ile kaslara kanca elektrotların takılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise bukkal kütlenin bir kayıt kabına yerleştirilmesi ve gangliyonların hücre dışı kayıt için hazırlanmasıdır.

Ardından, hücre dışı elektrotlar kullanılarak hedef nöronlar tespit edilir. Son adım ise ısırma, yutma ve reddetme gibi beslenme motor programlarını indüklemek ve kaydetmektir. Nihayetinde, askıya alınmış bukkal kütle preparatı, bukkal kütlenin farklı beslenme benzeri hareketleri sırasında sinirlerin, kasların ve bireysel nöronların aktivitesini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin izole ganglion çalışmaları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sinirlerden, kaslardan ve tekil nöronlardan alınan kayıtların doğrudan beslenme aparatının hareketleriyle ilişkilendirilebilmesidir. Prosedürün gösterilmesine laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi huu yardımcı olacak. Prosedüre başlamak için, bir diseksiyon tepsisindeki 200 ila 300 gram ağırlığındaki sağlıklı bir plegia'ya, vücut ağırlığının yaklaşık %50'si kadar izotonik magnezyum klorür enjekte ederek anestezi uygulayın. Hayvanın kuyruğu yakınına yapılan ilk enjeksiyondan sonra, magnezyum klorürün yayılmasını sağlamak için hayvanın yüzeyine nazikçe masaj yapın.

Gerektiğinde hayvanın baş kısmına ek enjeksiyonlar yapın. Hayvan hafif dokunsal uyarılara yanıt vermeyi kestikten sonra, dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde tepsiye iğneleyin. Kuyruğa bir iğne ve her bir ön tentaküle birer iğne yerleştirin.

Ardından, pens kullanarak hayvanın başının ortasındaki deriyi sıkıştırıp kaldırın. Rhino fours'un arkasında, tutulan noktanın hemen gerisinden hayvanın başı boyunca koronal bir insizyon yapın. Bundan sonra, bukkal kütleyi açığa çıkarmak için rhino fours arasında ağıza doğru orta sagital bir insizyon yapın.

Ardından, deri flebini bukkal kütleden uzaklaştırın ve vücut duvarına tutunan sinirleri ve bağ dokusunu kesin. Bu deri flebini bukkal kütleden tamamen ayırmak için, bukkal kütlenin kendisine ait herhangi bir siniri veya dokuyu kesmediğinizden emin olun. Sonrasında, özofagusu yakalayıp tutun.

Tutulan noktanın arkasından özofagusu kesin. Özofagusu yukarı çekin ve bukkal kitlenin arkasındaki bukkal kitleyi kaldırın. Serebral, plöral ve pedal ganglionlar bir halka oluşturur ve serebral ganglion, serebro-bukkal konnektifler aracılığıyla bukkal ganglionlara bağlanır.

Bu halka gangliyonlarını bukkal kütleye bağlı bırakın ve bu gangliyonlardan vücudun diğer kısımlarına uzanan tüm sinirleri kesin. Ardından bukkal kütlenin etrafındaki bağ dokusunu kesin ve bukkal kütle vücuda daha az bağlandıkça onu yukarı kaldırmaya devam edin. Bukkal kütle sadece ağza bağlı kaldığında, özofagusu ve bukkal kütleyi tutun.

Dümdüz kesin. Bukkal kütleyi gövdeden ayırmak için çenelerin hemen önünden son bir kesi yapın. Elektrotlar takılırken kısmi anesteziyi sürdürmek için bukkal kütleyi %50 izotonik magnezyum klorür çözeltisi ve %50 SIA salin içeren bir çözeltiye yerleştirin.

Ardından, bukkal kütleyi çözelti ile birlikte, bukkal kütlenin ventral yüzeyindeki bukkal arter boyunca kesilmiş, puro tabanlı bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, pleural ve pedal ganglionların serebral gangliona olan bağlantılarını keserek bunları çıkarın. Serebral ganglionun, CBC'ler aracılığıyla bukkal ganglionlara ve bukkal kütleye bağlı kalmasını sağlayın ve serebral ganglion ile bukkal kütle arasındaki diğer bağlantıları kesin.

Yemek borusunu ve tükürük bezlerini kısa uzunluklarda kesin. Bu adımda, kanca elektrotları ular sinir gözüne, iki adet kas bukal sinirine (iki ve üç) ve bukal sinir ikisinin A dalına bağlayın. Collins ve Shield tarafından JoVE yayınında gösterilen ve burada kısaca özetlenen prosedüre benzer bir yöntem kullanın.

Her bir elektrot ayırma işlemi için, elektrodu sinire veya kasa yakın bir konuma yerleştirin, hedef siniri kancaya yerleştirin ve bir manipülatör kullanarak nazikçe kaldırın. Ardından, sinir kesitini bir Kim wipe ile kurulayın. Kancadaki sinire bir miktar hızlı jel süper yapıştırıcı uygulayın; kancanın tamamen yapıştırıcıyla kaplandığından ve referans telinin ucunun yapıştırıcıyla kaplanmadığından emin olun.

Ardından, çözeltiyi kaptan yapıştırıcıya uygulamak için polietilen boru eki olan bir şırınga kullanılır; bu işlem yapıştırıcının yüzeyinin donmasını sağlayacaktır. Bir sonraki adım, kayıt odası olarak kullanılacak 100 x 50 milimetrelik yuvarlak bir Pyrex kayıt kabını hazırlamaktır; sızıntıyı en aza indirmek için bir pipet ucu yardımıyla serebral ve buckling odaları arasındaki çentiğe ince bir vakum gresi tabakası uygulayın. Daha sonra ön odayı plescia salin çözeltisi ile doldurun.

Bukkal kütleyi Petri kabından yuvarlak Pyrex kabın ön haznesine dikkatlice aktarın ve sinirlerin kopmasına neden olabilecek hiçbir elektrodun gergin bir şekilde çekilmediğinden emin olun. Kabın başka bir binoküler diseksiyon mikroskobuna aktarılması gerekiyorsa kanca elektrotlar konusunda çok dikkatli olun. Kılıfın inceltilmesi için.

Bukkal kütlenin her iki yanındaki elektrotları beraberce gruplandırın. Konnektör pinlerini kapatan laboratuvar bandını tutarak elektrotları dikkatlice kavrayın ve elektrotların hiçbirinin sıkıca çekilmediğinden tekrar emin olun. Kap mikroskobun altına yerleştirildiğinde, elektrotlar kabın kenarlarına nazikçe yayılmalı ve ara verildiğinde veya deney aşamaları arasında platform üzerinde durmalıdır; bukkal kütle haznesindeki salini bir akvaryum hava taşı kullanarak havalandırın.

Ardından, CBC'ler çentiğin içinden geçecek şekilde serebral gangliyonu arka hazneye iğneleyin. CBC'lerin üzerine daha fazla vakum gresi uygulayın. Sonra, gangliyonların tamamen suya gömülmesi için kabın her iki kısmına daha fazla SIA salini ekleyin.

Odacıklar arasında sızıntı oluşmaması için salin seviyesinin, serebral ve bukkal odacıklar arasındaki vakum gresinin yüksekliğinden daha düşük olduğundan emin olun. Bu aşamada, bukkal kütle ön odacığın tabanında dinlenmelidir. Ardından, bukkal kütleye hâlâ bağlı olan sinirlere zarar vermemek için orta platformdaki bukkal gangliyonları iğneleyin.

Pinleri yalnızca iki sinir arasındaki kılıf üzerine yerleştirin. Ardından, CBC'leri germek ve sabitlemek için yan taraflarına iki pin daha ekleyin. Bukkal gangliyonları, ilgilenilen nöronların konumuna bağlı olarak düz veya döndürülmüş şekilde tutun.

Bukkal ganglionu döndürmek için, ince uçlu bir pens yardımıyla CBC'nin fazla kılıf kısmını tutun ve bunu ikinci bukkal sinir ile üçüncü bukkal sinir arasına iğneleyin. Böylece, arka hazneye yakın olan ve bukkal ganglionun üst kısmından kolayca erişilemeyen hücre gövdelerinin çoğu artık görülebilir hale gelir. Son olarak, bukkal ganglion kılıfının bukkal kütle tarafına yakın kısmına iki adet iğne ekleyin.

Bukkal ganglionun hareketini en aza indirmek için, bukkal ganglionun arka hazneye yakın olan kılıfını tutun ve hücre gövdelerini açığa çıkarmadan fazla kılıfı ince makasla kesin. Hasarı en aza indirmek için, kılıfın inceltilmesi işlemi tamamlandıktan sonra yalnızca hücre gövdelerini görmek için gerekli olan miktarda kılıfı kaldırın. Tüm elektrot pinlerini, amplifikatörlere bağlanan kablolar üzerindeki yuvalarına takın.

Elektrotların çok sıkı çekilmediğinden, uygun kablolara doğru şekilde bağlandığından ve geri kalan magnezyum klorürün yıkanması için polaritelerin doğru olduğundan emin olun. Bukkal kütle odasındaki SIA salin solüsyonunu taze SIA salin solüsyonu ile değiştirin. Ardından, bukkal kütlenin ön kısmındaki yumuşak dokudan ve çene kıkırdağının dorsalinden bir ipek sütür geçirin.

Sütürü kabın kenarına sabitlemek ve böylece bukkal kütleyi ön uç konumundan askıda tutmak için iki parça modelleme kili kullanın. Cam bir hücre dışı elektrodunu, elektrot ucu bukkal ganglionun yakınında olacak şekilde bir manipülatörle tutun. Bir nöronu konumlandırmak ve tanımlamak için hücre dışı elektrodun ucunu kılıfın üzerine nazikçe indirin.

Nöron somasının üzerine. Bir stimülasyon akımı uygulayın ve ardından, somayı uyarmak için kullanılan kanalı, hücre dışı elektrottaki aktiviteyi ve reddetmeyi tetiklemek için sinirlerdeki ilgili aktiviteyi kaydetmek amacıyla kayıt moduna geçirin. Motor programlar gibi, ees paternleri oluşturmak için bukkal sinir 2A'yı iki hertz'lik, bir milisaniyelik uzun bir darbe dizisiyle stimüle edin.

Kalıplar stimülasyon süresince devam eder ve stimülasyon sona erdikten kısa bir süre sonrasına kadar sürebilir. Isırma benzeri motor programları indüklemek için, birkaç adet katı karakol kristalini doğrudan serebral ganglionun üzerine yerleştirin.

Tekrarlayan paternler genellikle beş dakika içinde başlar ve yutmayı tetikleyecek şekilde azalmaya başlamadan önce yaklaşık 10 ila 15 dakika sürer. Motor programlarda olduğu gibi, caracol uygulayın ve bukkal kütle güçlü ısırıklar oluşturana kadar bekleyin. Ardından, bir ısırık sırasında, hayvanın deniz yosununu kavraması için ağzına bir şerit deniz yosunu yerleştirin.

Burada, tanımlanan motor nöron B dokuzun stimülasyonu ve kaydı ile aynı nöronun, I iki kasının ve beslenme motor programları sırasında birkaç sinirin kaydı yer almaktadır. Burada, aynı motor programlar serisinden alınan video görüntüleri bulunmaktadır. Yutma paternleri, serebral gangliyona karbahol uygulanması ve ardından karbaholle tetiklenen ısırma sırasında tutucuya bir deniz yosunu şeridinin yerleştirilmesiyle indüklenmiştir.

Bu görüntüde, yosunu kavramak için ragula dışarı uzatılmıştır ve bu görüntüde ise ragula, yosunu ağza doğru çekerek geri çekilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, askıda ağız kütlesi preparasyonunun nasıl kurulacağı ve in vitro beslenme motor program kayıtlarının nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.