Name: Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Keşfedin, diyabetik sıçanların karaciğerinde yardımcı bağımlı adenoviral vektör ile gen transferi kullanarak neo-islet oluşumunu nasıl indükleyebilirsiniz. Bu yöntem hiperglisemiyi tersine çevirerek insülin üreten beta hücreleri oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe ile desteklenmiştir: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), Diyabet ve Endokrin Araştırma Merkezi-(DERC - P30DK079638) Baylor Tıp Koleji&#39;nde, bir Pilot &amp; Fizibilite hibe DERC (VKY); Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı: JDRF Ödülü # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

HDAds erken nesil Reklamlar zayıflığı aşmak ve gen tedavisi uygulaması için koşum geliştirilmiştir. Ancak, teknik sorunlar devam etmektedir. Örneğin, HDAd HDAd paketleme ve vektör amplifikasyonu için HV erken nesil İlanlar kadar verimli değildir gerektirir. HV ilk jenerasyon İlan ve HV uzlaşma HDAd etkililiğini herhangi bir kirlenme olduğunu. Bu nedenle, yüksek verimli transfeksiyon ve her seri geçiş için en uygun koşulları önemlidir. Vektör üretimi için bir başka önemli parametre doğrudan doğruya süspansiyon hücreleri için aşı malzemesi olarak kullanılan 5 sonraki geçiş için kullanılması gereken pasaj (P1-P4) &#39;dir. Deneyim için, en iyi sonuçlar HDAd vektör oran önemli ölçüde aşağıdaki pasaj (Şekil 2&#39;de P3) artmış edildiği geçit ile elde edilmiştir. HDAd vektörleri verim transgen kaseti bağlıdır. Her iki genin altında olduğu için vektör üretimi sırasında, hem transgenlerin ifade edilmiştirher yerde organizatörü. Ngn3 bir transkripsiyon faktörüdür ve BTC olduğunu ifade büyüme hormonu vektör çoğaltma ve paketleme yardımcı olur ise hücre soyu vektör amplifikasyonu inhibe etkileyebileceğini HDAd vektör ifade transkripsiyon faktörü anlaşılacağı bir büyüme faktörüdür. Diyabet salgın boyutlarına varsayarak ile, b-hücre kitlesinin geri yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Bu yazıda, adacık büyüme faktörü ile birlikte adacık soy tanımlayan transkripsiyon faktörü, Ngn3 gen transferi etkileyecek HDAd vektörlerin avantajlarından yararlanmak için yöntemler tarif betacellulin karaciğerin periportal bölgelerinde adacık neogenesis ikna etmek. Bu etkinliğini değerlendirmek için, stabil hiperglisemi ile fare seçilir ve uygun kontrollerin her zaman dahil olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu gen transferi denemeleri için, boş bir vektör diyabetik farelerde daima kullanılmalıdır tedavi. Buna ek olarak, HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC kullanılarak ayrı ayrı diyabetik mi muamelece adacık neogenesis olarak bu iki genin tek katkı test etmek için kullanılır. Bizim veri yalnız Ngn3 adacık neogenesis ikna etmek için yeterlidir, ancak büyüme faktörü, BTC, ilavesi adacık neogenesis sağlam indüksiyon giden yanıtı artırmak için hizmet verdiğini gösterir gibi. Bu vektör ifade gerçekten hedef doku, karaciğer elde edilir ve aynı zamanda tedavi edilen farelerde plazma içinde test pankreatik insülin yokluğunda göstererek, pankreas adacıklarının kalıntı gelen olmadığını göstermek için test etmek için de önemlidir diyabetik farelerde adacık. Özet olarak, gen aktarımı için HDAd-vektör sisteminin avantajı, ev sahibi içine minimum toksisite kronik hem de vektör olmayan genom entegrasyon doğası ile karaciğerde yüksek bir klonlama kapasitesine, verimli transdüksiyonu ile uzun süreli bir gen ekspresyonu yatmaktadır kromozom. Birincil sınırlamalar üretimini ve yer karmaşık adımlar vardır onunİn vivo uygulama, öncelikle en popüler Reklam serotip 5 ile karaciğer ile sınırlıdır. Islet neogenesis tam Adacık büyüme faktörü, betacellulin birlikte adacık soy belirleyici transkripsiyon faktörü, Ngn3 gen transferi yoluyla karaciğerde adacık neogenesis uyararak plazma insülin ve diyabetik farelerde glukoz toleransı geri indüklenen olabilir. Bu yazıda, yüksek kaliteli HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC oluşturmak için uygun protokol göstermek ve hiperglisemi ters diyabetik farelerin karaciğerinde adacık neogenesis teşvik ve değerlendirmek tekniklerini göstermektedir. Dipnot: viral vektörler ve hücre hatları burada açıklanan Vector Üretim Çekirdek Laboratuvarı, Diyabet Araştırma Merkezi, Baylor College of Medicine (edinilebilir <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Bazı ticari kitleri HDAd virüsler (örn. Microbix biosyst üretmek için de kullanılabilirems Inc).

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> ProFectionR Memeli Transfeksiyon kiti </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Kan ve Doku Seti (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Sodyum deoksikolatın </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM tozu </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Higromisin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnaz </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNaz I, evre II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Batlarda </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Cam spinner matara </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Cam spinner matara </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> A-lyzer Casset kaydırarak </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tüp optiseal poli allomer, 11.2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Sezyum klorid 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultrasantrifüjdeki </td></tr><tr><td> Filtre </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> tüp 500 m santrifüjl </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner süzgeç </td><td> Braintree bilimsel, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> İnsülin, Fare ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Fare C-peptid ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> kobay anti-insülin antikoru </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> keçi anti-Pdx1 antikoru </td><td> Dr Christopher Wright hediye </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti Ngn3 antikor </td><td> Beta Hücre Biyolojisi Konsorsiyumu, Univ. Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> Fare anti Nkx6.1 antikor </td><td> Beta Hücre Biyolojisi Konsorsiyumu, Univ. Pennsy bölgesininlvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> Anti-betacellulin antikor </td><td> Hücre Bilimleri </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Renk Reaktif SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Renk Endpoint Reaktif Seti </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Spesifik Reaktifler ve Ekipmanları.

helper bağımlı adenoviral vektör-gen transferi ile diyabetik sıçanların karaciğerinde neo-islet oluşumu

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Tip 1 diyabet pankreasın insülin üreten hücrelerin T hücre-aracılı otoimmün yıkıma neden olur. Adacık transplantasyonu donör durumuna göre ve uzun vadeli immünosupresyon ihtiyacı ile sınırlı kalmıştır, çünkü şimdiye kadar insülin yerine, hala önemli bir tedavi yöntemidir. Neuogenin3 gen transferi (Ngn3), adacık soy tanımlayan spesifik transkripsiyon faktörü ve Betacellulin (BTC) Göre İsteyerek adacık neogenesis, bir adacık büyüme faktörü tip 1 diyabet tedavisi için bir potansiyele sahiptir. Adenoviral vektörlerin (Reklamlar) yüksek verimli gen transferi vektör olmakla birlikte, erken nesil İlanlar vivo kullanımı için çeşitli dezavantajları vardır. Helper bağımlı Reklamları (HDAds) Reklamlar erken nesil güvenlik profilini artırmak ve transgen ekspresyonu 1 uzatmak için geliştirilen en gelişmiş Reklamlar vardır. Viral kodlama dizilerinin 2-5 yoksun ve yalnızca Reklam cis El korumak çünkü kronik toksisite eksikliğivektör çoğaltma ve paketleme için gerekli, anahtar kelimeleri. Bu 36 kb genlerin kadar klonlama sağlar. Bu protokol, biz HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC oluşturmak ve STZ ile indüklenen diyabetik farelerde içine bu vektörler sunmak için yöntem açıklanmaktadır. Bizim sonuçlarımız HDAd-Ngn3 ve karaciğerde HDAd-BTC baskılanması &#39;neo adacık&#39; co-enjeksiyon ve diyabetik farelerde hiperglisemi tersine çevirebilmektedir.

Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Tip 1 diyabet, pankreastaki insülin üreten hücrelerin T hücresi aracılı otoimmün yıkımı nedeniyle meydana gelir. Şimdiye kadar insülin replasmanı hala...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yardımcıya bağımlı adenoviral vektör aracılı gen transferi ile diyabetik farelerin karaciğerinde neo-adacıklar oluşturmaktır. Bu işlem, adacık transkripsiyon faktörü neuro genini ve periportal neo-adacık oluşumunu indüklemek için adacık büyüme faktörü betalin'i taşıyan yardımcıya bağımlı adenoviral vektörler üretilerek gerçekleştirilir; ardından vektörler diyabetik farelere enjekte edilir. Tedavi edilen diyabetik farelerde kan glukozunun ve plazma insülininin normalleşmesi ile karaciğerde insülin üreten beta hücrelerinin varlığı test edilir.Bu analizlerden elde edilen sonuçlar, karaciğerin periportal bölgelerinde neo eyelid oluşumu sonucunda, vektör ile tedavi edilen farelerde hipergliseminin geri döndüğünü göstermektedir. Herpa bağımlı avir vektörün avantajı, geniş tropizm ve yüksek kronik kapasiteye sahip olmasıdır. Ayrıca, herpa bağımlı adenoviral vektör herhangi bir avir kodlama bölgesi içermemektedir.Bu nedenle kronik toksisite göstermez. Bu tekniğin etkileri, diyabet tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü yeni adacıkların indüksiyonu, donör eksikliği, greft yetmezliği ve alloimmünite ile sınırlı olan adacık transplantasyonuna etkili bir alternatiftir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez uygulayacak kişiler, vektör sınıfının büyük boyutu nedeniyle transfeksiyon sürecinin zorluğu sebebiyle güçlük çekeceklerdir.Virüs kontaminasyonunu en aza indirmek için amplifikasyon ve saflaştırma işlemi dikkatle yürütülmelidir. Yardımcı bağımlı adenovirüs vektörü üretimi, optimal sonuçlar için dikkatle takip edilmesi gereken birden fazla adım içerir. Transfeksiyon hazırlığı için, iki adet altı santimetrelik kabın her birine 800.001 16 hücre ekin.37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. İki gün sonra hücreler, transfeksiyon için %70 ile %80 oranında konfluente ulaşacaktır. Transfeksiyon gününde.Büyüme ortamını beş mililitre taze ortam ile değiştirin ve hücreleri üç saat boyunca inkübe edin. Ardından, Promega Transfect'ten temin edilen pro perfection arm mammalian transfection kitini kullanarak, 16 hücreyi neuro geni kodlayan 10 mikrogram DNA ile transfekte edin; bunlar bundan sonra three veya a beta hücresi olarak anılacak olan BTC şeklinde ifade edilecektir. Ertesi gün, hücreleri her seferinde bir mililitre büyüme ortamı ile iki kez yıkayın.Hücre başına 500 vektör partikül olacak şekilde, kalsiyum ve magnezyum içeren 0,1 mililitre PBS içinde yardımcı virüsü ekleyin. Ardından hücreleri her 10 dakikada bir inkübatöre yerleştirin. Yardımcı virüsü eşit şekilde dağıtmak için kapları nazikçe sallayın.60 dakika sonra, 1,5 mililitre idame besiyeri ekleyin ve kapları 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi gün, bir mililitre daha idame besiyeri ekleyin. Ardından, sitopatik etkileri değerlendirmek için hücreleri standart bir ışık mikroskobu altında inceleyin.Enfekte hücreler yuvarlaklaşacak ve ayrılacaktır. Enfekte hücrelerin inkübasyonuna ikinci güne kadar devam edin. Bu aşamada hücrelerin %80'inden fazlasında sitopatik etkiler görülmelidir.Ham viral lizatı pipetleme yöntemiyle toplayın ve beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Hacmin %10'u oranında %40 sukroz ekleyin. Bu tüpü, sıfırıncı pasaj ham viral lizatı için CVL olarak etiketleyin.Viral partiküllerin salınımı için, ham viral lizat içeren tüpü sırasıyla -80 °C dondurucuya ve 37 °C su banyosuna yerleştirerek üç kez dondur-çöz yapın. Üçüncü dondur-çöz döngüsünden sonra, eşlik eden metinde açıklandığı şekilde vektörü daha fazla amplifiye etmek için medyumu kullanın. Vektör amplifikasyon süreci, vektörün beşinci pasajından veya P5'inden ham viral lizat sağlayacaktır.Büyük ölçekli helper-bağımlı adenovirüs üretimi için, vektör amplifikasyon prosedüründen elde edilen P5 hücrelerini, daha önceki dondurma-çözme işlemi sırasında olduğu gibi üç kez dondurup çözerek başlayın. Üç litrelik spinner flask içindeki 1x10⁸ hücreyi 500 mililitrelik konik şişelere aktarın ve 1000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatantın 100 mililitresi dışındakilerin tamamını uzaklaştırın.Ardından hücreleri yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilen hücreleri 250 mililitrelik bir spinner flask'a aktarın. P five kaba viral lizatının tamamını ekleyin. Daha sonra hücre başına 200 viral partikül olacak şekilde yardımcı virüs ekleyin ve 37 °C'de 60 RPM'de bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hücre süspansiyonundan bir mililitreyi 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın; hücre süspansiyonunun geri kalanını yeni bir üç litrelik spinner flask'a aktarın ve iki litre süspansiyon büyüme besiyeri ekleyin. Hem flask'ı hem de plakayı iki gün boyunca karbondioksit inkübatöründe 60 RPM'de inkübe edin; sonraki iki gün boyunca plakadaki hücreleri sitopatik etkiler açısından takip edin.Plakadaki hücreler sitopatik etkiler gösteriyorsa, spinner flask içindeki hücreler de sitopatik etkiler gösterir. İnkübasyonun ardından, hücreleri santrifüj ile toplayın ve P altı olarak etiketlenmiş 50 mililitrelik bir tüp içinde 15 mililitre 100 millimolar tris. HCL ile yeniden süspanse edin.Bu tüpü saflaştırmaya kadar -80 °C'de saklayın. Vektörü saflaştırmak için, P6 ham viral lizat içeren çözünmüş tüpe 1 mL %5 sodyum doksikolat ekleyin. Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Ardından magnezyum klorür, RNAs A ve DNAs one ekleyin ve 37 °C'de bir saat inkübe edin; inkübasyonun ardından tüpü 6.000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı yeni bir 50 mL tüpe, sterilize edilmiş bir NVT 65 ultrasantrifüj tüpüne toplayın. 2,8 mL 1,25 g/mL düşük yoğunluklu sezyum klorür çözeltisi ekleyin.Ardından, iki mililitrelik bir pipet kullanarak, pipeti tüpün tabanına değdirip çözeltiyi yavaşça bırakarak tüpe 2,8 mililitre 1,41 gram/mililitre yoğunlukta CsCl çözeltisi ekleyin. Sonrasında, iki mililitrelik bir pipet kullanarak beş ila altı mililitre süpernatan ekleyin. Pipeti tüpün yan duvarına değdirip çözeltiyi yavaşça bırakarak tüp boyun kısmına kadar doldurulmalıdır.Aksi takdirde yüksek hızlı santrifüj sırasında çökebilir. Gerekiyorsa tüpün geri kalanını doldurmak için 100 millimolar tris HCL kullanın. Ardından, 10 °C'de 30 dakika boyunca 237, 000 ×g hızında santrifüjleyin.Yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjden sonra, opak hücre kalıntılarının altında tek bir opalesan vektör bandı görülür. Bazen, daha belirgin olan vektör bandının altında çok soluk bir yardımcı bant görülebilir. Tüpü, alttaki opalesan bandın olduğu bölgeden %70 ethanol ile silin.Ardından, 22 gauge iğne takılmış üç mililitrelik bir şırınga kullanarak, tüpün duvarını vektör bandının tabanından delin ve alttaki opalesan bandı toplayın. Toplanan vektör materyalini yeni sterilize edilmiş ultra santrifüj tüplerine aktarın, ardından tüplerin boyun kısmına kadar dolması için üzerine 1,35 g/mL sezyum klorür yoğunluk çözeltisi ekleyin.10 °C'de 237,000 ×g'de gece boyunca santrifüjleyin. İkinci yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjasyondan sonra, opalesan bandı daha önce olduğu gibi toplayın. Bandı bir diyaliz kasetine aktarın; ertesi gün 4 °C'de, magnezyum klorür ve sükroz içeren üç litre steril T tris, HCl karşısında gece boyunca diyaliz edin.Yardımcıya bağımlı adenovirüs vektörünü diyaliz kasetinden çıkarmak için, üç mililitrelik bir şırınga kullanarak kasetin üst köşesinden içeriye iki mililitre hava enjekte edin. Şırınga ve iğne alt köşede olacak şekilde kaseti çevirin ve kaseti dik konumda tutarak çözeltiyi şırıngaya çekin. Artık saflaştırılmış virüs içeren çözeltiyi etiketlenmiş kriyotüplere aktarın.Fiziksel titrasyon için 20 µL ve DNA karakterizasyonu için 50 µL hacminde örnekleri 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine dağıtın ve ardından dondurun. Kriyotüpler, saflaştırılmış virüsü -80 °C'de muhafaza eder. Saflaştırılmış virüs daha sonra titrasyon saflığı ve in vitro etkinlik açısından değerlendirilmelidir.Ekteki belgede açıklandığı üzere, diyabet indüklemek için strept Odin kullanılır. Ekteki belgede açıklandığı üzere, bu çalışmada strept zos ve tedavi edilen fareleri hiperglisemi açısından haftalık olarak izleyin. Kan glukozu 48 saat boyunca desilitre başına 250 ve 500 miligram arasında olduğunda, fareleri kuyruk veni enjeksiyonu için kuyruk veni sabitleyicisine yerleştirin.Kuyruk venlerini genişletmek için kuyruğu ılık su içeren 50 milliliter'lik bir tüpe yerleştirin. Ardından kuyruğu %70 ethanol emdirilmiş bir doku ile silin. 30,5 gauge iğneye sahip bir milliliter'lik şırıngayı, şırıngada hava kabarcığı kalmadığından emin olarak uygun konsantrasyondaki vektörle doldurun.Ardından başparmak ve işaret parmağı ile kuyruğu enjeksiyon bölgesinin altından kavrayın ve iğneyi kuyruk venine yerleştirin. İğne venin içindeyse, iğnenin göbeğinde bir kan parlaması görülebilir. Vektörü yavaşça enjekte edin.İğne uygun şekilde yerleştirildiyse, enjeksiyon sırasında ve sonrasında herhangi bir dirençle karşılaşılmaz. Fareyi kafesine geri koymadan önce, kanamayı durdurmak için iğneyi çıkarın ve enjeksiyon bölgesini gazlı bezle bastırın. Vektör tedavisinden sonra, altı saatlik açlık glikozunu ve vücut ağırlığını haftalık olarak; insülin ve karaciğer enzimi seviyelerini ise iki haftada bir izleyin.Tedavi sonrası üçüncü ve altıncı haftalarda, glikozla stimüle edilen insülin sekresyonunun in vivo olarak geri kazanılıp kazanılmadığını test etmek için altıncı haftada bir glikoz tolerans testi gerçekleştirin. Diyabetik farelerin karaciğerinde adenoviral vektör aracılı gen transferi yoluyla adacık neogenezinin indüklenip indüklenemeyeceğini değerlendirmek amacıyla, doku MNA analizi ve immün boyama için farelerden karaciğer ve pankreası toplayın. Helper bağımlı adenovirüs veya H-D-A-D-N-G-N three ve BTC vektörleri bu videoda açıklandığı şekilde hazırlanmış ve saflaştırılmış olup, vektörler streptozotosinle indüklenen diyabetik farelere kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla uygulanmıştır.Boş vektörler ve tek başına H-D-A-D-B-T-C vektörleri negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Kan glukozu, enjeksiyondan sonraki 7 ila 10 gün boyunca her iki günde bir izlenmiştir. Hiperglisemi, hem HDAD ve GN three hem de H-D-A-D-B-T-C enjekte edilen farelerde tersine dönerken, kontrol farelerinde dönmemiştir.Glikozla uyarılmış insülin sekresyonu, burada görüldüğü üzere tedaviden altı hafta sonra gerçekleştirilen bir glikoz tolerans testi ile de izlendi. İnsülinin karaciğerde sentezlenip sentezlenmediğini değerlendirmek amacıyla, hem HDAD ve GN three hem de H-D-A-D-B-T-C enjekte edilen farelerde insülin sekresyonu yeniden sağlandı. Karaciğerdeki C-peptid ve insülin içeriği analiz edildi.C-peptit konsantrasyonları ve toplam insülin içeriği, ticari bir ELISA kiti kullanılarak ölçülmüştür. Peptit ve insülinin molar oranlar şeklinde varlığı, karaciğerde tespit edilen insülinin gerçekten karaciğerde sentezlendiğini doğrulamaktadır. İmmünohistokimya; HDAD, NGN3 ve H-D-A-D-B-T-C ile tedavi edilen farelerin karaciğerinde pozitif hücreler göstermiş, ancak kontrol vektörü ile tedavi edilen farelerde göstermemiştir; immün boyama ayrıca NGN3 BTC ile tedavi edilen farelerin pankreasında kalıntı adacık bulunmadığını kanıtlamıştır.Göz kapağına özgü soy hattı transkripsiyon faktörü ekspresyonu, karaciğerin immün boyaması ile de değerlendirilmiştir. Burada gösterildiği gibi, NGN three, NGN three BTC ile tedavi edilen farelerin karaciğerinde eksprese edilmiş ancak boş vektör ile tedavi edilen farelerde eksprese edilmemiştir.Benzer şekilde, burada görüldüğü üzere, NGN three BTC ile tedavi edilen farelerin karaciğerlerinde BTC, boş vektör tedavisine kıyasla daha yüksek düzeyde eksprese edilmiştir. P DX one immün boyaması, NGN three BTC ile tedavi edilen karaciğerlerde nükleer lokalizasyon ortaya koyarken, boş vektör ile tedavi edilen fare karaciğerlerinde bu durum görülmemiştir. NK X 6.1 de yalnızca alınan NGN three BTC ile tedavi edilen fare karaciğerlerinde tespit edilmiştir.Birlikte değerlendirildiğinde, bu sonuçlar fare karaciğerinde yeni göz kapağı oluşumunun başarıyla indüklendiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, göz kapağı çizgisi neogenezini indüklemek amacıyla, göz kapağı soyunu belirleyen genleri karaciğere aktarmak için yardımcı faktöre bağımlı adenoviral vektörlerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç hafta içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, yardımcı virüsün bize yardımcı olan birinci nesil bir avir olduğunu hatırlamak önemlidir. İn vivo uygulamalar için kontaminasyon minimum düzeyde tutulmalıdır.

neo-islet-formation-liver-diabetic-mice-helper-dependent-adenoviral

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Izole adacık transplantasyonu tip 1 şeker hastalığı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Burada, fare pancreata adacıkları izole, ve böbrek subkapsüler alan nakli için bir yöntem açıklanmaktadır.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Bu protokol bir diyabet tedavisi için terapötik hedefleri bulmak için işlevsel beta hücre kitlesi modüle faktörleri belirlemek sağlar. Protokolü adenovirüsler ile gen ekspresyon manipülasyonu takiben izole sıçan adacıklarında adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için modern bir yöntem oluşur.

Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets

Biz adacık antigen spesifik primer CD4 + T-hücrelerinin adoptif transfer yoluyla, iki hafta içinde farenin tip 1 diyabet (tip 1 diyabetin) ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Bir mouse adacıkları omental nakli için bir yöntem tanıttı. İzole adacıkları hidrojel ile karıştırılır ve karışımı bir diyabetik fare omental kese yerleştirilir. Daha sonra kan şekeri izlenir ve IMMUNO-histochemical çözümleme yapılır.

Adacık nakli için Mouse omentumun için bir yöntemi

Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Pankreas adacık nakli normoglycemia tip 1 diyabet için bir yoludur. Bu makale nakli tekniği normal glikoz düzeyleri diyabetik farelerde korumak için intraportal rota üzerinden üzerinde duruluyor.

İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Kısa saç iğnesi RNA (shrna) taşıyan Lentivirus tarafından dönüştürücü olan dağınık insan Islet hücrelerinden gen modifiye insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol kolay kullanılabilir enzim ve kültür gemileri kullanır, kolayca yapılabilir ve fonksiyonel ve morfolojik çalışmalar için uygun genetiği değiştirilmiş insan pseudoislets üretir.

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Bu protokol, spontan diyabetik NOD farelerinden saflaştırılmış splenositlerle mücadele eden obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli farelerde NIT-1 hücrelerinin nakli ve görüntülenmesi için basit ve minimal invaziv bir yöntemi tanımlamaktadır.

Farelerde Otoimmün Diyabetin Evlat Edinilen Transfer Modelinde Greft Sağkalımının Biyolüminesan İzlenmesi

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Keşfedin, diyabetik sıçanların karaciğerinde yardımcı bağımlı adenoviral vektör ile gen transferi kullanarak neo-islet oluşumunu nasıl indükleyebilirsiniz. Bu yöntem hiperglisemiyi tersine çevirerek insülin üreten beta hücreleri oluşturur.

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Daha fazla video keşfet