Name: Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Öğrenin akış sitometri ile negatif seleksiyon kullanarak murin tip II alveol epitel hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem yüksek saflıkta ve canlılıkta hücre sağlayarak solunum hastalıklarının fonksiyonel ve moleküler çalışmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz biyogüvenlik düzeyi 2 örneklerinden birincil fare AECII sıralama içinde teknik yardım için M. Höxter teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma DB Alman Araştırma Topluluğu (DFG) (SFB587, TP B12 ve BR2221/1-1) ve Hannover Biyomedikal Araştırma Okulu (DFG GSC 108) AA bir nakit hibe ile desteklenmiştir. DB Başkan Girişimi ve sözleşme numarası W2/W3-029 altında Alman Araştırma Merkezleri Helmholtz Derneği (HGF) ve Ağ Fonu tarafından desteklenmektedir.

Gerekli reaktifleri ve materyalleri ilişkin ayrıntıları aşağıda protokolünün sonunda tabloda listelenmiştir. Çalışmaya başlamadan önce, 4 dispase ml ve ° C su banyosunda 37 öncesi ılık bunları içeren 15 ml tüpler (fare başına bir) hazırlamak. Bir ısıtma bloğu, kısaca 95-1% düşük erime agaroz (su) küçük alikotları ısıtmak ° C sıvılaştırılmış kadar ve kullanıma kadar 45 ° C ye sonradan serin. 1. Fare Akciğer hazırlanması <ol><li> CO 2 boğulma tarafından fare Kurban. Not: başarıyla yapılamaz, böyle bir sıvı ile akciğer kurulum gibi, protokol adımları izleyerek, böylece bu trakea yaralama gibi servikal dislokasyon yapmayın. Nosiseptif reflekslerinin kaybı olun. </li><li> Etanol ile fare Sprey ve vücut ventral orta hat boyunca uzun bir kesim yapmak. Ventral kürk ve deri çekin ve daha sonra da dikkatlice kesilmiş ve periton çıkarın. </li><li> ExsanguinateSağ ve sol juguler ven (laktasyonun) yanı sıra renal arter (Arteria renalis) keserek fare. Doku ile akan kan çıkarın. </li><li> Dikkatlice sonra delinme ve kaburga keserek kalp ve akciğer maruz sökmek. Akciğer kesmemeye özel dikkat gösterin. </li><li> Soğuk fosfat dolu bir 26G kanül ve 10 ml şırınga ile salin (PBS), ponksiyon kalbin sağ ventrikül tamponlu ve kan serbest kadar PBS ile akciğer serpmek. </li><li> Trakea maruz tükürük bezlerinin kesin ve çıkarın. Ayrıca dikkatle trakea çevreleyen kas kesti. </li><li> Trakea içine 22G kanüllerin yerleştirin, iğneyi çıkarın ve akciğer doğru plastik kateter itin. Trakea ve kateter etrafında iplik küçük bir parça bağlayarak kateter Fix. </li></ol> 2. Akciğer Doku Enzimatik Sindirim İsterseniz, bronkoalveoler lavaj sıvısı örneği olabiliradımdan önce PBS veya orta trakea takılı kateter yoluyla akciğerlere kızarma tarafından hazırlanmıştır. <ol><li> 2 ml&#39;lik şırınga yardımıyla, her lobun tam olarak genişletilmiş, böylece kateter yoluyla akciğer içine dispase 2 ml (4 ml bir örnek gelen) bir maksimum hacim aşılamak. Sıvılaştırılmış agaroz 0.5 ml içeren 1 ml şırınga ile şırınga değişim ve aynı zamanda akciğer içine aşılamak. </li><li> Agaroz geri akışını önlemek ve hemen laboratuar kağıt mendil ve buz ile akciğer karşılamak için kateter üzerinde şırınga bırak. Birkaç dakika için agaroz jel olsun. </li><li> , Kağıt mendil, buz, şırınga ve kateter çıkarın trakea ve tüketim akciğer, kalp ve göğüs timus kesti. Sonra PBS ile bir tabak içinde akciğer durulayın ve kalp, timus ve kalan trakea çıkarın. </li><li> Dispase geri kalan kısmı 2 ml akciğer içine yerleştirin ve 45 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir. </li></ol> 3. Akciğer hazırlanmasıHücre Süspansiyon <ol><li> Dispase gelen akciğer çıkarın ve DMEM ortamı ve 100 ul içinde DNase anti-CD16/32 antikor 7 ml (1 ug / ml nihai konsantrasyon) ihtiva eden bir çanak içine aktarın. </li><li> Forseps kullanarak, tamamen ayrı çekerek akciğer doku parçalanır ve yavaşça 200 rpm ayarlanmış bir rocker üzerinde sallanan ise oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Arzu edildiği takdirde, hücre süspansiyonu daha sonra bir sonraki adıma kadar 4 ° C de muhafaza edilebilir. </li><li> 100 mikron ve daha sonra 70 mikron, 48 mikron ve 30 mikron gözenek ile ilk naylon kafesleri yoluyla hücre süspansiyonu filtre. Hücre kaybını en aza indirmek ve verimi en üst düzeye çıkarmak için de DMEM ile tüpler ve iyice yemekleri gibi her örgü durulama özen gösterin. Eğer örnek birleştirilmesi, bu daha sonra aynı filtre ile bir grup farelerden alınan hücreler süspansiyonlar geçerek burada elde edilebilir. Tıkanma durumunda filtre yenileyin. </li><li> Hacmine bağlı olarak, bir tane ya da daha fazla 50 mL tüpler ve süzüntü aktarmak160 x g &#39;de 15 dakika, 4 ° C&#39;de santrifüj Süpernatantı. </li><li> 2 ml eritrosit lizis tamponu (0.15 M NH4CI, 0.01 M KHCO 3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2) içinde yeniden süspanse edin ve hücre peleti hızla DMEM ortamı 13 ml ilavesiyle lizis sona erer. 160 x g&#39;da 12 dk, 4 ° C&#39;de bir 15 ml tüp ve santrifüj çözelti aktarın </li></ol> 4. Akış Sitometrik Hücre-sıralama için Antikor Boyama <ol><li> Akış sitometrisi için uygun dilüsyonlarda DMEM ortamı içinde hazırlanmış, 3 ml birincil antikor kokteyli, hücrelerin yeniden süspanse edin. (Antikorlar, önceden 100 ul bir hacim içinde 1 x 10 6 splenositlerin lekeleme ile optimum çalışma dilüsyonları için titre edilmiştir. Kullanımlar beş fare kadar birikintilerini hücreler için kullanılan antikorların her biri için optimum konsantrasyonu ihtiva eden birincil antikor kokteyli 3 ml. Daha fazla fareler bir örneğe toplanmış ise,) seviyesini ayarlamak. </li><li> Boyanması için, karanlıkta 10 dakika için hücreler inkübe4 ° C&#39;de </li><li> 12 160 x g&#39;de ve 4 dakika için santrifüjleme ile DMEM ortam ile 15 ml tüp doldurma ile yıkayın hücrelerini ° C. </li><li> Halinde ya da bağlanmamış biotinlenmiş antikorları 4.1 kullanılmıştır: süpernatantı ve 2 hücreleri tekrar süspansiyon - 3 ml ikincil antikor kokteyli. Karanlıkta 4, 10 dakika ° C&#39;de Leke. </li><li> 160 x g&#39;da 12 dk, 4 ° C ve DMEM ve santrifüjleme ile tüp doldurma yoluyla yıkayın hücrelerini </li><li> Hücre-sıralama için bir tüp içine bir 50 um filtre aracılığıyla DMEM ve ön-filtre, 1 ml hücre yeniden süspanse edin. İsteğe bağlı: akciğer hücre süspansiyonu toplam hücre sayısını elde etmek için hücreleri saymak. </li></ol> 5. Hücre-sıralama <ol><li> Sıralama önce vorteks hücreleri karıştırın. AECII hücre-sıralama için 100 mikron nozul kullanın. Kılıf sıvı basıncı hem de lazer emisyon ve saptama dalga boyları akış sitometrik hücre-sıralama gibi antib kullanılan florokromlar için kullanılan cihaza bağlıdırody boyama işlemi. </li><li> DMEM içeren bir tüpe boyama ve sıralama için kullanılan florokromlar için negatif SSC Yüksek hücreleri üzerinde Kapısı. (SSC-A) pencereler (içinde yolluk stratejisinin ayrıntılarını gördüğünüz herhangi çiftler veya hücre agrega dışlamak için dağılım yüksekliği (FSC-H) vs alanı (FSC-A) ve yan dağılım yüksekliği (SSC-H) vs alanında ileri kullanın 1) Şekil. </li><li> 20 280 xg&#39;de dk ve 4 kriteri hücreler santrifüj toplamak amacıyla ° C. </li><li> Daha sonraki analiz için gerekli olan kültür ortamı ya da tampon olarak hücreler yeniden süspanse edin. </li></ol>

<ol><li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+type+II+cell%3A+defender+of+the+alveolus+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li>
<li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelium%3A+more+than+just+a+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li>
<li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4%2B+T+cell+mediated+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47(2007).</li>
<li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4%28%2B%29+T+cells+and+induce+Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li>
<li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+longer+an+innocent+bystander%3A+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li>
<li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection%3A+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li>
<li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li>
<li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li>
<li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetyl-L-cysteine+%28NAC%29+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li>
<li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing%2C+stress+tolerance%2C+surfactant+lipid+composition%2C+and+immune+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Pulm.+Med%22%5BJournal%5D)">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15(2012).</li>
<li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li>
<li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li>
<li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li>
<li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+synthesis%2C+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li>
<li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+%28IFN-lambda+1%29+in+response+to+influenza+A+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Flow sitometri ile murin AECII ve izolasyonu için bizim protokol fonksiyonel ve moleküler çalışmalar bir dizi için fare akciğer primer hücrelerin erişmenin hızlı bir yol sunar. Açıklanan prosedür böyle bir RNA izolasyonu (şekil 2b bakın) ve transcriptome çalışmaları gibi doğrudan sonraki analizler için sayıca yeterli AECII son derece canlı ve saf popülasyonlarının verir. Fonksiyonel uygulamalar için, AECII şartlandırılmış ortam ya da ko-kültür deneylerinden elde edilen üretim örneğin sağlayan, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> kanüllerin Introcan 22G </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 ml (5000 caseinolytic birimleri) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> 15 ml tüp içinde 4 ml kısım, -20 ° C de saklamak </td></tr><tr><td> Biozym Plak Agaroz </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> H2O içinde% 1 w / v </td></tr><tr><td> Sığır pankreas, 2000 Kunitz birimleri / şişeden deoksiribonükleaz Ben </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> taze 300 ul DMEM 1 flakon içeriği çözülür </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> kullanılan üreticisi (Low G tarafından sağlananlucose, Piruvat, HEPES) </td></tr><tr><td> hücre süzgeçler (100 mikron, 75 mikron) </td><td> BD Falcon </td><td> 352.360, 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> naylon elekten (48 um, 30 um) </td><td> Buckmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 um bir filtreden </td><td> Partec </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> anti-fare CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> klon 93; arıtılmış </td></tr><tr><td> anti-fare F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> klon BM8; APC kuplajlı </td></tr><tr><td> anti-fare CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> klon M1/70; PE kuplajlı </td></tr><tr><td> Anti-CD11c fare </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> klon N418; APC kuplajlı </td></tr><tr><td> anti-fareCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> klon 30-F11; saflaştırılmış </td></tr><tr><td> anti-fare CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1D3; PE kuplajlı </td></tr><tr><td> poliklonal keçi anti-fare IgG </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> poliklonal, PE kuplajlı </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Alternatif florokromlar ile birleştirilen antikorlar mevcut akış sitometresi ve lazer bağlı olarak kullanılabilir. </td></tr></tbody></table>

fonksiyonel ve moleküler Çalışmalar birincil murin tip ii alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Geçen yıllar boyunca, akciğer immün regülasyon çeşitli yönleriyle alveolar tip II epitel hücreleri (AECII) katkısı giderek kabul edilmiştir. AECII iltihaplı hava yollarında sitokin üretimini katılmak ve enfeksiyon ve T-hücre aracılı otoimmünite 1-8 hem de hücreler antijen sunan bile hareket etmek gösterilmiştir. Bu nedenle, bu tür hava yolu hiper reaktivitesi gibi klinik bağlamlarda da özellikle ilginç yabancı ve hem de self-antijenlere doğrudan veya dolaylı AECII hedef enfeksiyonlar. Bununla birlikte, sağlıklı akciğer yanı sıra enflamasyon alveolar tip II epitel hücreleri tarafından sunulan ayrıntılı immünolojik işlevlerini anlaşılmasında düzensizdir. AECII fonksiyonu ile ilgili birçok çalışma 9-12 fare, veya insan alveoler epitel hücre hatları kullanılarak yapılmaktadır. Hücre hatları ile çalışmak kesinlikle böyle büyük sayılar durumu o gibi, faydaları sunarkapsamlı analizler için f hücreler. Bununla birlikte, birincil murin AECII kullanımı ile enfeksiyon ya da otoimmün iltihabı gibi karmaşık işlemler olarak bu hücre tipinin rolü daha iyi anlaşılmasını sağlar inanıyoruz. Primer mürin AECII bunlar analiz ortamında bir rol oynayan ek dış faktörler işlemine tabi tutulmuştur, yani bu gibi solunum durumları olan hayvanlardan doğrudan izole edilebilir. Bir örnek olarak, uygun intranazal AECII öncelikle çoğaltma 13 için bu hücreler hedef grip A virüsü ile enfekte olan fareler izole edilebilir. Önemlisi, sağlıklı farelerin izole AECII ex vivo enfeksiyon yoluyla, enfeksiyon üzerine monte hücresel cevaplarının çalışmalar daha uzun olabilir. Birincil mürin AECII ve izolasyon için protokol, CD11c, CD11b, F4/80 için spesifik antikorlar ile elde edilen hücre süspansiyonu etiketleme ardından fare akciğer enzimatik sindirim dayanmaktadırCD19, CD45 ve CD16/CD32. Granül AECII sonra yüksek etiketsiz ve yan dağılım (SSC yüksek) hücre popülasyonu olarak belirlenmiş ve 3 sıralama floresan aktive hücre ile ayrılır. Fare akciğerlerinden primer epitelyal hücreler izole alternatif yöntemler karşılaştırıldığında, negatif seçimin AECII akım sitometri izolasyonu için bizim protokol nispeten kısa bir süre içinde dokunulmaz, son derece canlı ve saf AECII verir. Buna ek olarak, ve kaydırma ve lenfosit azalması ile izolasyon geleneksel yöntemlerin aksine, antikor-coupled manyetik boncuklar 14, 15 bağlayıcı aracılığı ile, akış sitometrik hücre-hücre boyut ayırma ve ayrıntı ile ayırt etme izin verir. Akım sitometrik hücre sıralama için enstrümantasyon kullanılabilir olduğunu göz önüne alındığında, açıklanan prosedür nispeten düşük maliyetle uygulanabilir. Standart antikor ve akciğer dağılma için enzimler, manyetik olarak herhangi bir reaktif madde yanındaboncuklar gereklidir. İzole hücrelerinin in vitro kültürü ve T-hücre uyarma deneylerinde de transcriptome, proteom veya secretome analizi 3, 4, olarak dahil işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Sağlıklı farelerden izole akciğer hücre süspansiyonları sıralama yapılırken AECII kapısı genellikle yaklaşık 42 hesap verecek ± tüm olayların 10%. Bu yüzde, başlangıçtaki hücre süspansiyonu solunum yolları için işe lenfositler ve diğer bağışıklık hücrelerinin oldukça yüksek oranda içerecek şekilde, örneğin bir viral enfeksiyon gibi solunum koşullar ile farelerin kullanılması durumunda belirgin ölçüde daha düşük olabilir. Günde 3 Aşağıdaki enfeksiyonu IAV enfekte akciğerlerden izole AECII için biz kabaca% 50 oranında AEC...

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Son yıllarda, alveoler tip II epitel hücrelerinin (AECII) akciğerdeki bağışıklık düzenlemesinin çeşitli yönlerine olan katkısı...

Bu prosedürün genel amacı, sonraki fonksiyonel ve moleküler analizler için saf ve canlı primer nöron tip iki alveolar epitelyal hücreleri izole etmektir. İlk olarak, kurban edilen bir farenin akciğeri ve trakeasına DYS solüsyonu ve ardından agaroz instile edilir. Dispa akciğeri sindirdikten sonra akciğer çıkarılır.Doku manuel olarak parçalanır. Elde edilen süspansiyon, azalan gözenek boyutuna sahip bir dizi süzgeçten filtrelenir. Ardından, akış sitometrik negatif seçilim yoluyla boyanmış ve tip iki alveoler epitelyal hücreler izole edilir.Nihayetinde, izole edilen tip iki alveolar epitel hücreleri, solunum yolu enfeksiyonları ve bazı otoimmün hastalıklardaki rollerini incelemek amacıyla fonksiyonel ve moleküler analizler gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, özellikle otoimmün aracılı akciğer hastalıkları ve viral enfeksiyonlar bağlamında, pulmoner immün ilişkiler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Organ ve hücre süspansiyonu hazırlama süreçlerinin öğrenilmesinin zor olması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.Bu protokolün genel başarısı, bu adımlar sırasındaki birkaç önemli detaya bağlıdır. Deneydeki her fare için, dört mililitre DYS bay içeren 15 mililitre'lik bir tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın. Su içindeki %1 düşük erime noktalı agar (low-melt agarose) küçük alikotlarını, sıvılaşana kadar 95 °C'lik bir ısıtma bloğuna yerleştirin. Ardından 45 °C'ye soğutun ve bir sonraki kullanım aşamasına kadar bu sıcaklıkta tutun.Fare akciğer spreyini hazırlamak için, CO2 asfiksisi ile sakrifiye edilmiş bir fareyi etanol ile spreyleyin. Vücudun ventral orta hattı boyunca uzun bir kesi yapın.Ardından ventral uç deriyi çekin ve peritonu dikkatlice kesip çıkarın. Fareyi kanattıktan sonra diyaframı dikkatlice delip çıkarın ve ardından kaburgaları kesin. Kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için, soğuk dolu bir 10 mililitre şırınga ve 26 gauge kanül kullanarak akciğerlere zarar vermemeye özel özen gösterin.PBS ile kalbin sağ ventrikülünü ponksiyon edin ve akciğerleri kanlar temizlenene kadar PBS ile perfüze edin. Trakeayı açığa çıkarmak için tükürük bezlerini kesin ve çıkarın. Ayrıca, trakeayı çevreleyen kasları dikkatlice kesin.Ardından, trakeaya 22 gauge'luk bir indwelling kanül yerleştirin. İğneyi çıkarın ve plastik kateteri akciğere doğru itin. Trakea ve kateterin etrafına küçük bir ip parçası bağlayarak kateteri sabitleyin.İstenirse, trakeaya yerleştirilen kateter aracılığıyla akciğerler PBS veya besiyeri ile yıkanarak bir bronkoalveoler lavaj sıvısı örneği hazırlayın. Lavaj sıvısını ileri analizlere kadar buz üzerinde saklayın. Bu prosedürün en zor kısmı, sindirim ve doku bütünlüğünün bozulmasıdır.Bu protokolün başarısını sağlamak için, doku sindiriminden sonra tüm akciğer loblarının tamamen Dispa ile dolduğundan emin olmanız gerekir. Dokuyu parçalamanız gerekir. İki mililitrelik bir şırıngayı dikkatlice kullanarak, önceden hazırlanan Dispa'dan maksimum iki mililitre hacmi, tüm loblar tamamen genişleyene kadar kateter aracılığıyla akciğere enjekte edin. Şırıngayı, 0,5 mililitre sıvılaştırılmış Aros içeren bir mililitrelik bir şırınga ile değiştirin ve içeriği akciğere damlatın.Aerosollerin geri akışını önlemek için şırıngayı kateter üzerinde bırakın ve akciğeri derhal laboratuvar mendili, kağıt ve buz ile örtün. Aerojeli birkaç dakika bekletin. Mendili, buzu, şırıngayı ve kateteri çıkarın.Ardından trakeayı kesin ve göğüs boşluğundan akciğer, kalp ve timusu çıkarın. Hazırlanan organları bir kap içerisinde PBS ile durulayın. Daha sonra kalp, timus ve trakeanın kalan kısmını akciğerden ayırarak atın.Akciğeri, kalan iki mililitre solüsyonun bulunduğu tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Boyama prosedürü öncesinde fagositik hücrelerin FC reseptörlerinin etkin bir şekilde bloklanmasını sağlamak için inkübasyonu gerçekleştirin. Akciğeri solüsyonlardan, yedi mililitre 1 µg/mL anti CD 1632 antikoru ve 100 µL DNAs içeren DMEM bulunan bir kaba aktarın; iki çift pens kullanarak akciğer dokusunu çekerek tamamen parçalayın.Ardından, istenirse 200 RPM'ye ayarlanmış bir sarsıcının üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücre süspansiyonu, bir sonraki adıma kadar dört derece Celsius'ta saklanabilir. Hücre süspansiyonunu bir dizi naylon süzgeçten pipetle geçirin.İlk olarak, süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 100 mikronluk bir filtreden geçirin. Numuneleri havuzlayacaksanız, aynı gruptaki farelerden alınan hücre süspansiyonlarını aynı filtreden geçirin. Filtre tıkanırsa, yenisiyle değiştirin.Bu işlemi 70 mikronluk bir ağ filtre ile tekrarlayın. Hücre kaybını minimize etmek ve verimi maksimize etmek için her bir ağı, tüpleri ve kapları DMEM ile iyice duruladığınızdan emin olun. Ardından, süspansiyonu burada gösterildiği gibi plastik veya cam bir halka üzerine gerilmiş 48 mikronluk bir ağ filtreden geçirin.Akış sıvısını bir Petri kabında toplayın. Ardından bu işlemi 30 mikronluk bir süzgeçle tekrarlayın. Hacme bağlı olarak, süzüntüyü bir veya daha fazla 50 mililitrelik tüpe aktarın ve dört derece santigrat sıcaklıkta, 160 kat G kuvvetinde 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini iki mililitre eritrosit liziz tamponu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, 13 mililitre DMEM besiyeri ekleyerek lizizi hızla sonlandırın. Solüsyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 160 ×g'de, dört °C'de 12 dakika boyunca santrifüjleyin.Hücreler; CD 11 C, CD 11 BF dört 80 CD 19, CD 1632 ve CD 45'e karşı antikorlar içeren üç mililitrelik bir primer antikor kokteyli ile inkübe edilmiştir. Hücreleri dört derece Celsius'ta veya buz üzerinde, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tüpü DMEM ile doldurarak hücreleri yıkayın ve dört derece Celsius'ta, 160 ×g hızında 12 dakika boyunca santrifüjleyin.Hücreleri bir mililitre DMEM içinde yeniden süspande edin ve hücre ayıklama için bir tüpe 50 mikronluk bir filtreden ön filtreleme yaparak aktarın. Akciğer süspansiyonundaki toplam hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın. EC2 ayıklama işleminden hemen önce, hücre ayıklama için 100 mikro nozul kullanın.Hücre süspansiyonunu vorteksleyerek karıştırın. Akış sitometrik hücre ayıklama için kullanılan cihaza ve antikor boyama prosedüründe kullanılan florokromlara bağlı olarak sıvı basıncı, lazer emisyonu ve deteksiyon dalga boyları farklılık gösterir. İlk olarak, yan saçılım alanıya karşılık floresan grafiği oluşturun ve boyama için kullanılan florokromlar açısından negatif olan tüm yüksek yan saçılım alanlı hücreleri kapılayın.Ardından, yan saçılma alanı ile ileri saçılma alanı, ileri saçılma yüksekliği ile ileri saçılma alanı ve yan saçılma yüksekliği ile yan saçılma alanı grafiklerini oluşturun ve DMEM içeren bir tüpe aktarmak üzere dubletleri veya hücre agregatlarını hariç tutacak şekilde kapılayın. Sağlıklı farelerden izole edilen akciğer hücresi süspansiyonları kullanıldığında, EC2 kapısı genellikle tüm olayların yaklaşık %42 ± 10'unu oluşturacaktır. Sıralanan hücreleri toplamak için 280 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Tip iki alveoler epitelyal hücreleri veya EC2'leri, sonraki analizler için gerektiği şekilde kültür ortamında veya tampon çözeltide tekrar süspande edin. Primer fare tip iki alveoler epitelyal hücreleri, bu videoda anlatıldığı gibi akış sitometrik negatif seleksiyon ile izole edilmiştir; sıralanan hücrelerin analizi burada gösterilmektedir. Belirtildiği üzere.İzole edilen hücrelerin saflığı yaklaşık %92 ± 5'tir. Sıralanmış A EC2 hücreleri sürfaktan protein C için boyanmıştır; sol tarafta faz kontrast görüntüsü, sağ tarafta ise immünofloresan görüntü gösterilmektedir. Hücrelerin yaklaşık %100'ünün sürfaktan protein C pozitif olduğu saptanmış, böylece saf bir popülasyonun başarılı bir şekilde izole edildiği doğrulanmıştır. İn vivo influenza A virüsü enfeksiyonunun etkilerini değerlendirmek için, bir, iki veya üç gün önce intranazal olarak ya fosfat tamponlu salin ya da influenza A virüsü PR eight A 34 uygulanan C 57 BL six farelerinden A EC2 hücreleri izole edilmiştir.Bu grafikler, enfekte akciğere immün hücrelerin göçü nedeniyle sıralama için boyanmış, enfekte edilmemiş ve üç gün boyunca enfekte edilmiş C 57 black six erkek farelerden alınan akciğer hücresi süspansiyonlarını göstermektedir. Floresan negatif, side scatter alanı yüksek hücrelerin oranı, enfekte edilmemiş farelere kıyasla üç gün enfekte edilmiş farelerden hazırlanan hücre süspansiyonunda önemli ölçüde azalmıştır. Influenza A virüs nükleer protein ekspresyonu için sıralanan C2 hücreleri, nükleer proteine özgü bir antikor ile hücre içi boyama yoluyla analiz edilmiştir.Histogram, in vivo enfekte farelerden izole edilen EC2 hücrelerinin, influenza A virüsü nukleoproteinine yönelik hücre içi boyama sonrası spesifik bir floresan sinyali verdiğini göstermektedir. Tablo, nukleer protein boyamasının ortalama floresan yoğunluğunu göstermektedir; influenza A virüsü enfekte farelerden izole edilen EC2 hücrelerinin hücre içi nukleer protein boyamasının ürettiği sinyal yoğunluğu, viral enfeksiyon süresiyle birlikte artmaktadır; bu durum, sağlıklı farelerden izole edilen EC2 hücrelerinin canlılığını kanıtlamak ve influenza A virüsü enfeksiyonuna duyarlılıklarını test etmek amacıyla gerçekleştirilmiştir.Burada gösterildiği gibi, X vivo enfekte edilmiş izole hücrelerde influenza, bir viral nükleer protein ekspresyonu da analiz edilmiştir. EC2'lerin önemli bir oranı, enfeksiyondan altı saat sonra viral nükleer protein eksprese eder. Bu veriler burada özetlenmiştir.Viral nükleer proteinin hücre içi boyaması için EC2 pozitifliği yüzdesi, ex vivo enfeksiyon deneyi için kullanılan viral doza bağlıdır. Bu sonuçlar, izole edilen primer nöronların (EC2), canlı olduğunu ve gözlemlenen viral protein ekspresyonu ile değerlendirildiği üzere viral enfeksiyona ve replikasyona duyarlı olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, tüm doku sindirimi ve parçalama adımlarının dikkatle gerçekleştirilmesinin çok önemli olduğunu unutmamak gerekir.Ayrıca, floresan negatif ve yan bölgelerdeki yüksek hücreler üzerinde titizlikle kapılama (gating) yapmayı hatırlamak çok önemlidir. Bu prosedürle sıralama yapıldıktan sonra, viral enfeksiyonlar ve otoimmün kaynaklı akciğer hastalıkları bağlamında akciğerin tip iki ve tip üç alveolar hücrelerinin rolünü dışlamak için moleküler ve fonksiyonel çalışmalar gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

flow-cytometric-isolation-primary-murine-type-ii-alveolar-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu protokol, yenidoğan, genç veya yetişkin fare akciğerlerinden (enfekte veya enfekte olmayan) canlı alveolar tip II epitel hücrelerini (AECII) izole etmek için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, AECII'nin akciğer iltihabı ve enfeksiyon sırasında rollerini belirlemeye yönelik moleküler ve/veya fonksiyonel çalışmaların ilerlemesini sağlar.

Yenidoğnan, genç ve yetişkin fare akciğerlerinden alveolar tip II epitel hücrelerinin enfeksîyonel deneysel ortamlara uyarlanabilir izolyasyonu

Öğrenin akış sitometri ile negatif seleksiyon kullanarak murin tip II alveol epitel hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem yüksek saflıkta ve canlılıkta hücre sağlayarak solunum hastalıklarının fonksiyonel ve moleküler çalışmalarını kolaylaştırır.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Daha fazla video keşfet