Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu
26 Aralık 2012
Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.
Bu prosedürün genel amacı, sonraki fonksiyonel ve moleküler analizler için saf ve canlı primer nöron tip iki alveolar epitelyal hücreleri izole etmektir. İlk olarak, kurban edilen bir farenin akciğeri ve trakeasına DYS solüsyonu ve ardından agaroz instile edilir. Dispa akciğeri sindirdikten sonra akciğer çıkarılır.
Doku manuel olarak parçalanır. Elde edilen süspansiyon, azalan gözenek boyutuna sahip bir dizi süzgeçten filtrelenir. Ardından, akış sitometrik negatif seçilim yoluyla boyanmış ve tip iki alveoler epitelyal hücreler izole edilir.
Nihayetinde, izole edilen tip iki alveolar epitel hücreleri, solunum yolu enfeksiyonları ve bazı otoimmün hastalıklardaki rollerini incelemek amacıyla fonksiyonel ve moleküler analizler gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, özellikle otoimmün aracılı akciğer hastalıkları ve viral enfeksiyonlar bağlamında, pulmoner immün ilişkiler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Organ ve hücre süspansiyonu hazırlama süreçlerinin öğrenilmesinin zor olması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.
Bu protokolün genel başarısı, bu adımlar sırasındaki birkaç önemli detaya bağlıdır. Deneydeki her fare için, dört mililitre DYS bay içeren 15 mililitre'lik bir tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın. Su içindeki %1 düşük erime noktalı agar (low-melt agarose) küçük alikotlarını, sıvılaşana kadar 95 °C'lik bir ısıtma bloğuna yerleştirin. Ardından 45 °C'ye soğutun ve bir sonraki kullanım aşamasına kadar bu sıcaklıkta tutun.
Fare akciğer spreyini hazırlamak için, CO2 asfiksisi ile sakrifiye edilmiş bir fareyi etanol ile spreyleyin. Vücudun ventral orta hattı boyunca uzun bir kesi yapın.
Ardından ventral uç deriyi çekin ve peritonu dikkatlice kesip çıkarın. Fareyi kanattıktan sonra diyaframı dikkatlice delip çıkarın ve ardından kaburgaları kesin. Kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için, soğuk dolu bir 10 mililitre şırınga ve 26 gauge kanül kullanarak akciğerlere zarar vermemeye özel özen gösterin.
PBS ile kalbin sağ ventrikülünü ponksiyon edin ve akciğerleri kanlar temizlenene kadar PBS ile perfüze edin. Trakeayı açığa çıkarmak için tükürük bezlerini kesin ve çıkarın. Ayrıca, trakeayı çevreleyen kasları dikkatlice kesin.
Ardından, trakeaya 22 gauge'luk bir indwelling kanül yerleştirin. İğneyi çıkarın ve plastik kateteri akciğere doğru itin. Trakea ve kateterin etrafına küçük bir ip parçası bağlayarak kateteri sabitleyin.
İstenirse, trakeaya yerleştirilen kateter aracılığıyla akciğerler PBS veya besiyeri ile yıkanarak bir bronkoalveoler lavaj sıvısı örneği hazırlayın. Lavaj sıvısını ileri analizlere kadar buz üzerinde saklayın. Bu prosedürün en zor kısmı, sindirim ve doku bütünlüğünün bozulmasıdır.
Bu protokolün başarısını sağlamak için, doku sindiriminden sonra tüm akciğer loblarının tamamen Dispa ile dolduğundan emin olmanız gerekir. Dokuyu parçalamanız gerekir. İki mililitrelik bir şırıngayı dikkatlice kullanarak, önceden hazırlanan Dispa'dan maksimum iki mililitre hacmi, tüm loblar tamamen genişleyene kadar kateter aracılığıyla akciğere enjekte edin. Şırıngayı, 0,5 mililitre sıvılaştırılmış Aros içeren bir mililitrelik bir şırınga ile değiştirin ve içeriği akciğere damlatın.
Aerosollerin geri akışını önlemek için şırıngayı kateter üzerinde bırakın ve akciğeri derhal laboratuvar mendili, kağıt ve buz ile örtün. Aerojeli birkaç dakika bekletin. Mendili, buzu, şırıngayı ve kateteri çıkarın.
Ardından trakeayı kesin ve göğüs boşluğundan akciğer, kalp ve timusu çıkarın. Hazırlanan organları bir kap içerisinde PBS ile durulayın. Daha sonra kalp, timus ve trakeanın kalan kısmını akciğerden ayırarak atın.
Akciğeri, kalan iki mililitre solüsyonun bulunduğu tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Boyama prosedürü öncesinde fagositik hücrelerin FC reseptörlerinin etkin bir şekilde bloklanmasını sağlamak için inkübasyonu gerçekleştirin. Akciğeri solüsyonlardan, yedi mililitre 1 µg/mL anti CD 1632 antikoru ve 100 µL DNAs içeren DMEM bulunan bir kaba aktarın; iki çift pens kullanarak akciğer dokusunu çekerek tamamen parçalayın.
Ardından, istenirse 200 RPM'ye ayarlanmış bir sarsıcının üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücre süspansiyonu, bir sonraki adıma kadar dört derece Celsius'ta saklanabilir. Hücre süspansiyonunu bir dizi naylon süzgeçten pipetle geçirin.
İlk olarak, süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 100 mikronluk bir filtreden geçirin. Numuneleri havuzlayacaksanız, aynı gruptaki farelerden alınan hücre süspansiyonlarını aynı filtreden geçirin. Filtre tıkanırsa, yenisiyle değiştirin.
Bu işlemi 70 mikronluk bir ağ filtre ile tekrarlayın. Hücre kaybını minimize etmek ve verimi maksimize etmek için her bir ağı, tüpleri ve kapları DMEM ile iyice duruladığınızdan emin olun. Ardından, süspansiyonu burada gösterildiği gibi plastik veya cam bir halka üzerine gerilmiş 48 mikronluk bir ağ filtreden geçirin.
Akış sıvısını bir Petri kabında toplayın. Ardından bu işlemi 30 mikronluk bir süzgeçle tekrarlayın. Hacme bağlı olarak, süzüntüyü bir veya daha fazla 50 mililitrelik tüpe aktarın ve dört derece santigrat sıcaklıkta, 160 kat G kuvvetinde 15 dakika boyunca santrifüjleyin.
Santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini iki mililitre eritrosit liziz tamponu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, 13 mililitre DMEM besiyeri ekleyerek lizizi hızla sonlandırın. Solüsyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 160 ×g'de, dört °C'de 12 dakika boyunca santrifüjleyin.
Hücreler; CD 11 C, CD 11 BF dört 80 CD 19, CD 1632 ve CD 45'e karşı antikorlar içeren üç mililitrelik bir primer antikor kokteyli ile inkübe edilmiştir. Hücreleri dört derece Celsius'ta veya buz üzerinde, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tüpü DMEM ile doldurarak hücreleri yıkayın ve dört derece Celsius'ta, 160 ×g hızında 12 dakika boyunca santrifüjleyin.
Hücreleri bir mililitre DMEM içinde yeniden süspande edin ve hücre ayıklama için bir tüpe 50 mikronluk bir filtreden ön filtreleme yaparak aktarın. Akciğer süspansiyonundaki toplam hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın. EC2 ayıklama işleminden hemen önce, hücre ayıklama için 100 mikro nozul kullanın.
Hücre süspansiyonunu vorteksleyerek karıştırın. Akış sitometrik hücre ayıklama için kullanılan cihaza ve antikor boyama prosedüründe kullanılan florokromlara bağlı olarak sıvı basıncı, lazer emisyonu ve deteksiyon dalga boyları farklılık gösterir. İlk olarak, yan saçılım alanıya karşılık floresan grafiği oluşturun ve boyama için kullanılan florokromlar açısından negatif olan tüm yüksek yan saçılım alanlı hücreleri kapılayın.
Ardından, yan saçılma alanı ile ileri saçılma alanı, ileri saçılma yüksekliği ile ileri saçılma alanı ve yan saçılma yüksekliği ile yan saçılma alanı grafiklerini oluşturun ve DMEM içeren bir tüpe aktarmak üzere dubletleri veya hücre agregatlarını hariç tutacak şekilde kapılayın. Sağlıklı farelerden izole edilen akciğer hücresi süspansiyonları kullanıldığında, EC2 kapısı genellikle tüm olayların yaklaşık %42 ± 10'unu oluşturacaktır. Sıralanan hücreleri toplamak için 280 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.
Tip iki alveoler epitelyal hücreleri veya EC2'leri, sonraki analizler için gerektiği şekilde kültür ortamında veya tampon çözeltide tekrar süspande edin. Primer fare tip iki alveoler epitelyal hücreleri, bu videoda anlatıldığı gibi akış sitometrik negatif seleksiyon ile izole edilmiştir; sıralanan hücrelerin analizi burada gösterilmektedir. Belirtildiği üzere.
İzole edilen hücrelerin saflığı yaklaşık %92 ± 5'tir. Sıralanmış A EC2 hücreleri sürfaktan protein C için boyanmıştır; sol tarafta faz kontrast görüntüsü, sağ tarafta ise immünofloresan görüntü gösterilmektedir. Hücrelerin yaklaşık %100'ünün sürfaktan protein C pozitif olduğu saptanmış, böylece saf bir popülasyonun başarılı bir şekilde izole edildiği doğrulanmıştır. İn vivo influenza A virüsü enfeksiyonunun etkilerini değerlendirmek için, bir, iki veya üç gün önce intranazal olarak ya fosfat tamponlu salin ya da influenza A virüsü PR eight A 34 uygulanan C 57 BL six farelerinden A EC2 hücreleri izole edilmiştir.
Bu grafikler, enfekte akciğere immün hücrelerin göçü nedeniyle sıralama için boyanmış, enfekte edilmemiş ve üç gün boyunca enfekte edilmiş C 57 black six erkek farelerden alınan akciğer hücresi süspansiyonlarını göstermektedir. Floresan negatif, side scatter alanı yüksek hücrelerin oranı, enfekte edilmemiş farelere kıyasla üç gün enfekte edilmiş farelerden hazırlanan hücre süspansiyonunda önemli ölçüde azalmıştır. Influenza A virüs nükleer protein ekspresyonu için sıralanan C2 hücreleri, nükleer proteine özgü bir antikor ile hücre içi boyama yoluyla analiz edilmiştir.
Histogram, in vivo enfekte farelerden izole edilen EC2 hücrelerinin, influenza A virüsü nukleoproteinine yönelik hücre içi boyama sonrası spesifik bir floresan sinyali verdiğini göstermektedir. Tablo, nukleer protein boyamasının ortalama floresan yoğunluğunu göstermektedir; influenza A virüsü enfekte farelerden izole edilen EC2 hücrelerinin hücre içi nukleer protein boyamasının ürettiği sinyal yoğunluğu, viral enfeksiyon süresiyle birlikte artmaktadır; bu durum, sağlıklı farelerden izole edilen EC2 hücrelerinin canlılığını kanıtlamak ve influenza A virüsü enfeksiyonuna duyarlılıklarını test etmek amacıyla gerçekleştirilmiştir.
Burada gösterildiği gibi, X vivo enfekte edilmiş izole hücrelerde influenza, bir viral nükleer protein ekspresyonu da analiz edilmiştir. EC2'lerin önemli bir oranı, enfeksiyondan altı saat sonra viral nükleer protein eksprese eder. Bu veriler burada özetlenmiştir.
Viral nükleer proteinin hücre içi boyaması için EC2 pozitifliği yüzdesi, ex vivo enfeksiyon deneyi için kullanılan viral doza bağlıdır. Bu sonuçlar, izole edilen primer nöronların (EC2), canlı olduğunu ve gözlemlenen viral protein ekspresyonu ile değerlendirildiği üzere viral enfeksiyona ve replikasyona duyarlı olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, tüm doku sindirimi ve parçalama adımlarının dikkatle gerçekleştirilmesinin çok önemli olduğunu unutmamak gerekir.
Ayrıca, floresan negatif ve yan bölgelerdeki yüksek hücreler üzerinde titizlikle kapılama (gating) yapmayı hatırlamak çok önemlidir. Bu prosedürle sıralama yapıldıktan sonra, viral enfeksiyonlar ve otoimmün kaynaklı akciğer hastalıkları bağlamında akciğerin tip iki ve tip üç alveolar hücrelerinin rolünü dışlamak için moleküler ve fonksiyonel çalışmalar gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, akciğer hücrelerinin hızlı izolasyonu için bir yöntemi açıklar ve akış sitometrik negatif seçilim kullanılarak primer murin tip II alveoler epitel hücreleri (AECII) izole edilir. İzole edilen AECII yüksek canlılık ve saflık sergiler ve bu da onları solunum koşulları ile ilgili çeşitli fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için uygun kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Solunum Fizyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- Tip II alveoler epitel hücreleri akciğer fonksiyonu ve homeostazında önemli bir rol oynar.
- Bunların işlevini anlamak, solunum hastalıklarının çalışılmasını sağlar.
- Bu hücreleri izole etmek için şu anki yöntemler zaman alıcı ve verimsiz olabilir.
- Bu çalışma, izolasyon verimliliğini artırmak için yeni bir yaklaşım sunar.
Çalışmanın Amacı
- Saf ve canlı primer tip II alveoler epitel hücrelerini izole etmek.
- Sonraki fonksiyonel ve moleküler analizlerin kolaylaştırılması.
- Solunum koşullarında AECII hakkında daha iyi anlayış sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kurban edilmiş farelerin akciğerlerine ve trakeasına DYS ekranları ve agarozun yerleştirilmesi.
- Sindirmeden sonra akciğer dokusunun manuel parçalanması.
- Elde edilen süspansiyonun azalan gözenek boyutuna sahip ağlar üzerinden süzülmesi.
- AECII'nin akış sitometrik negatif seçilim ile izolasyonu.
Ana Sonuçlar
- Bu yöntem, izole edilen AECII için yüksek canlılık ve saflık verir.
- İzole edilen hücreler fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için uygundur.
- Prosedür verimli ve tekrarlanabilirdir.
- Otoimmün ve bulaşıcı solunum hastalıklarının çalışılmasının potansiyel uygulamaları.
Sonuçlar
- Bu izolasyon yöntemi, tip II alveoler epitel hücrelerinin çalışılmasını artırır.
- Yüksek kaliteli AECII, solunum koşulları hakkında daha iyi anlayışa yol açabilir.
- Bu yaklaşım gelecekte diğer hücre tipleri için uygulanabilir olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) enables mechanistic de-risking in respiratory disease target validation by providing a disease-relevant system that reflects in vivo complexity. This approach supports predictive confidence in early discovery by yielding highly viable, pure AECII suitable for functional and molecular assays, reducing reliance on immortalized cell lines. The method facilitates translational continuity from discovery through preclinical evaluation of immune-mediated lung pathologies and viral infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a primary cell context that retains native lung microenvironmental influences.
- Operational Value: Provides a reproducible source of untouched AECII for pathway clarification and functional target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing assessment of compound effects on AECII-mediated immune regulation in infection and autoimmunity models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, highly pure AECII suspensions suitable for downstream functional assays including T-cell stimulation and cytokine profiling.
- Quantitative Output: Enables measurement of dependent variables such as surfactant protein C expression and intracellular viral nucleoprotein levels as biomarkers of cellular state and infection susceptibility.
- Scalability: Compatible with flow cytometry platforms allowing multiplexed sample processing and cross-group comparison in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Permits isolation of AECII from mice subjected to respiratory challenges such as influenza infection, enabling study of cell-intrinsic responses under pathophysiological conditions.
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates correlation of functional readouts with molecular signatures (e.g., viral protein expression) relevant to human respiratory disease mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing data on AECII viability and susceptibility to viral replication, informing mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary AECII for hypothesis testing in early biology, enabling assay development for screening campaigns, and generating quantitative functional and molecular readouts that inform translational research decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in lung immunology by providing access to primary AECII from naïve and challenged mice.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions enabling reproducible compound evaluation in functional assays such as cytokine secretion and immune cell interaction assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements including sideward scatter high gating, fluorescence intensity of viral nucleoprotein, and surfactant protein C positivity for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through ex vivo and in vivo infection models that model human respiratory pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow applicable across multiple respiratory disease models, reducing redundant optimization efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity through use of primary cells reflecting native lung biology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via flow cytometric negative selection, minimizing variability introduced by enzymatic depletion or magnetic bead methods.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of lack of efficacy in AECII-mediated pathways, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by generating data on AECII function in infection and autoimmunity, supporting indication selection and biomarker strategy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue handling, enzymatic lung digestion, and flow cytometric cell sorting instrumentation.
- Dependent on access to flow cytometer with appropriate laser and detection capabilities for sideward scatter and fluorescence discrimination.
- Necessitates standardization of antibody cocktails and gating strategies across sites to ensure reproducibility of AECII isolation.
- Involves optimization of tissue disintegration steps to maximize yield while preserving cell viability and surface marker integrity.
- Limited by the accessibility of AECII in diseased lungs, where immune cell infiltration may alter SSChigh gate frequency and require adaptive gating.
