Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Bu prosedürün genel amacı, NK T hücrelerinin ekspansiyonu için CD 1D tabanlı yapay antijen sunan hücreler veya aAPC'ler üretmektir. Bu işlem, öncelikle manyetik boncukları fonksiyonelleştirmek için proteinlerin eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, periferik kandan elde edilen başlangıç NK T hücresi popülasyonu zenginleştirilir.

Ardından, zenginleştirilmiş T hücreleri A A PC ile birlikte kültürlenir. Son adımda, A A PC hücre popülasyonunun fenotipi ve fonksiyonu değerlendirilir. Nihayetinde, genişletilmiş T hücresi alt kümelerinin saflığı akış sitometrik analizi ile belirlenebilir. APC'lerin dendritik hücreleri kullanan mevcut yöntemlere göre temel avantajı, dendritik hücrelerde donör değişkenliğinin yüksek olabilmesidir.

Yapay APC'ler, NK T hücrelerinin genişletilmesi için tekrarlanabilir, hazır ve standartlaştırılmış bir yöntem sunar. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, Johns Hopkins'te Dr. Schneck ve ekibiyle çalıştığım sırada ortaya çıktı. Onlar, klasik CD 8 T-hücre alt kümelerinin genişletilmesi için yapay antijen sunan komplekslerin kullanımı alanına öncülük etmişlerdir.

Prosedürü, doktora sonrası araştırmacı Dr. James East ve laboratuvarımdan bir araştırmacı ortak olan Dr. Wendy'nin oğlu uygulamalı olarak gösterecektir. İşleme, 1 mL dyna bead M four 50 epoxy boncuklarını 5 mL'lik şeffaf borosilikat cam vidalı bir şişeye aktararak başlayın. Ardından, boncukları ayrı bir 1,5 mL'lik mikro santrifüj tüpünde 3 mL steril bore eight tamponu ile durulayın.

100 µg insan CD 1D IG dimerini ve 20 µg istenen ko-stimülatör molekülleri, 1 mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'ye ekleyin. Ardından, boncuk içeren cam şişeyi bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve borat tamponunu aspire edin. Daha sonra protein karışımını cam şişeye ekleyin ve kapağı kapatın.

Viyali ters çevirerek çözeltiyi hemen karıştırın, ardından kapağı parafilmle kapatın ve bir gece boyunca dört derece Celsius'ta rotatörde bekletin. Cam viyali tekrar mıknatıs üzerine yerleştirin ve boncuklara değdirmemeye dikkat ederek protein karışımını dikkatlice uzaklaştırın. Üç mililitre boncuk yıkama tamponu ekleyip boncukları dört derece Celsius'ta rotatörde beş dakika inkübe ederek üç kez yıkayın.

Proteinlerin boncuklara stabil bir şekilde yüklendiğini doğrulamak için, boncukların bir alikotunu antikorlarla boyayın ve akış sitometrisi analizi ile analiz edin. Şimdi, 5 × 10⁷ boncuğu küçük bir 1,5 ml'lik cam viyale aktarın ve boncukları 1 ml steril PBS ile durulayın. Ardından kullanımdan 48 ila 72 saat önce.

Boncuklar antijenle yüklenirken, yıkanmış boncukları bir mililitre steril PBS içindeki antijen ile yükleyin. Önce heparinli donör kanını oda sıcaklığında eşit hacimde PBS ile seyrelterek PBMC'leri toplayın. Ardından, 50 mililitrelik konik tüplere 15 mililitre oda sıcaklığında PHI ekleyin ve seyreltilmiş kan karışımının 25 mililitresini yavaşça PHI'nin üzerine ekleyin.

Ardından, numuneleri fren kapalı konumdayken oda sıcaklığında 700 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Lenfosit ara yüzeyini yeni bir 50 ml'lik konik tüpe dikkatlice aktarmak için bir pastör pipeti kullanın. Daha sonra lenfositleri 50 ml PBS ile yıkayın, süpernatantı uzaklaştırın ve tek bir donöre ait tüpleri tek bir tüpte birleştirin.

PBMC'leri tekrar 20 milliliters PBS ile yıkadıktan sonra hücreleri sayın ve ardından max buffer içerisinde beş times 10 to the seventh cells per milliliter konsantrasyonunda yeniden süspande edin. T-hücre fraksiyonunu izole etmek için, EP human T-cell enrichment kitinden 100 microliters PAN T-cell enrichment solution'ı iki milliliters PBMC ile oda sıcaklığında 10 minutes boyunca inkübe edin. Ardından çözeltiyi, 100 microliters manyetik boncuklar ile oda sıcaklığında 10 minutes daha inkübe edin.

Çözücünün nihai hacmini 2,5 milliliters seviyesine getirin ve ardından tüpü mıknatısa yerleştirin. Beş dakika sonra, CD üç pozitif fraksiyonunu hızla 15 milliliter hacmindeki konik bir tüpe dökün. Şimdi hücreleri beş milliliters soğuk max tamponu ile yıkayın ve canlı hücreleri sayın.

Öncelikle CD 1 61 pozitif hücreleri seçmek için fakt boyama amacıyla bir alikot ayırın. Zenginleştirilmiş T hücrelerini 980 microliters buz gibi soğuk max buffer içinde yeniden süspande edin ve ardından hücreleri 10 micrograms anti CD 1 61 monoklonal antikor ile dört degrees Celsius'ta 10 dakika inkübe edin. Hücreleri yıkadıktan sonra, pelletini 800 microliters max buffer ve 200 microliters anti-US IgG one microbeads ile yeniden oluşturun.

Bu çözeltiyi dört santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. Hücreler mikroboncuklarla inkübe olurken, bir LS kolonunu dengelemek için üç mililitre max tampon ekleyin. Bu hücre fraksiyonunu yıkadıktan sonra, üç mililitre max tampon içindeki hücreleri yavaşça pipetle kolona aktarın.

Şimdi kolonu üç mililitre taze max buffer ile üç kez durulayın. Ardından kolona üç mililitre daha taze max buffer ekleyin ve kolonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Saflaştırılmış CD 1 61 pozitif CD üç pozitif hücreleri dışarı boşaltın ve ardından NKT hücresi zenginleştirilmiş fraksiyonu sayın.

Bu adıma, 10⁶ zenginleştirilmiş CD161 pozitif CD3 pozitif T hücresi ve 10⁶ APC'yi 16 ml komple medyum içeren plaklarda birlikte kültür ederek başlayın. Ko-kültürden her kuyuya 160 µL olacak şekilde, düşük evaporasyon kapaklı, doku kültürü ile işlem görmüş polistiren U tabanlı 96 kuyucuklu bir plağa aktarın. 12. ile 14. günler arasında hücreleri hasat edin ve sayın. Popülasyonları akış sitometrik analiz ile inceleyin, ardından tekrar platla ve ko-kültür yapın.

Az önce gösterildiği üzere, genişletilmiş NKT hücrelerinden ikinci genişletme turu sonrası artanlar dondurulur. A A PC hücrelerinin fonksiyonelliğini test etmek için öncelikle, 96 kuyucuklu U dip plakanın her kuyucuğuna, komple ortamın 200 µL'lik nihai hacminde 5 × 10⁴ NKT hücresi ile 5 × 10⁵ A A PC hücresi birlikte kültüre edilir; 24 ila 48 saat sonra hücre kültürü süpernatanı ELISA analizi için toplanır. İlk şekil, burada gösterildiği gibi, CD 1D IG proteinlerinin manyetik boncukların yüzeyine stabil bir şekilde immobilize edildiğini kanıtlamaktadır.

Bu grafikte gösterildiği üzere, hem CD 1D IG hem de anti CD 28 antikorları manyetik boncukların yüzeyinde eksprese edilmiştir. V alpha 14 pozitif fare NK T hücresi hibridoması DN 30 2D üç, ya ortamda çözünür alpha galera antijeni yüklenmemiş A A PC ile ya da alpha gal yüklü A A PC ile ko-kültüre edilmiştir. Ardından kültür süpernatantları toplanmış ve IL iki üretimi ELISA ile ölçülerek her bir antijen sunan hücre partisinin test edilmesi için basit bir yöntem sağlanmıştır. Bu deneyde, insan CD 1 61 pozitif CD üç pozitif periferik kan T hücreleri, manyetik boncuk ayrıştırması ile zenginleştirilmiştir.

Hücreler daha sonra 14 gün boyunca haftada bir kez alfa galera yüklü A A PC ile stimüle edildi ve V alpha 24 ve V beta 11 ekspresyonu açısından analiz edildi. Önemli bir bulgu olarak, %0,03'lik nispeten düşük bir başlangıç NKT hücresi popülasyonu ile bile hücrelerin yaklaşık %67'lik bir V alpha 24 pozitif V beta 11 pozitif popülasyona genişletilebildiği görüldü. Burada, C one R CD 1D hücreleri, 96 kuyucuklu U tabanlı plakalarda 20 ila 24 saat boyunca, Alpha Gal SER antijeninin varlığında veya yokluğunda belirtilen oranlarda NKT hücreleri ile inkübe edildi.

NKT hücrelerinin B hücreli lenfoma hattında gerçekleştirdiği hücre lizisi daha sonra bir kromyum salınım testi ile değerlendirildi. PC ile genişletilmiş NKT hücreleri, bu lenfoma hücre hattını lizise uğratabilmiştir. Alfa-galaktosilseramid varlığında veya yokluğunda, hem sağlıklı gönüllülerin hem de kanser hastalarının PBMC'lerinden NKT hücreleri genişletilmiş ve alfa-galaktosilseramid yüklenmiştir.

Bir PC, her iki gruptaki NKT hücre popülasyonlarını genişletmeyi başarmıştır. 2 milyon CD161 pozitif CD3 pozitif T hücresinden oluşan bir başlangıç popülasyonu kullanıldığında, iki tur genişletme sonrası 10⁷ hücreden fazla elde edilebilir. Genişletilmiş NKT hücreleri, burada gösterildiği üzere fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir.

Ex vivo genişletilen NKT hücreleri, Alpha GAL stimülasyonuna yanıt vermeye devam eder ve IL 17 A, TNF alpha ve interferon gamma'nın güçlü üreticileridir. Başlangıç T-hücresi zenginleştirme popülasyonunun düşük olması ve ikinci CD 1 61 zenginleştirme adımının gerçekleştirilememesi durumunda, A A PC aracılı genişletmenin beklenen sonuçları vermeyebileceği unutulmamalıdır. Bununla birlikte, dolaşımdaki NKT hücrelerinin yüzdesi %0,1'den yüksekse, invariant NKT hücrelerinin anlamlı bir genişletilmesi hâlâ elde edilebilmelidir.

Toplamda bu veriler, CD 1D tabanlı A A PC'nin, bu prosedürü takiben primer insan NK T hücrelerini etkili bir şekilde genişletmek ve stimüle etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Gelişiminden sonra NK T hücre aktivasyon kinetiğinin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, hepatoloji alanındaki araştırmacıların yağlı karaciğer hastalığında NKT hücrelerinin rolünü araştırmalarına zemin hazırlamaktadır.