Name: Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Öğrenin, yapay antijen sunan hücreler (aAPC) kullanarak insan NKT hücrelerini periferik kandan genişletme yöntemini. CD1d tabanlı aAPC ile yüksek sayıda fonksiyonel NKT hücresi üretilebilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar faydalı tartışmalar için Priyanka Subrahmanyam teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar hiçbir maddi çıkar rakip var. Bu çalışma Amerikan Kanser Derneği, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 ve P30 Tümör İmmünolojisi ve TJ Webb&#39;e İmmünoterapi Programı hibe ile desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. AAPC Üretimi <ol><li> Boncuk proteinler eklemeden önce tüm reaktifler ve tamponlar hazırlamak: 0.1M Borat tampon; 1X D-PBS (hiçbir Ca 2 + ve Mg 2 +); Boncuk Yıkama Tamponu (1X PBS +5% İnsan AB serumu +% 0.02 sodyum azid) , tam bir ortam (RPMI medyumu ile +100 mM sodyum piruvat, 10 mM gerekli olmayan vitamin çözeltisi, 100 mM MEM vitamini çözeltisi,% 1 2-merkaptoetanol, 10 uM siprofloksasin,% 5 insan AB serumu); MACS tampon (1 L serbest PBS Ca 2 + ve Mg + 2, 5 g BSA, 2 mmol EDTA). </li><li> 5 ml&#39;lik şeffaf borosilikat cam şişe içinde dişli steril 3 ml 0.1 M borat tamponu (borik asit ve su, pH 7.0-7.4) ile 1 ml Dynabeads M-450 epoksi boncuklar yıkayın. </li><li> 1 ml PBS w / o Ca 2 + ve Mg + 2: ayrı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 100 mg hCD1d-Ig dimer ve 20 ug birlikte uyaran moleküller (örneğin anti-CD28mAb) ekleyin. </li> &lt;li&gt; Sıra boncuk gelen mıknatıs ve aspirat borat tamponu üzerine cam flakon içeren. Adım 1.2 cam şişeye protein karışımı ekleyin ve kapağını kapatın. Ters flakon hemen karıştırın, bir rotator üzerinde parafilm ile kapak ve yeri kapsayacak ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe </li><li> Dikkatle boncuk kaçınarak Ertesi gün, bir yerde cam mıknatıs üzerine flakon ve protein karışımı çıkarın. 3 ml boncuk yıkama tampon maddesi (PBS,% 5 AB serumu +0.02% sodyum azid) eklenmesi, ve 5 dakika için bir döndürücü üzerine, 4 ° C sıcaklıkta inkübe ederek boncuk yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> Boncuklar bu boncuk yıkama karışım içinde saklanabilir. Fonksiyonel AAPC yapmak için, küçük bir kısım çıkarın ve bir hemasitometre boncuk saymak. Proteinler stably antikorlar (örn. PE-konjuge anti-fare IgG1) ile boyanarak ve flow sitometri analizleri yaparak boncuk üzerine yüklendiğini kontrol edin. </li><li> Antijen ile boncuk yüklemek için, 5 x 10 7 boncuk kaldırmak, ve küçük bir 1.5 ml bir cam şişeye ekleyin, 1 ml steril PBS ile boncuk yıkayın. Resuspend 1 ml steril PBS ile boncuk yıkandı ve antijen ekleyin; örneğin: α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml) ile yükleyin. * Not: biz lipid çözünürlüğün ya misel oluşumu ile herhangi bir sorunları tespit etmemiş olsak bile, lipidler üretici tavsiyelerine göre ele alınmalıdır. Özellikle, KRN7000 bu çalışmalar için DMSO (1mg/ml) içinde yeniden oluşturuldu. KRN7000 glikolipid ve başka antijenler de 0.2 mg / ml PBS içeren% 0.5 içinde çözülebilir Tween-20 (2 saat sonikasyon. 37 ° C&#39;de). ÖNEMLİ-AAPC kullanımdan önce en az 48-72 saat boyunca yüklü olması gerekir. </li></ol> 2. CD161 + CD3 + Hücre İzolasyonu <ol><li> Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) toplayın. Bir buffy coat veya lökoferez paketi lenfositlerin Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj ayırma için, ilk olarak oda sıcaklığında 1X PBS eşit bir hacmi ile heparinize kan seyreltin. </li><li> 15 ml Ficoll (oda sıcaklığına ısıtıldı) 50 ml konik tüpe ekleyin. Yavaşça bindirme25 Ficoll üstüne seyreltilmiş kan karışımı ml. Freni ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2000 rpm&#39;de santrifüj yapılır. </li><li> Dikkatlice Pasteur pipeti ile lenfosit arabirimi (medya ve Ficoll arasındaki beyaz halka) kaldırmak ve yeni bir 50 ml konik tüp aktarabilirsiniz. </li><li> PBS ile 50 ml&#39;ye tüp doldurma ve 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüj yoluyla hücreler yıkanır. Süpernatantı atın ve tek bir tüp, tek bir bireyden tüpler birleştirmek ve 20 ml PBS ile tekrar periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) yıkayın. Daha sonra PBMC saymak ve 5 x 10 7 hücre / MACS tampon içinde ml &#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon (Ca 2 1 L serbest PBS + ve Mg + 2, 5 g BSA, 2 mmol EDTA). </li><li> T hücre fraksiyonunun izole edilmesi için, PBMC (10 8 hücreleri) 2 ml ile başlar ve EasySep insan T hücresi Zenginleştirme Kit Pan T hücre zenginleştirme çözeltisinden 100 ul ilave edin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li&gt; <li> Başka bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında ve çözelti inkübe manyetik parçacıkların 100 ul ekle. 2.5 ila çözücü ml nihai hacim getirin ve 5 dk için mor mıknatıs olarak yerleştirilir. Hızlı bir 15 ml konik tüp içine CD3 + fraksiyonu kapalı dökün. </li><li> 5 ml soğuk tampon MACS eklenmesi ile yıkayın hücrelerini, yaşayabilir hücrelerin sayısını saymak ve FACS boyanması için bir tablet çıkarmak. </li><li> 980 ul buz soğuk MACS tampon CD161 + hücreler, ilk tekrar süspansiyon zenginleştirilmiş T hücreleri seçmek için, 10 mikrogram anti-CD161 mAb ekleyin ve 10 dakika buzdolabında beklettikten sonra kullanın. </li><li> 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta 1500 rpm&#39;de hücreler santrifüj yapılır. MACS tamponu 800 ul Sonra sulandırmak hücre pelletini. Anti-fare IgG1 mikroboncuk 200 ul ekle ve 4. 10 dakika için çözelti inkübe ° C </li><li> İnkübasyon bu adım sırasında, 3 ml MACS tampon eklenerek bir LS kolon dengelenmeye. </li><li> Daha sonra, 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,500 rpm&#39;de santrifüj ile hücreler yıkanır. Resu3 ml MACS tampon içinde hücreler geçirirler. Sonra, LS MACS ayıran sütun içine pipetle hücreler. Yavaş pipetleme kabarcıklar üreten önlemek için emin olun. MACS tampon, 3 ml ilave edilerek sütun yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> 3 ml taze MACS tamponu ekleyin ve mıknatıstan sütun kaldırmak. 15 ml konik tüp içine yerleştirin sütun. Piston takın ve saflaştırılmış CD161 + CD3 + hücreler elde etmek içeriğini dışarı itin. Kont NKT hücre fraksiyonu zenginleştirilmiştir. Sen 2-4 milyon hücre olmalıdır. </li></ol> 3. AAPC aracılı NKT Hücre Genişletme <ol><li> 16 ml tam bir ortam (tam bir ortam + IL-2, 100 U / ml) içinde 10 6 zenginleştirilmiş CD161 + CD3 + T hücreleri ve 10 6 AAPC eklenmesi ile ko-kültür ayarlayın. , 96 iyi doku kültürü tedavi polistiren için düşük buharlaşma kapaklı U-alt plaka 160 sıra nihai / ul hacim ekleyerek Plate bu karışımı. Taze orta 80 ul ekleyerek her 7 inci günü orta değişimi gerçekleştirin. </li><li> Hasathücreler, saymak ve günde 12-14 FACS boyaması gerçekleştirin. </li><li> Genişletilmiş NKT hücreleri, özellikle 16 ml tam bir ortam içinde 10 6 genişletilmiş T-hücreleri ve 10 6 AAPC tekrar süspansiyon, yukarıda adım 3.1 &#39;de tarif edildiği gibi replated edilebilir. Ul / kuyu bir 96 U-alt plaka 160 ekleyerek Levha bu karışım. Taze orta 80 ul ekleyerek her 7 inci günü kokültürü orta yenilemek için devam edin. </li><li> Bu genişleme ikinci turu sonrasında ekstra NKT hücreleri dondurmak için en iyi (1 ml% 5 DMSO / 95% FBS 1 x10 6 / cryovial.) </li></ol> 4. İşlevsel Test: NKT Hücre AAPC aracılı Uyarım <ol><li> 5x10 4 NKT hücreleri kurma / de 96 U-alt plaka 200 ul son hacim (tam orta) olarak 5x10 5 AAPC ile. </li><li> 24-48 saat sonra ELISA Hasat hücre kültür süpernatant. </li></ol>

<ol><li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+T-cell+receptor+%CE%B1%CE%B2-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V%CE%B2+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel population of T-cell receptor αβ-bearing thymocytes which predominantly expresses a single Vβ gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li>
<li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li>
<li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+%CE%B1%CE%B2+T+cells+expressing+invariant+TCR+%CE%B1-chains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Close phenotypic and functional similarities between human and murine αβ T cells expressing invariant TCR α-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li>
<li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V%CE%B124%2B+CD4-CD8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Requirements for CD1d recognition by human invariant Vα24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li>
<li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+expression+of+a+distinctive+V14%2B+T-cell+antigen+receptor+%CE%B1+chain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor α chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li>
<li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+invariant+V%CE%B124-J%CE%B1Q%2FV%CE%B211+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">An invariant Vα24-JαQ/Vβ11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li>
<li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+System%3A+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24%2B+NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li>
<li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li>
<li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li>
<li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li>
<li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li>
<li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li>
<li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li>
<li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I%2Fpeptide+antigen+complexes+on+microspheres+%28large+multivalent+immunogen%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li>
<li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li>
<li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells%3A+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8%2B+T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM%2FTSP+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li>
<li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li>
<li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li>
<li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

AAPC NKT hücre aktivasyonu için temel gereklilikleri incelemek için kullanılır ve adoptif immünoterapi için NK T hücrelerinin ex vivo olarak genişleme için potansiyel klinik bir değere sahip olabilir. Mescher ve ark. Lateks mikro kürecikler 14, 15 yüzeyine biyotinile birlikte uyaran moleküller streptavidin üzerinden B7.1 ve B7.2 ile kombine edilmiştir birinci boncuk esaslı sistemlerinden biri, biyotinile murin MHC sınıf I-peptid-tek zincirli yapıları tanımlanmıştır. Bu yaklaşımın başarılı bir şekilde transgenik farelerden alınan antijen-spesifik T hücreleri stimüle etmek için kullanılmıştır. Bu yaklaşım MHC moleküllerinin homojen bir yükleme sağlamak için bir tek zincir MHC-peptid kompleksi kullanan bu yana Buna ek olarak, her bir hedef peptid antijen böylece yoluyla sunulan tüm, istenilen tek zincir MHC-peptid kompleksi ifade etmek için bir yeni transfeksiyon gerektirir yaklaşım. Önemlisi, Dr Schneck grubunun başka bir hücresel olmayan boncuk tabanlı AAPC geliştirerek, boncuk tabanlı-AAPC öncülük, Manyetik boncuklar üzerine HLA-Ig, sinyal 1, ve anti-CD28, sinyal 2, kuplaj yapılır. HLA-Ig, bir immunglobulin moleküler iskele 16, 17 için erimiş HLA eşsiz multimerik formu kendi grubu tarafından geliştirilmiştir. Daha sonra, onlar etkili CMV ve MART-1 spesifik CTL 18 genişletmeye gösterilmiştir MHC-Ig tabanlı AAPC geliştirdi. Burada, CD1d-Ig bazlı AAPC fonksiyonel NKT hücrelerinin genişletmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Bir çalışmada, CD1d 19 ile NK hücrelerinin fiziksel etkileşimini incelemek için benzer bir sistem kullandı. Özellikle, biz en uygun NKT hücre çoğalması için gerekli bulduğunuz herhangi gereksinimlerine uyarlanabilir yapay bir antijen sunan hücre tasarladık. AAPC genişleme yöntemi, insan NKT hücreleri genişletilmesi ve zenginleştirilmesi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bizim AAPC sistematik potansiyeli kostimülatör moleküllerin bir panel rolünü değerlendirmek ve NKT hücre proliferasyonunda kendi rolünü değerlendirmek için modifiye edilebilirtion ve fonksiyonu. Böylece, AAPC NKT hücreleri indükleyen ve genişletilmesi için kullanışlı sağlam çok yönlü bir teknoloji sunmaktadır. AAPCs bir kuşak en az bir hafta sürer ve boncuk büyük miktarlarda üretim için uygundur. Bununla birlikte, AAPC oluşturulmasında önemli bir adım CD1d-Ig stabil olarak boncuklar üzerinde hareketsiz tutulan yüzey olduğunu doğrulamak için ve partiden partiye tutarlılık sağlamak için kendi işlevselliğini değerlendirilmesidir. Sistemin bir potansiyel kısıtlama boncuk mekanik olarak temizlenmesi dışında, stimülasyon kapatmak için bir mekanizma yok olmasıdır. Spesifik olarak, antijen ile T hücre reseptörü (TCR) iç içe geçme: CD1d/MHC kompleks tipik olarak T hücresi ve her ikisi üzerinde inhibitör ya da baskılayıcı faktörlerin indüksiyonu ile sonuçlanabilir aksesuar / yapışma molekülleri ile uyum içinde immünolojik sinaps oluşturmak antijen hücre sunulması. AAPC sistem, bu faktörler T hücresi tarafından upregulated olabilir, ama boncuk ortak kökenli ligand ifade etmedikleribu reseptörler için. Buna ek olarak, CD4 + NKT hücreleri, farelerde ve insanlarda anti-tümör tepkileri bastırmak için gösterilmiştir, bundan dolayı da bütün NKT hücreleri (α-GalCer yani, küresel stimülasyonu) ya da yanlış bir alt kümesi aktivasyonu seçici aktivasyon istenmeyen immünolojik neden olması mümkündür sonuçları. Sonuç olarak, bir fenotipik olarak ve işlevsel olarak AAPC-genişletilmiş NKT hücre popülasyonu göstermek zorundadır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, anti-CD28 eksprese eden α-GalCer yüklemeli AAPC ile stimülasyon Th2 Th1 üreten NKT hücreleri, ve Th17 tipi sitokinlerin neden olabileceğini bulduk. Mürin çalışmalarda, IL-33, yeni tanımlanmış bir sitokin olan meydan IL-5 ve IL-13 gibi inflamatuar sitokinlerin dolaşımdaki düzeylerinde artış sağladığını bildirdi. IL-33 ile NKT hücrelerinin tedavisi onların sitokin üretimini 20 artırmıştır. IL-33 ST2 için bir spesifik ligand olup, bu çözünür ST2 ca görülmüştürn blok IL-33 sinyal. Böylece, gelecekteki bir uygulama örneği olarak, AAPC ifade ST2 oluşturulur ve NKT hücreleri tarafından Th1 sitokin salgılanmasını uyaran ise bir seçici olarak Th2 sitokinlerin üretimini inhibe edebilir olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Aynı zamanda rapor edilmiştir ki iv enjeksiyon Kb-eksprese eden içine AAPC C57BL / 6 fareleri tümör 21 azalmıştır akciğer metastazı ile sonuçlanmıştır. Önemlisi, bu veriler akciğer o AAPC trafiği göstermek ve efektör T hücre alt aktive edebiliyoruz. Bu nedenle, bir AAPC birden fazla türde oluşturmak ve antijen spesifik T hücre alt grupları arasındaki etkileşimi incelemek olabilir. Özetlemek gerekirse, bu çalışmalar CD1d-Ig tabanlı AAPC normal hücresel APC yerine kullanılabileceğini göstermek ve NKT hücre bazlı evlatlık immünoterapi için güncel klinik yaklaşımlar geliştirmek için potansiyel var.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Yaşam Bilimleri </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep İnsan T Hücre Zenginleştirme Takımı </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 insan mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Mıknatıs </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare IgG1 mikro-küreler </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimer XI Rekombinant Çözünür Dimerik Fare CD1d: IG Fusion Protein </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 epoksi boncuk </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 Orta </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamin Çözüm </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Siprofloksasin </td><td> Alexis Biyokimyasallar </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (klon C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Klon C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-fare IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-fare IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, hiçbir kalsiyum, magnezyum yok </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Albumin Serum </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan AB Serum </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tüp Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Cap ile Wheaton Cam örnek Flakon </td><td> Fisher Scientific </td><td> (03-343-6E) Büyük (03-343-6A) Küçük </td><td></td></tr></tbody></table>

yapay antijen hücre (aapc) aracılı aktivasyon ve doğal Öldürücü t hücreleri genişletilmesi presenting

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Doğal katil T (NKT) hücreleri, doğal katil (NK) hücreleri, T hücrelerinin her ikisi de 1 ve karakteristik belirteçleri göstermek T hücrelerinin özel bir alt kümesidir. Klasik T hücrelerinin aksine, NKT hücrelerinin CD1 molekülleri 2 bağlamında, lipid antijeni tanır. Farelerde Vα14Jα18 ve sınırlı çeşitlilik 3-6 Vβ zincirleri ile ilişkili olan, insanlarda Vα24Jα18, kurallı ve değişmeyen NKT (i NKT) hücreler olarak ifade edilir: NKT hücreleri, değişmeyen bir TCRα zincir düzenlenmesi ifade eder. Geleneksel T-hücreleri ile benzer şekilde, NKT hücrelerinin CD1d 7 ile uygun olan sinyal ardından, CD4-CD8-timus T öncü hücrelerinden gelişir. Tedavi amaçlı NKT hücreleri kullanmak için potansiyel anlamlı α-galactosylceramide (α-GalCer) ve sitokinlerin 8 çeşitli insan NKT hücreleri canlandırmak ve genişletmek için yeteneği ile artmıştır. Önemlisi, bu hücreler kendi özgün phenotyp koruduE, salgılanan sitokinler ve tümör hücre hatlarına karşı gösterilen sitotoksik fonksiyonu. Bu nedenle, ex vivo genişletilmiş NKT hücrelerinin işlevsel kalır ve adoptif immünoterapi için de kullanılabilir. Bununla birlikte, NKT hücre bazlı immünoterapi otolog antijen sunan hücrelerin kullanımı ile sınırlı olup, bu stimülatör hücrelerin miktarı ve kalitesi önemli ölçüde değişebilir. Kanser hastalarının monosit türevli DC birlikte uyaran moleküllerin düşük seviyelerde ifade etmek ve 9,10 az enflamatuvar sitokinler üretmek için rapor edilmiştir. Aslında, daha ziyade otolog APC murin DC KML hastalar 11 NKT hücrelerinin fonksiyon test etmek için kullanılmıştır. NKT hücrelerinin mürin DC tarafından genişletilmiş ve daha sonra adoptif immünoterapi için kullanılamaz Bununla beraber, bu sistem, sadece in vitro test için kullanılabilir. Böylece yapay antijen sunan hücreler (AAPC) dayanan standart bir sistem allo-ya Ksenogenik ce tuzaklar olmadan DC uyarıcı etkileri olabilirlls 12, 13. Burada, CD1d bazlı AAPC üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. CD1d-Ig kompleksleri güvenilir bir yöntem, izole etkinleştirmek ve efektör NKT hücre popülasyonlarının genişletmek sağlar: CD1d-antijen kompleksleri ile T hücre reseptör (TCR) katılımını NKT hücre aktivasyonu, antijen temel bir ihtiyacı olduğu için.

Bu olgu, NKT hücreleri (Şekil 1) yayılması için standart yöntem olarak NKT hücreleri, uyarmak için manyetik boncuklara CD1d-Ig, anti-CD28 mAb kovalent bağlanması ile yapılmış CD1d-Ig bazlı AAPC, üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İlk olarak, bir CD1d-Ig füzyon proteinleri stabil olarak manyetik boncuk yüzey üzerinde hareketsiz olduğundan göstermek zorundadır. Şekil 2A, CD1d-Ig ve anti-CD28 antikor gösterilen manyetik boncuk yüzeyinde eksprese edilen, her ikisi de. AAPC olan uyarıcı kapasitesini incelemek için AAPC gecede, hasat kültür yüzer ve ELISA ile ölçülen IL-2 üretimi ile biz co-kültürlü NKT hücre hibridomlar. Biz CD1d-Ig tabanlı AAPC (Şekil 3, veriler gösterilmemiştir) eşit ya da hücresel muadillerine göre daha yüksek seviyelerde NKT hücre hibridomlar teşvik başardık bulundu. İlginçtir, bizim fare NKT hücre hibridomlar insan CD1d tabanlı AAPC (Fi tarafından uyarılır bulunduAAPC her parti test edilmesi için basit bir yöntem sağlar Şayet 2B). Sonra biz AAPC yayılma potansiyelini göstermek için çalıştı, böylece insan T hücreleri periferik kandan izole edildi. İlk CD161 + CD3 + T hücre fraksiyonu manyetik boncuk ayırma ile zenginleşti. Daha sonra T hücreleri α-GalCer yüklemeli AAPC ile haftada iki kez uyarıldı. Önemlisi, biz bile nispeten düşük bir başlangıç ​​NKT hücre nüfus (% 0.03) ile, biz ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (Şekil 3) hücreleri genişletmek mümkün olduğunu bulmuşlardır. Biz çok sağlıklı gönüllüler ve kanser hastalarının PBMC NKT hücreleri genişlettik ve α-GalCer yüklenen AAPC iki grupta NKT hücreleri nüfus genişletmek mümkün olduğunu bulduk. Özellikle, genleşme oranı yüksek donör bağımlı oldu. Beklendiği gibi Vα24 + hücrelerin daha yüksek bir başlangıç ​​nüfusu, genişleme daha büyük yüzdesi. Buna ek olarak,2 milyon hücre, bir başlangıç ​​popülasyonu kullanıldığında CD161 + CD3 + T-hücreleri, tek genişlemelere (Tablo 1) sonra&gt; 10 7 hücreleri elde edebilir. Genişletilmiş NKT hücrelerinin yaklaşık% 80-90 +, ~% 5 CD8 + ve geri kalan muhtemelen CD4-negatif CD8-çift NKT hücreleri CD4 vardır. Şekil 4A-C &#39;de gösterildiği gibi Bu genişletilmiş NKT hücrelerinin fonksiyonel çalışmalar için de kullanılabilir. Biz ex vivo NKT hücreleri α-GalCer uyarım ile duyarlı kalmasını ve IL-17A, TNF-α, ve IFN-γ potent üreticileri genişletilmiş olduğunu bulduk. Bu, ilk T-hücresi zenginleştirme nüfus düşük olması ve bir ikinci CD161 zenginleştirme adımı gerçekleştirmek mümkün ise, AAPC-aracılı genleşme beklenen sonuçlar (Şekil 4D, Donör 1&#39;e bakınız) elde olmayabilir not edilmelidir. Dolaşımdaki NKT hücrelerinin yüzdesi% 0.1 &#39;den daha yüksek olan, ancak, yine de önemli bir büyüme elde etmek mümkün olmalıdıri NKT hücrelerinin. Toplu olarak, bu veri CD1d bazlı AAPC genişletmek ve etkili bir primer insan NKT hücreleri, uyarmak için kullanılabileceğini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Şekil 1. CD1d şematik: Ig-tabanlı aAPCs CD1d molekülünün hücre dışı bölümleri, kısa amino asit bağlayıcısı ile ayrılan bir immünoglobülin ağır zincir protein sabit bölgesi ile birleştirilir. Bu moleküller, kolayca sadece ilgi lipid fazlalığı ile inkübe ederek, bu gibi α-GalCer gibi lipid antijenleri ile yüklenebilir. AAPC manyetik boncuklara CD1d-Ig, anti-CD Abs birleştirilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Bu sistemde, CD1d-Ig mAb kaynaklı birlikte uyaran sinyalin içerir TCR ve anti-CD28 ile aynı soydan gelen antijen-spesifik sinyal sağlamak için kullanılır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4.25in" fo: src = src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; / &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot;&gt; Şekil 2. . IgG dimer (PE-bağlı anti-fare IgG1 ile boyama yoluyla) ve anti-CD28 antikoru (FITC-konjuge anti-fare IgG2a kullanılarak): aAPCs yüzey proteinleri FACS boyama A) aAPCs CD1d varlığı açısından test edildi . Aç histogramlar izotip kontrol gösterir; dolu histogramlar Belirtilen antikorlar temsil eder. CD1d-Ig ifade AAPC NKT hücreleri IL-2 üretimi teşvik edebilir. B) Vα14 + fare hibridoma hücre NKT, DN32.D3, ya da orta, suda çözünür antijen (α-GalCer), AAPC ya da α-GalCer yüklemeli AAPC boşaltılması ile kültüre edildi. Yüzen kültürler hasat edildi ve standart bir sandviç ELISA, IL-2 üretimini ölçmek için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Şekil 3,. CD1d-Ig kaplama suni antijen sunan hücreler tarafından NKT hücrelerinin genişlemesi. (A) Birincil CD3 + CD161 + çift pozitif hücreler manyetik ayırma kullanarak PBMC&#39;ler izole edilmiştir. Kriteri hücreleri α-GalCer yüklü, 14 gün boyunca CD1d-Ig kaplamalı AAPC ile uyarıldı. Hücreler Vα24 ve Vβ11 aşağıdaki AAPC uyarılması için boyandı. (B) Birincil insan NKT hücre bir B hücreli lenfoma hattı lizis aracılık. Antijeninin varlığı ya da yokluğu, 20-24 saat için 96 oyuklu U tabanlı bir plaka-GalCer (100 ng / ml) olarak belirtilen oranlarda NKT hücreleri ile inkübe C1R-CD1d hücreler. NKT hücre aracılı hücre parçalama standart 51Cr-salınım testi ile değerlendirildi. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Şekil 4. AAPC-genişletilmiş NKT hücrelerinin sitokin profilleri. </strong&gt; iki hafta α GalCer yüklenen AAPC, genişletilmiş NKT hücreleri (1 × 10 5 / kuyu) çözünür α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 mikroboncukları veya α-GalCer yüklü AAPC ile kültüre edildi ile stimülasyon sonra (2 × 10 5 kuyu /) 48 saat boyunca. (A), IL-17A, (B), TNF-α, ve (C), IFN-γ standart sitokin üretimi ELISA ile ölçülmüştür. Gösterilen veriler negatif kontroller (medya ve boş boncuk) düşüldükten sonra net sitokin üretimi vardır. (D) Birincil T hücreleri PBMC manyetik boncuk ayırma kullanılarak izole edilmiştir. Kriteri hücreler-GalCer yüklü-AAPC göstergesi ile iki hafta için uyarıldı. Hücreler Vα24 için belirli Abs kullanılarak boyandı + ve Vβ11 + ve flow sitometri ile analiz.

Burada yapay antijen sunan hücreler (AAPC) kullanarak toplu T hücre popülasyonlarının insan NKT hücreleri aktive ve genişletilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. CD1d bazlı AAPC kullanılması, fonksiyonel NKT hücrelerinin yüksek sayılar için bir standart bir yöntem sağlar.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Doğal katil T (NKT) hücreleri, hem doğal katil (NK) hücrelerinin hem de T hücrelerinin karakteristik belirteçlerini sergileyen benzersiz bir T hücresi alt kümesidir1. ...'nın aksine

Bu prosedürün genel amacı, NK T hücrelerinin genişletilmesi için CD 1D tabanlı yapay antijen sunan hücreler veya aAPCs üretmektir. Bu işlem, öncelikle manyetik boncukları fonksiyonelleştirmek için proteinlerin eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, periferik kandaki başlangıç NK T hücresi popülasyonu zenginleştirilir.Ardından, zenginleştirilmiş T hücreleri A A PC ile birlikte kültüre edilir. Son adımda, A A PC hücre popülasyonunun fenotipi ve fonksiyonu değerlendirilir. Nihayetinde, genişletilen T-hücre alt kümelerinin saflığı akış sitometrik analizi ile belirlenebilir. APC'lerin dendritik hücreleri kullanan mevcut yöntemlere göre temel avantajı, dendritik hücrelerde donör değişkenliğinin yüksek olabilmesidir.aAPC'ler, NK T hücrelerinin genişletilmesi için tekrarlanabilir, hazır ve standartlaştırılmış bir yöntem sunar. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, Johns Hopkins'te Dr. Schneck ve ekibiyle çalıştığım sırada edindim. Kendileri, klasik CD8 T-hücresi alt kümelerinin genişletilmesi için yapay antijen sunan komplekslerin kullanımı alanında öncülük etmişlerdir.Prosedürü, doktora sonrası araştırmacı Dr. James East ve laboratuvarımdan bir araştırmacı ortağı olan Dr. Wendy'nin oğlu uygulamalı olarak gösterecektir. Bir mililitre dyna bead M four 50 epoksi boncuğunu beş mililitrelik şeffaf borosilikat cam vidalı şişeye aktararak başlayın. Ardından boncukları, ayrı bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü içerisinde üç mililitre steril bore eight tamponu ile durulayın.100 µg insan CD 1D IG dimerini ve istenen ko-stimülatör moleküllerin 20 µg'ını, bir mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'ye ekleyin. Ardından, boncuk içeren cam şişeyi bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve borat tamponunu aspire edin. Daha sonra protein karışımını cam şişeye ekleyin ve kapağı kapatın.Flakonu ters çevirerek çözeltiyi hemen karıştırın, ardından kapağı parafilm ile kapatın ve gece boyunca dört derece Celsius'ta bir rotatör üzerinde bekletin. Cam flakonu tekrar mıknatıs üzerine yerleştirin ve protein karışımını boncuklara değdirmemeye dikkat ederek dikkatlice uzaklaştırın. Üç mililitre boncuk yıkama tamponu ekleyip dört derece Celsius'ta rotatör üzerinde beş dakika inkübe ederek boncukları üç kez yıkayın.Proteinlerin boncuklara stabil bir şekilde yüklendiğini doğrulamak için, boncukların bir kısmını antikorlarla boyayın ve akış sitometrisi analizi ile analiz edin. Şimdi, 5 × 10⁷ adet boncuğu 1,5 mL'lik küçük bir cam şişeye aktarın ve boncukları 1 mL steril PBS ile yıkayın. Ardından kullanımdan 48 ila 72 saat önce.Boncuklar antijenle yüklenirken, yıkanmış boncukları bir mililitre steril PBS içindeki antijen ile yükleyin. Heparinli donör kanını önce oda sıcaklığında eşit hacimde PBS ile seyrelterek PBMC'leri toplayın. Ardından, 50 mililitrelik konik tüplere 15 mililitre oda sıcaklığında PHI ekleyin ve seyreltilmiş kan karışımının 25 mililitresini yavaşça PHI'nin üzerine katman olarak ekleyin.Ardından, örnekleri fren kapatılmış şekilde oda sıcaklığında 700 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Lenfosit ara yüzeyini bir pastör pipeti kullanarak dikkatlice yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. Sonrasında, lenfositleri 50 mL PBS ile yıkayın, süpernatanı uzaklaştırın ve aynı donöre ait tüpleri tek bir tüpte birleştirin.PBMC'leri tekrar 20 milliliters PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri sayın ve ardından max buffer içerisinde beş times 10 to the seventh cells per milliliter konsantrasyonda yeniden süspande edin. T-hücresi fraksiyonunu izole etmek için, EP human T-cell enrichment kitinden 100 microliters PAN T-cell enrichment solution'ı, iki milliliters PBMC ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, çözeltiyi 100 microliters manyetik boncuklarla oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin.Çözücünün nihai hacmini 2,5 mililitreye tamamlayın ve ardından tüpü mıknatısa yerleştirin. Beş dakika sonra, CD3 pozitif fraksiyonu hızlıca 15 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Şimdi hücreleri beş mililitre soğuk max tamponu ile yıkayın ve canlı hücreleri sayın.Önce CD 1 61 pozitif hücreleri seçmek için fakt boyama amacıyla bir alikot ayırın. Zenginleştirilmiş T hücrelerini 980 µL buz gibi soğuk max tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri 10 µg anti CD 1 61 monoklonal antikor ile 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri yıkadıktan sonra pelletini 800 µL max tampon çözeltisi ve 200 µL anti-US IgG 1 mikroboncukları ile yeniden konstitüe edin.Bu çözeltiyi 4 °C'de 10 dakika daha inkübe edin. Hücreler mikroboncuklarla inkübe olurken, bir LS kolonunu dengelemek için 3 mL max buffer ekleyin. Bu hücre fraksiyonunu yıkadıktan sonra, 3 mL max buffer içindeki hücreleri yavaşça pipetle kolona aktarın.Şimdi kolonu üç mililitre taze max buffer ile üç kez durulayın. Ardından kolona üç mililitre daha taze max buffer ekleyin ve kolonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Saflaştırılmış CD161 pozitif CD3 pozitif hücreleri tüpe boşaltın ve ardından NKT hücresi zenginleştirilmiş fraksiyonu sayın.Bu adıma, zenginleştirilmiş 10⁶ CD161 pozitif CD3 pozitif T hücresini ve 10⁶ AAPC'yi 16 ml komple besiyeri plakasında birlikte kültüre ederek başlayın. Ko-kültürden kuyuk başına 160 µL'yi, düşük buharlaşma kapaklı, doku kültürü ile işlenmiş polistiren U tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. 12. ila 14. günlerde hücreleri hasat edin ve sayın. Popülasyonları akış sitometrik analiz ile analiz edin, ardından tekrar plakaya aktarıp ko-kültür yapın.Az önce gösterildiği üzere, genişletilmiş NKT hücrelerinden ikinci genişletme turu sonrası artanlar dondurulur. A APC hücrelerinin fonksiyonelliğini test etmek için, öncelikle 96 kuyucuklu U tabanlı bir plaka içerisinde, her kuyucuğa 5x10⁴ NKT hücresini 5x10⁵ A APC ile 200 µL nihai hacimdeki komple ortamda birlikte kültüre edin. 24 ila 48 saat sonra, ELISA ile analiz etmek üzere hücre kültürü süpernatanını toplayın. Bu ilk şekil, burada gösterildiği gibi CD1D IG proteinlerinin manyetik boncukların yüzeyine stabil bir şekilde immobilize edildiğini kanıtlamaktadır.Bu grafikte gösterildiği üzere, hem CD 1D IG hem de anti CD 28 antikorları manyetik boncukların yüzeyinde eksprese edilmiştir. V alpha 14 pozitif fare NK T hücresi hibridoması DN 30 2D three, ya ortamda çözünür alpha galera antijeni yüklenmemiş A A PC ile ya da alpha gal yüklü A A PC ile birlikte kültürlenmiştir. Daha sonra kültür süpernatantları toplanmış ve IL two üretimi Eliza ile ölçülerek antijen sunan hücrelerin her bir lotunu test etmek için basit bir yöntem sağlanmıştır. Bu deneyde, insan CD 1 61 pozitif CD three pozitif periferik kan T hücreleri manyetik boncuk ayrıştırması ile zenginleştirilmiştir.Hücreler daha sonra 14 gün boyunca haftada bir kez alfa galera yüklü A A PC ile stimüle edilmiş ve V alpha 24 ile V beta 11 ekspresyonu açısından analiz edilmiştir. Önemli bir bulgu olarak, %0,03 gibi nispeten düşük bir başlangıç NKT hücresi popülasyonu ile bile hücrelerin yaklaşık %67'lik V alpha 24 pozitif V beta 11 pozitif bir popülasyona kadar genişletilebildiği görülmüştür. Burada, C one R CD 1D hücreleri, Alpha Gal SER antijeninin varlığında veya yokluğunda, 96 kuyucuklu U tabanlı plakalarda 20 ila 24 saat boyunca belirtilen oranlarda NKT hücreleri ile inkübe edilmiştir.B hücreli lenfoma hattının NKT hücreleri aracılı hücre lizisi daha sonra kromyum salınım testi ile değerlendirildi. PC ile genişletilmiş NKT hücreleri bu lenfoma hücre hattını liz etmekte başarılı oldu. Alfa-galaktosilseramid varlığında veya yokluğunda, hem sağlıklı gönüllülerin hem de kanser hastalarının PBMC'lerinden NKT hücreleri genişletilmiş ve alfa-galaktosilseramid ile yüklenmiştir.A PC, her iki gruptan NKT hücresi popülasyonlarını genişletebilmiştir. 2 milyon CD161 pozitif CD3 pozitif T hücresinden oluşan bir başlangıç popülasyonu kullanıldığında, iki tur genişletme sonrası 10⁷'den fazla hücre elde edilebilir. Genişletilmiş NKT hücreleri, burada gösterildiği gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir.Ex vivo genişletilen NKT hücreleri, Alpha GAL stimülasyonuna yanıt vermeye devam eder ve IL 17 A, TNF alpha ve interferon gamma'nın güçlü üreticileri olurlar. Başlangıç T hücresi zenginleştirme popülasyonunun düşük olması ve ikinci CD 1 61 zenginleştirme adımının gerçekleştirilememesi durumunda, A A PC aracılı genişletmenin beklenen sonuçları vermeyebileceği unutulmamalıdır. Bununla birlikte, dolaşımdaki NKT hücrelerinin yüzdesi %0.1'den yüksekse, invariant NKT hücrelerinin anlamlı bir genişletilmesi hala elde edilebilir.Toplu olarak bu veriler, CD 1D tabanlı A A PC'nin, bu prosedürü takiben primer insan NK T hücrelerini etkili bir şekilde genişletmek ve stimüle etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. NK T hücresi aktivasyonunun kinetiği nedir gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, hepatoloji alanındaki araştırmacıların yağlı karaciğer hastalığında NKT hücrelerinin rolünü keşfetmelerine olanak tanımaktadır.

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Doğal Öldürücü T hücreleri (NKT), kanser, autioimmunity düzenlenmesi, temizlenmesi enfeksiyon, ve artheriosclerotic plakların gelişimi bağışıklık yanıtı kritik belirleyicileri. Bu röportajda, Mitch Kronenberg NKT hücreleri glikolipid antijenler tarafından aktive edildiği mekanizmasını anlamak için onun laboratuar çabaları tartışıyor.

CD1d glikolipid Antijen Tanıtım ve NKT hücre Etkinleştirme Terapötik Potansiyeli: Röportaj

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Antijen-spesifik T hücrelerinin indüksiyon ve genişleme için yeni bir DC bağımsız bir yöntem açıklanmıştır. HLA-A2-Ig tabanlı yapay Antijen sunan hücreler (aAPC), HLA-A2 verimli farklı antijen özgüllüğü CTL genişletmek için kısıtlı peptitler ile yüklenir. Bu teknoloji tabanlı CTL evlatlık immünoterapi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

Bu videoda, antijenik peptit yüklü MHC-Ig'ler ve anti-CD28 antikorları ile işlevselleştirilmiş manyetik nanopartikül bazlı yapay antijen sunan hücreler (aAPC'ler) kullanılarak nadir antijene özgü CD8+ T hücrelerinin izole edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. aAPC'lerin, antijenik peptit hedefli T hücresi reseptörlerini spesifik olarak eksprese eden CD8 + T hücreleri ile etkileşimi ve ardından in vitro genişlemeleri, bu CD8 + T hücresi popülasyonunun zenginleşmesi ve genişlemesi ile...

Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Nanopartikül Bazlı Zenginleştirilmesi ve Genişletilmesi

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu...

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC) İn Vitro İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Burada, hızlı ve tekrarlanarak ayarlanabilir boyutu, şekli ve yüzey proteini tanıtımı için T hücre genişletme ex vivo veya içinde vivo hücre (aAPC) sunan biyolojik ilham, biyolojik olarak parçalanabilen articifical antijen üretmek için bir iletişim kuralı mevcut .

Yönbağımlı polimer yapay antijen hücreleri CD8 + T Hücre aktivasyonu için sunma imalatı

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.

In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Burada, periferik kan doğal öldürücü (PBNK), karaciğer dokularından NK hücreleri ve periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) veya kordon kanından (CB) türetilen kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, genişlemiş NK hücrelerinin optimize edilmiş saflığına ek olarak, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanılarak NK ve CAR-NK hücrelerinin genişlemesini göstermektedir.

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Burada, insan iPSC'den türetilmiş kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden doğal öldürücü hücreleri çeşitli malignitelere karşı daha iyi öldürme ile ayırt etmek ve genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, doğal öldürücü (NK) optimize edilmiş iPSC'den türetilmiş CAR-NK hücrelerinin farklılaşmasını ve genişlemesini ve çeşitli tümör hücre hatlarına karşı antitümör aktivitesinin ölçümünü gösterir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kimerik Antijen Reseptörü İfade Eden Doğal Öldürücü Hücrelerdeki Gelişmeler

Öğrenin, yapay antijen sunan hücreler (aAPC) kullanarak insan NKT hücrelerini periferik kandan genişletme yöntemini. CD1d tabanlı aAPC ile yüksek sayıda fonksiyonel NKT hücresi üretilebilir.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Daha fazla video keşfet