In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme Drosophila Larva

Bu prosedürün amacı, yüksek beyin fonksiyonlarını analiz etmektir. Basit bir modelde, DFA larvalarının iştah ve ilişkisel koku öğrenimi incelenmektedir. Bu işlem, öncelikle bir besin şişesinden beslenen 30 adet üçüncü instarda larva toplayarak gerçekleştirilir.

Ardından, larvalar bir Petri kabında, ödül olarak fruktoz ve her iki yanda koku stimülası olarak bir oktal içeren koku kapları kullanılarak beş dakika boyunca eğitilir. Daha sonra, fruktoz ödülü olmayan ve her iki yanda Amal asetat içeren koku kaplarının bulunduğu bir kapta beş dakikalık ikinci bir eğitim aşaması gerçekleştirilir. İki eğitim aşamasının üç tekrarından sonra, larvalar ödül olmaksızın beş dakikalık bir test için karşıt yönlerdeki koku kaplarına maruz bırakılır.

Nihayetinde, bir kokunun Amal asetata karşı göreceli koku tercihinin belirlenmesi, drosophila larvalarının koku uyaranları ile şeker ödülü arasında bir ilişki kurabildiğini göstermekte olup, bu durum genetik olarak esnek bir sistemde çağrışımsal öğrenmeyi incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, nöral fonksiyonun genetik müdahalesi ile birleştirildiğinde, ödülü sinyalize eden nöronların neler olduğu veya tekrarlayan bir hafızanın edinimi veya geri çağrılması için gerekli veya yeterli olan nöronların neler olduğu gibi, öğrenme ve hafıza alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürün gösterilmesi, anti a postop olacaktır.

Laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi önce fruktoz içermeyen %2,5'lik aros Petri kapları hazırlar. Fruktozlu kapları hazırlamak için, çözünmüş arosa fruktoz ekleyin ve ardından plakaya dökün. Daha sonra, deney yapan kişiyi körlemek amacıyla bu kapların her birini farklı bir sembolle etiketleyin.

Fruktoz içeren kap koşullandırma ödülü, sade kap ise ödülsüz kaptır. Koşullandırma uyaranları için, 10 µL saf oktenol içeren toplam üç adet özelleştirilmiş Teflon koku kabı hazırlayın. Kapaklarda, kokunun buharlaşmasını sağlamak için küçük delikler bulunmaktadır.

İkinci olarak, parafin yağında 1'e 50 oranında seyreltilmiş 10 µL amil asetat içeren diğer üç koku kabını hazırlayın. Bu seyreltme, 10 µL saf 1-oktenol kadar çekicidir; beslenen ve başıboş gezmeyen 30 adet sineği toplayarak başlayın. Üçüncüsü, bir besin şişesinden alın.

Bu protokol günün herhangi bir saatinde uygulanabilir. Sirkadiyen ritimlerden bağımsızdır. Lavaları, içinde birkaç damla musluk suyu bulunan bir Petri kabına aktarın ve bir fırça yardımıyla dikkatlice ileri geri hareket ettirin.

Ardından larvaları, içinde birkaç damla musluk suyu bulunan ikinci bir Petri kabına aktarın. Larvaların vücut duvarlarında yem macunu olup olmadığını kontrol edin. Şimdi, larvaların kokuları belirli bir şeker ipucuyla ilişkilendirmelerini eğitmek için Petri kabını deney düzeneğine yerleştirin.

Uyarıcı olarak kullanılan iki tip kaptan birinin sol ve sağ tarafına birer koku kabı yerleştirin. Burada sekizgen kap kullanılmıştır ancak deneyci ödül konusunda kör olduğu için seçim rastgeledir. Ardından, larva grubunu kabın ortasına yerleştirin.

Kapağı kapatın ve hayvanlar uyaranlara maruz kalırken beş dakika bekleyin. Larvaların su damlacığının yüzey gerilimini aşabildiğinden, böylece hapsolmayıp serbestçe keşif yapabildiklerinden emin olun. Yeni bir Petri kabına yeni bir Amal asetat konteyneri yerleştirin.

Beş dakika sonra, larvaları sol ve sağ tarafında zıt uyaranların bulunduğu karşı tipteki kaba aktarmak için nemli bir fırça kullanın. Buradaki koku amil asetatdır. Larvalar aktarıldıktan sonra kapağı kapatın ve hayvanların beş dakika boyunca keşfetmelerine izin verin.

Bu süre dolduğunda, eğitimin ilk turu tamamlanmış olur. İlk turla aynı şekilde iki eğitim turu daha gerçekleştirin. Hayvanları nemli bir fırça yardımıyla taşıyın ve her bir stimülasyon ve ödül kombinasyonuna toplamda üç kez maruz bırakın.

Deneysel test alanı için, kaplamasız agros Petri kabının karşıt bölgelerine her bir stimülustan birer adet olacak şekilde taze koku kaplarını yerleştirin. Eğitilmiş hayvanları kabın ortasına aktarın. Kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin.

Beş dakika sonra, kabın altında sol, sağ ve orta olmak üzere üç bölgeyi net bir şekilde belirleyen bir şablon kullanarak her bölgedeki larva sayısını sayın. Orta bölge, tercihsizlik puanı olarak kabul edilir ve analizi daha kısıtlayıcı hale getirerek yanlılığa karşı daha az duyarlı kılar. Son olarak, deneyi tamamlamak için besleme aşamasındaki 30 yeni üçüncü evre larva seçin ve eğitim ile test işlemlerini ödül ve uyaranların ters kombinasyonu ile tekrarlayın.

Aynı koku kaplarını kullanmaya devam edin. Transgenik hayvanların ödül uyaranları için normal koku işleme kapasitesine sahip olup olmadığını belirlemek amacıyla birkaç kontrol testi gereklidir. Naif koku tercihi testi, eğitim ve test aşamalarında yapıldığı gibi 30 larvanın toplanması ve yıkanmasıyla başlar.

Ardından, larvaları sadece bir tarafında tek bir uyaran şişesi bulunan agaroz Petri kabına yerleştirin. Kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin. Sonrasında, şablonu kullanarak, uyaranın konumuna göre kabın yakın tarafındaki, ortasındaki ve uzak tarafındaki larva sayılarını sayın.

Naive şeker tercihini test etmek için deneyde kullanılan her bir stimülüs için bu testi gerçekleştirin. Bir petri kabındaki agarın yarısını kesip boşalan alanı diğer tip erimiş agarla doldurarak yarı yarıya petri kapları hazırlayın. Her iki yarının hacimce eşit olmasına ve belirgin bir kenar oluşmamasına dikkat edin.

Bu işlem, oda sıcaklığında hazırlanan yarım kap ile pratik yapmayı gerektirebilir; 30 adet temizlenmiş, beslenmemiş saf birey yerleştirilir. Üçüncü olarak, yıldız larvaları kabın merkezine yerleştirilir. Kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin.

Ardından, şablonu kullanarak her iki yan ile ortadaki larva sayılarını sayın. Tarif edilen bu prosedür, trenchgenic larvaların eğitilmesi ve test edilmesi için kullanılmıştır. Örnek uyaranlar kullanılarak, veriler Petri kaplarının farklı bölgelerindeki larva sayıları olarak kaydedilmiştir.

Bu veri tercihi sürecinden beş dakika sonra indeksler hesaplandı ve karşılıklı olarak eğitilmiş gruplardan performans indeksleri türetildi. Test edilen larvalar transgenik olduğu için, koku dolu bir kap ile hava arasında bir seçimin yanı sıra, saf kokular ile şekerli kokular arasında da bir seçim sunuldu. Hesaplanan indekslerin kutu grafiği ile incelenmesi, hayvanların fruktoz kokularını bir iştah pekiştiricisi olarak kullanarak bir kokuyu ML asetatla ayırt etmeyi öğrenebildiklerini ortaya koydu.

Hayvanlar her iki uyaranı da çekici olarak tanımış ve fruktoz kokusuna karşı aero kokusuna kıyasla doğal bir tercih göstermiştir. Bu deneysel paradigma, çok çeşitli koku ve görsel uyaranların yanı sıra çok çeşitli ödüllendirici ve cezalandırıcı uyaranlarla başarıyla kullanılmıştır. Bu paradigmanın drosophila'da mevcut olan birçok güçlü genetik manipülasyonla birleştirilmesi, nöral ağların çözümlenmesinde özellikle yararlıdır; örneğin, gal4 ekspresyon paternleri ile tanımlanan belirli nöron setleri genetik olarak manipüle edilerek, bu nöronların iştah öğrenimindeki fonksiyonel rolleri değerlendirilebilir.

Bu prosedür, nöronal fonksiyonun genetik interferansı ile birlikte, öğrenme ve hafızada yer alan larva beynindeki nöral ağların analiz edilmesi için kullanılabilir. Larva beyninin basitliği sayesinde, bu işlem tek hücre düzeyine kadar gerçekleştirilebilir.