Karbon Siyah Mürekkep İntravasküler Perfüzyon Serebral Gemiler Güvenilir Görselleştirme verir

Bu prosedürün genel amacı, farelerin serebral vasküler anatomisini tekrarlanabilir bir şekilde incelemektir. İlk olarak, daha sonra karbon siyahı mürekkep boyaması ile karşılaştırmak amacıyla serebral damarlar renkli lateks ile boyanır. Ardından, karbon siyahı mürekkepleri karıştırılır ve hayvanlar, sol ventrikül üzerinden PBS ve karbon siyahı mürekkep karışımı ile perfüze edilir.

Son adımda, beyin toplanır ve boyanmış serebral damarların karşılaştırılması ve analizi için fotoğrafları çekilir. Son olarak, orta ve anterior serebral arterler arasındaki anastomotik noktaları analiz etmek için Image J yazılımı kullanılır. Bu tekniğin uygulamaları, vasküler yoğunluk ve anjiyogenezin analizinde kullanılabileceği için özellikle inme olmak üzere serebrovasküler hastalıkların tedavisine yöneliktir.

Bu yöntem beyindeki vasküler sistem hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, kalp, karaciğer veya böbrekteki mikrovasküllerin görselleştirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Lateksi bir EP tüpünde karbon siyahı mürekkebi ile karıştırdıktan sonra, karışımı bir su banyosunda 37 °C'de ısıtın. Isınmış lateksi iki mL'lik bir şırıngaya çekmek için 23 ila 25 gauge bir iğne kullanın.

Ardından, 12,5 miligram papain hidroklorür tozunu bir mililitre steril normal salinde çözün ve vorteksledikten sonra elde edilen çözeltiyi bir insülin şırıngasına çekin. Daha sonra, başka bir steril insülin şırıngasının iğnesini kırın ve ayrılan iğneyi 20 santimetre uzunluğunda bir PE 10 tüpün ucuna yerleştirin. Son olarak, PE 10 tüpü, papain hidroklorür çözeltisi içeren insülin şırıngasının iğnesine takın.

Şimdi iki insülin şırıngasını daha bir mililitre salinle doldurun ve ardından tüm şırıngaları sterilize edilmiş diseksiyon aletleri ile birlikte anestezi öncesinde ameliyat masasına taşıyın. Fareyi tartın, ardından sürekli olarak anestezi altında tutulan fareyi sırt üstü pozisyonlandırın. Uzuvları sabitleyin ve sol femoral ven üzerindeki deriyi kesin.

Şimdi femoral veni bulun ve PE 10 tüpüne bağlı iğnenin ucunu yerleştirin. Ardından, Papine hidroklorür çözeltisini dakikada yaklaşık 100 µL hızla ve vücut ağırlığı başına 50 mg dozunda yavaşça enjekte edin. Enjeksiyonun ardından karın boşluğunu kesin ve ardından diyaframı delin.

Ardından, kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları kesin ve artery forceps ile descending thoracic aorta'yı klempleyin. Daha sonra, venöz kanın boşaltılması için sağ atrium üzerinden keskin bir kesi yapın. Ardından sol ventriküle iki mililitre salin enjekte edin.

Profil solüsyonlarında veya kombine mürekkep karışımında hava bulunması, beynin damar bölgelerinde boyanmamış alanların oluşmasına neden olabilir. Başarıyı garanti altına almak için lütfen tüm şırıngaların tamamen hava kabarcıklarından arındırılmış olduğunu çok dikkatli bir şekilde kontrol edin. Şimdi, renkli lateksin manuel enjeksiyonu için önceden doldurulmuş şırıngaların içeriğini sırasıyla, 18 ila 20 saniyelik bir süre boyunca yavaşça uygulayın ve hayvanı beş dakika bekletin.

Ardından hayvanın başı kesildikten sonra, kortekse veya damar yapısına zarar vermemeye dikkat ederek kafatası kemiğini ve meningesleri çıkarın ve ardından tüm beyni dikkatlice hasat edin. Beyni 60 milimetrelik, içinde 6 ila 8 mililitre %4 PFA bulunan bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve daha sonra operasyon mikroskobuna bağlı bir kamera kullanarak kabın altına bir cetvel yerleştirin. Mikroskop objektifi ile Petri kabı arasında 90 derecelik bir açıyla, beynin dorsal ve ventral yüzeylerinin 25 x büyütmede fotoğraflarını çekin.

Orijinal mesafeyi nicelleştirmek için, iki ayrı 1,5 mililitrelik EP tüpünde iki adet 100 mikrolitre herts stemple farba mürekkebi veya CB bir alikotunu, iki adet 900 mikrolitre pelican scribal schwartz mürekkebi veya CB iki alikotu ile karıştırarak karbon siyahı mürekkep boyama prosedürüne başlayın. Mürekkep karışımlarını iki ayrı bir mililitrelik insülin şırıngasına toplayın. Ardından şırıngaların kapaklarını kapatın ve her biri bir mililitre salin içeren diğer iki insülin şırıngasıyla birlikte 37 derece Celsius sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin.

Fareye az önce gösterildiği şekilde işlem uyguladıktan sonra, her mililitre için 18 ila 20 saniye sürecek şekilde hafif bir basınçla her iki karbon siyahı mürekkep solüsyonunu sol ventriküle enjekte edin. Beyni çıkarıp az önce gösterildiği gibi fotoğraflarını çektikten sonra, beyni gece boyunca %4 PFA içinde bekletin ve ardından yüzen beyin tamamen batana kadar kademeli olarak artan sükroz konsantrasyonlarında inkübe edin. Bu adıma geçici fokal serebral iskemi oluşturarak başlayın.

Orta serebral arterin intralüminal oklüzyonuna yönelik standart bir protokole göre, reperfüzyon döneminin sonunda, damar sistemini az önce gösterildiği gibi CB bir ve CB iki mürekkepleriyle boyayın ve ardından tüm beyni 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca %2'lik TTC çözeltisi ile boyayın. Enfarkt hacminin belirlenmesi için enfarkt alanı beyaz kalacak, iskemik olmayan alan ise kırmızıya dönecektir. Serebral damarların makroskobik anatomisini analiz etmek için, beyindeki boyanmış yüzeyin bir görüntüsünü açarak başlayın ve az önce gösterildiği gibi görüntüler toplayın.

Image J yazılımı ile, renkli lateks ile perfüze edilmiş beyinlerde ventral yüzeyde yer alan damar boyanmaları değişken derecelerde görülebilir. CB one ve CB two perfüzyonu ise hem ventral hem de dorsal yüzeylerdeki tüm damarları boyayacaktır. Ölçeği milimetre cinsinden ayarlayın, anterior serebral arter (aCA) ile orta serebral arter (MCA) arasındaki anastomotik noktaları işaretleyerek tüm bu anastomotik noktaları birbirine bağlayan hayali bir çizgi oluşturun.

Şimdi, beyin frontal polüne doğru önce dört, ardından altı milimetre mesafedeyken, anastomotik hat ile orta hat arasındaki mesafeyi ölçün. Hayvan başına üç ila dört görüntü analiz ettikten sonra ortalama değeri hesaplayın. Serebrovasküler anatomi içindeki varyasyonu belirlemek için farklı hayvan grupları arasındaki değerleri karşılaştırın.

C 57 black six J hayvanlarında, a CA ile MCA arasındaki anastomotik hat, frontal polle karşılaştırıldığında altı milimetreye göre dört milimetrede orta hatta daha yakın olarak izlenebilirken, APO lipoprotein e knockout farelerde bu konuda anlamlı bir fark görülmemektedir. Buna karşılık, vasküler anatominin analizi için SV 1 29 farelerdeki anastomotik hat, frontal polle karşılaştırıldığında hem dört milimetrede hem de altı milimetrede orta hattan daha uzak ve daha paralel yer alır. İskemik koşullar altında, metabolik olarak aktif dokuyu ve nekrotik dokuyu sırasıyla temsil eden kırmızı ve beyaz renkli doku sınırı olarak enfarktüs sınırını belirleyin; enfarktüs sınırının orta hattan olan uzaklığını, beynin frontal polünden dört milimetre ve altı milimetre mesafedeki noktalarda ölçün.

Burada açıklanan protokol, kemirgen serebral vaskülaritesinin geleneksel lateks tabanlı görselleştirmesindeki teknik sınırlamaları ortadan kaldırmaktadır. Renkli lateks perfüzyonunu takiben ilk görüntünün gösterdiği üzere, yalnızca ventral yüzeydeki büyük damarlar boyanmış, tüm dorsal yüzey ise boyanmadan kalmıştır. Buna karşılık, CB one artı CB two perfüzyonu, hem küçük hem de büyük damarların eşit şekilde yeterince dolmasını sağlar.

Boyama, kalitede herhangi bir değişiklik olmaksızın yedi gün boyunca stabildir. Image J programı kullanılarak, bölgesel vasküler anatomideki farklılıkları değerlendirmek amacıyla mürekkeple perfüze edilen tüm farklı fare gruplarında, A CA ile MCA arasındaki anastomotik noktaların orta hattan olan uzaklığı analiz edilebilir. POE'nin nakavt edilmesi C 57 black six J farelerinde serebral damarların anatomik yapısını etkilemese de, C 57 black six J ve SV 1 29 suşları arasında anlamlı bir fark gözlemlenebilir.

Deneysel kemirgen inme modellerinde, infarkt hacminin görselleştirilmesi için TTC boyaması yaygın olarak kullanılır. CB one artı CCB two boyaması da iskemik koşullar altında damarsal yapısal değişiklikleri gözlemlemek için uygulanabilir ve TTC boyaması ile kombine edildiğinde yüksek kararlılık gösterir. Farklı serebral iskemi süreleri ve reperfüzyon zaman noktalarıyla oluşturulan iskemik beyinlerde, serebral damarların ve infarkt hacminin eş zamanlı görselleştirilmesine dikkat ediniz.

A C ve MCA arasındaki anastomotik noktaların, 45 veya 90 dakikalık iskemiyi takip eden bir günlük veya beş günlük reperfüzyon süreleriyle eşleştirilerek analiz edilmesi, beklendiği üzere orta hat ile anastomotik noktalar arasındaki ortalama farkın gruplar arasında anlamlı bir farklılık göstermediğini ortaya koymuştur. Ayrıca, ortalama mesafe iskemik olmayan hayvanlarla aynı aralıkta bulunmuştur. Bununla birlikte, orta hattan enfarkt sınırına olan mesafe, iskemik reperfüzyon hasarının yüksek derecelerinde artan enfarkt hacmini yansıtacak şekilde gruplar arasında anlamlı farklılıklar göstermektedir.

Bu teknik, fare beynindeki vasküler bölgeleri keşfetmek isteyen deneysel inme alanındaki araştırmacılar için yol açma potansiyeline sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, beynin lateks veya karbon siyahı mürekkepleriyle perfüze edilerek farelerdeki serebrovasküler anatominin nasıl inceleneceği ve sonuçta boyanan beyin dokusunun Image J yazılımı yardımıyla nasıl analiz edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.