Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

Bu prosedürün genel amacı, bombus arısı beynindeki kayıtlar aracılığıyla karmaşık kokular içindeki biyolojik olarak etkili koku maddelerini belirlemektir. Bu, öncelikle davranışsal olarak etkili kokuların toplanması ve ardından deney için gaz kromatografı ile çok kanallı kayıt sistemlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Üçüncü adım ise antenal lobun nöral kayıtları için bombus arısı beyninin hazırlanması ve diseke edilmesidir.

Deney, elektrotların bir anten lobuna yerleştirilmesi ve karmaşık kokular ile bunların tekil bileşenlerine yanıt olarak oluşan nöral aktivitenin analizi yoluyla, püskürtülen uçucu maddelere verilen yanıtların ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Gaz kromatografisi ile elde edilen biyolojik olarak aktif kokular tanımlanabilir. Dolayısıyla, bu tekniğin G-C-E-A-G gibi diğer tekniklere kıyasla temel avantajı, anten yük nöronlarının hassasiyeti ve beyindeki nöronların belirli çiçeksi uçucu maddelere nasıl yanıt verdiğini karakterize edebilme yeteneğidir.

Elektrofizyolojik hazırlık kayıt tekniği ve headspace uçucu maddelerinin toplanması için gerekli adımlar nedeniyle, kombine elektrofizyolojik ve kimyasal analitik basamakların öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu teknik, bombus arılarının koku işleme süreçlerine dair bilgiler sağlayabilse de, sivrisinekler veya öpücük böcekleri gibi hastalık etmenleri ya da yaprak bitleri veya güveler gibi ürün zararlıları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedür için, ikinci bir mikromanipülatör üzerinde tungsten telden yapılmış bir referans elektrot hazırlayın.

Mikromanipülatör; ön yükselticiye bağlı olan sarmal tel, tede veya silikon çok kanallı elektrot gibi çok kanallı bir elektroda ve korumalı bir BNC tablası üzerinde çıkışı bulunan bir gaz kromatografına sahiptir. GC detektörünün çıkışı, hem nöral hem de GC sinyallerinin senkronize olmasını sağlayacak şekilde amplifikatör ve veri toplama sistemi ile arayüzlenmiştir. Bu örnekte, GC taşıyıcı gazı helyumdur ve DB five GC kolonu kullanılmıştır.

GC, sıcaklığı 200 °C'ye ayarlanmış split enjeksiyon girişine ve 230 °C'ye ayarlanmış alev iyonizasyon dedektör sıcaklığına sahiptir. Numuneler GC'de ısıtıldıktan sonra, kolondan çıkan akış, cam bir Y konnektörü kullanılarak alev iyonizasyon dedektörü ve B anteni arasında bir bir oranında bölünür. Bu örnekte GC, Kalifornya'ya özgü bir alpin kır çiçeği olan Mimus lewisii göz çiçeklerinden dinamik absorbsiyon ile toplanan uçucuları iletmek için kullanılmıştır.

Alternatif olarak, gc kullanmak yerine, tekil uçucu bileşikler veya bileşik karışımları hava darbeleri ile iletilebilir. Bu işlem, bileşiklerin üzerine çöktürüldüğü bir filtre kağıdı parçası içeren ayrı bir cam şırınga aracılığıyla gerçekleştirilir. Hava darbeleri, bilgisayar kontrollü solenoid aktivasyonlu bir valf kullanılarak sabit bir hava akışından yönlendirilir.

Hazırlıklara, bir mililitrelik pipet ucunun ucundan yaklaşık bir santimetre keserek başlayın. Bir bombus arısını pipet ucunun tabanına yerleştirin ve sadece başı dışarıda kalana kadar nazikçe ucun karşı tarafına doğru itin. Erişmiş diş hekimi mumu kullanarak, dışarıda kalan başın etrafında bir kalıp oluşturun.

Başı tamamen hareketsiz hale getirmek için balmumu bileşik gözlere yapışmalıdır, ancak gerekirse antenlerle temas etmemelidir. Antenleri sabitlemek için küçük iğneler kullanın. Ardından, mikro bistüri gibi keskin bir bıçak kullanarak baş kapsülüne kare pencere şeklinde bir insizyon yapın.

Kesme işlemine doğrudan antenin arkasından ve bileşik gözlerden birinin yanından başlayın. Gözler arasında düz bir hat boyunca kesin. Ardından, baş kapsülü toraksa doğru kıvrılana kadar dorsal yönde kesin.

Kesme işlemine baş kapsülünün karşı ucuna kadar devam edin. Son olarak, kareyi tamamlamak için başlangıç noktasına geri kesin. Kutikülü çıkarmak için pens kullanın.

Antenle komşu olan kütikül kaldırılmalıdır, aksi takdirde beyin açığa çıkar çıkmaz elektrodu engelleyecektir. Dokuyu derhal böcek salini ile süperfüze edin. Anten loblarının iyice açığa çıktığından emin olun.

Ardından, anten loblarının hemen üzerindeki perinöral kılıfı çıkarmak için çok ince bir pens setini dikkatlice kullanın. Pensle arının beynini delmemeye çok dikkat edin. Arı preparatı artık elektrofizyolojik kayıt için hazırdır.

Hazırlanan arıyı manyetik bir tabana sabitlenmiş bir klempe tutturarak başlayın. Akış kontrolcülü bir rezervuardan verilen insekt salini ile süperfüzyonu sürdürün. Şimdi referans elektrodu karşıt taraf beyin dokusuna yerleştirin.

Ardından, çok kanallı elektrodu arının anten loblarına yerleştirin. Elektrotlar yerleştirildiğinde, kayıtların stabilize olması için 30 ila 60 dakika bekleyin.

Bu süre zarfında, eşikleme işlemini de uygulayarak nöronlardan gelen hücre dışı spike'ları hazırlayın. Kayıt kanallarındaki gürültü nedeniyle bazı kanallar için manuel eşikleme gerekebilir. Ardından, GC çalışmasının sıcaklık rampasının doğru olduğunu doğrulayın.

Bu örnekte, sıcaklık dört dakika boyunca 50 °C ile başlar ve ardından dakika başına 10 °C artarak 220 °C nihai sıcaklığa ulaşır veya bu sıcaklıkta altı dakika tutulur. Kayıt kanallarındaki ünitelerin dalga formu şekilleri tutarlı hale geldiğinde, nöral kayıtlar stabil kabul edilir. Stabilizasyon sağlandığında, şırıngayı çiçek baş boşluğu kokusuyla doldurun ve kokuyu gc'nin baş enjeksiyon portuna enjekte edin.

Ardından GC çalışması biter bitmez elektrotlarla kayıt almaya başlayın. Hazırlığın beş ila 15 dakika dinlenmesine izin verin. Sonrasında GC'ye başka bir örnek enjekte edin veya tekil uçucu bileşikler ya da bileşik karışımları kullanarak hazırlığı stimüle edin.

Herhangi bir noktada spontan aktivite aniden durursa veya değişirse, salin damlatma sistemini kontrol edin ve preparatın 15 dakika dinlenmesini sağlayın. Ardından, aktivite önceki seviyesine dönmezse preparatı imha edin. Deneyden sonra, problar doku içerisindeyken beyni sabitleyin, ardından beyni çıkarın, fiksatifi temizleyin ve beyniy dehidre edin.

Kayıt kanallarının konumları daha sonra konfokal mikroskopi ile mimus Luci çiçek kokusundan belirlenebilir. Uçucu maddelerin toplam sayısı taranmaktadır. GC'de genellikle 60 ile 70 arasında bileşik bulunur.

Mimus Luci'nin kokusu, ağırlıklı olarak beta myosin ve alpha pinine dahil olmak üzere monoterpenoidlerden oluşmaktadır. Kokunun geri kalanı altı karbonlu uçuculardan oluşur. Birkaç preparat, üç µL Mimus Lewis göz ekstresi ile stimüle edilmiştir.

Çok kanallı elektrot tarafından kaydedilen sekiz nöral üniteden birine ait olan bu kayıt, bir nöronun spesifik uçucu maddelere karşı ne kadar seçici bir tepki verdiğini göstermektedir. Bu örnekte, gösterilen bileşik dine'dir. Burada sekiz nöral ünitenin yanıtları yer almaktadır.

Grubun yaklaşık yarısı tepkisizdi. Çiçek kafa boşluğundan yayılan uçucu bileşiklerin çeşitliliği göz önüne alındığında bu durum şaşırtıcıdır, ancak sonuçlar preparasyonlar arasında tutarlılık göstermektedir ve diğer çalışmalarda da bildirilmiştir. Tepki veren birimlerin normalize edilmiş ateşleme hızı, bir grup koku maddesine karşı güçlü bir seçicilik olduğunu göstermektedir.

Oklarla belirtilen koku maddeleri en güçlü yanıtları oluşturmuştur. Bunlar demine ve trans beta osain'dir. Bu videoyu izledikten sonra, böceğinizi deney için nasıl hazırlayacağınız ve ardından çok kanallı kayıtlı gaz kromatografisini kullanarak deneyi nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu durumda amaç, karmaşık bir kokteyl içerisindeki davranışsal olarak etkili olduğu varsayılan koku maddelerini belirlemektir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür doğru bir şekilde izlenirse işlem iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Uçucu maddelerin böceğin davranışsal yanıtını etkilemedeki etkinliğini tam olarak belirlemek için, belirlenen koku maddeleriyle davranışsal testler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.