Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

Bu prosedürün genel amacı, yaban arısı beynindeki kayıtlar aracılığıyla biyolojik olarak etkili koku maddelerini karmaşık anlamda tanımlamaktır. Bu, ilk olarak davranışsal etki duyusunun toplanması ve ikinci olarak gaz kromatografının ve çok kanallı kayıt sistemlerinin deney için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Üçüncü adım, yaban arısı beynini fabrika lobunun antenindeki nöral kayıtlar için hazırlamak ve incelemektir.

Deney daha sonra elektrotların bir anten lobuna yerleştirilmesi ve karmaşık duyuya ve bunların bireysel bileşenlerine yanıt olarak nöral aktivitenin analizi ile şişirilmiş uçuculara verilen tepkilerin ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Gaz kromatografisi ile elde edilen biyolojik olarak aktif koku maddeleri tanımlanabilir. Dolayısıyla, bu tekniğin G-C-E-A-G gibi diğer tekniklere göre ana avantajı, anten yükü nöronlarının duyarlılığı ve beyindeki nöronların belirli çiçek uçucularına nasıl tepki verdiğini karakterize etme yeteneğidir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, elektrofizyolojik hazırlama kayıt tekniği ve üst boşluk uçucularının toplanması için gerekli adımlar nedeniyle kombine elektrofizyolojik ve kimyasal analitik adımların öğrenilmesi zor olduğundan, kritik öneme sahiptir. Bu teknik, bombus arılarının koku alma işlemine ilişkin içgörüler sağlayabilse de, sivrisinekler veya öpücük böcekleri gibi hastalık faktörleri veya yaprak bitleri veya güveler gibi mahsul zararlıları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedür için, bir saniyede bir mikro manipülatör üzerinde tungsten telden yapılmış bir referans elektrot hazırladınız.

Mikro manipülatör, bir ön amplifikatöre bağlı sarmal tel, tede veya silikon çok kanallı elektrot gibi çok kanallı bir elektroda sahiptir, korumalı bir BNC tablası üzerinde çıkışı olan bir gaz kromatografına sahiptir. GC dedektörünün çıkışı, hem nöral hem de GC sinyallerinin senkronize edilmesi için amplifikatör ve veri toplama sistemi ile arayüzlenir. Bu örnekte, GC taşıyıcı gazı helyumdur ve bir DB beş GC sütunundadır.

GC, sıcaklığı 200 santigrat dereceye ayarlanmış bir bölünmüş liste girişi kullanır ve alev iyonizasyon dedektörü sıcaklığı 230 santigrat dereceye ayarlanmıştır. Numuneler gc'de ısıtıldıktan sonra, kolondan gelen atık su, bir cam y konektörü kullanılarak alev iyonizasyon dedektörü ile B anteni arasında bire bir bölünür. Bu örnekte, GC, Kaliforniya'ya özgü bir alpin kır çiçeği olan Mimus Lewis göz çiçeklerinden dinamik absorpsiyon yoluyla toplanan uçucuları iletmek için kullanılır.

Alternatif olarak, gc'yi kullanmak yerine, tek uçucu bileşikler veya bileşiklerin karışımları hava darbeleri ile verilebilir. Bileşiklerin biriktirildiği bir parça filtre kağıdı içeren ayrı bir cam şırıngadan çekilir. Hava darbeleri, bir bilgisayar tarafından kontrol edilen solenoid aktif bir valf kullanılarak sabit bir Hava Akımından yönlendirilir.

Bir mililitrelik pipet ucunun ucundan yaklaşık bir santimetre keserek hazırlıklara başlayın. Pipet ucunun tabanına bir yaban arısı yerleştirin ve sadece kafa açıkta kalana kadar yavaşça ucun diğer ucuna doğru itin. Erimiş diş mumu kullanarak, açıkta kalan başın etrafında bir kalıp yapın.

Balmumu, kafayı tamamen hareketsiz hale getirmek için bileşik gözlere yapışmalı, ancak gerekirse antenle temas etmemelidir. Anteni hareketsiz hale getirmek için küçük pimler kullanın. Ardından, mikro neşter gibi keskin bir bıçak kullanarak kafa kapsülüne kesi gibi kare bir pencere açın.

Doğrudan antenin arkasından ve bileşik gözlerden birinin bitişiğinde kesmeye başlayın. Gözler arasında düz bir çizgi kesin. Ardından, kafa kapsülü toraksa doğru kıvrılana kadar dorsal olarak kesin.

Kafa kapsülünün diğer ucuna kadar kesmeye devam edin. Sonunda kareyi tamamlamak için başlangıca geri dönün. Kütikülü çıkarmak için forseps kullanın.

Antenin bitişiğindeki kütikül çıkarılmalıdır, aksi takdirde beyin açığa çıkar çıkmaz elektrotu engeller. Dokuyu hemen böcek tuzlu su ile süper kaynaştırın. Anten loblarının iyi açıkta olduğundan emin olun.

Ardından, anten loblarının hemen üzerindeki perinöral kılıfı çıkarmak için dikkatlice bir çift çok ince forseps kullanın. Arının beynini forseps ile delmemeye çok dikkat edin. Arı hazırlığı artık elektrofizyolojik kayıt için hazırdır.

Hazırlanan arıyı manyetik bir tabana sabitlenmiş bir kelepçeye takarak başlayın. Akış kontrolörü olan bir rezervuardan verilen böcek tuzlu su ile süper kaynaşmış halde tutun. Şimdi referans elektrodu karşı beyin dokusuna yerleştirin.

Ardından, çok kanallı elektrodu arının bir anten lobuna yerleştirin. Elektrotlar yerindeyken. Kayıtların sabitlenmesi için 30 ila 60 dakika bekleyin.

Bu süre zarfında, aynı zamanda eşikleme yaparak nöronlardan gelen hücre dışı sivri uçlara hazırlanın. Bireysel kayıt kanalları Kayıt kanallarındaki parazit nedeniyle bazı kanallar için manuel eşikleme gerekebilir. Ardından, GC çalışmasının sıcaklık rampasının doğru olduğunu doğrulayın.

Bu örnekte, sıcaklık dört dakika boyunca 50 santigrat derecede başlar ve daha sonra dakikada 10 derece artarak 220 santigrat derecelik bir son sıcaklığa yükselir veya altı dakika tutulur. Kayıt kanallarındaki birimlerin dalga biçimi şekilleri tutarlı hale geldiğinde, nöral kayıtlar kararlı olarak kabul edilir. Stabilize edildikten sonra, şırıngayı çiçeksi kafa boşluğu kokusuyla doldurun ve kokuyu gc'nin kafa enjeksiyon portuna enjekte edin.

Ardından, GC çalışması bittikten hemen sonra elektrotlardan kayda başlayın. Hazırlığı beş ila 15 dakika dinlendirin. Daha sonra ya GC'ye başka bir numune enjekte edin ya da tek uçucu bileşikler veya bileşik karışımları kullanarak preparasyonu uyarın.

Herhangi bir noktada spontan aktivite aniden durur veya değişirse, tuzlu su damlasını kontrol edin ve hazırlığın 15 dakika dinlenmesine izin verin. Daha sonra aktivite önceki seviyesine geri dönmezse, hazırlığı atın. Deneyden sonra, beyni hala dokudaki problarla sabitleyin, ardından beyni çıkarın, fiksatifi temizleyin ve beyni kurutun.

Kayıt kanallarının konumları daha sonra mimus Luci çiçek kokusundan konfokal mikroskopi ile tanımlanabilir. Toplam uçucu madde sayısı yağmalıyor. GC tipik olarak 60 ila 70 bileşik arasındadır.

Mimus Luci'nin kokusu ağırlıklı olarak beta miyozin ve alfa pinin dahil olmak üzere mono terpenoidlerden oluşur. Kokunun geri kalanı altı karbon uçucudan oluşur. Üç mikrolitre Mimus Lewis göz özütü ile çeşitli hazırlıklar uyarıldı.

Çok kanallı elektrot tarafından kaydedilen sekiz nöral birimden birinden alınan bu kayıt, bir nöronun belirli uçuculara ne kadar seçici rekabet ettiğini gösterir. Bu örnekte dine, gösterilen bileşiktir. İşte sekiz nöral birimin yanıtları.

Topluluğun yaklaşık yarısı tepkisizdi. Çiçek baş boşluğundan ima edilen uçucu bileşiklerin çeşitliliği göz önüne alındığında bu şaşırtıcıdır, ancak bu, müstahzarlar arasında tutarlıdır ve diğer çalışmalar tarafından rapor edilmiştir. Duyarlı birimlerin normalleştirilmiş ateşleme hızı, bir grup koku verici için güçlü bir seçicilik olduğunu gösterir.

Oklarla vurgulanan koku vericiler en sağlam tepkileri ortaya çıkardı. Bunlar demine ve trans beta osain'dir. Bu videoyu izledikten sonra, böceğinizi deneye nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamalı ve ardından deneyi çok kanallı kayıt ile gaz kromatografisi kullanarak yapmalısınız.

O zaman amaç, karmaşık bir buketdeki varsayılan davranışsal olarak etkili koku maddelerini tanımlamaktır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür izlendikten sonra uygun şekilde yapılırsa bu teknik iki ila üç saat içinde gerçekleştirilebilir. Böceğin davranışsal tepkisine aracılık etmede uçucu maddelerin etkinliğini tam olarak belirlemek için tanımlanan koku vericilerle davranışsal testler gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.