İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, cDNA ekspresyon klonlaması ve yeşil floresan proteinle işaretlenmiş Grab two'daki değişimlerin gözlemlenmesi yoluyla grab two'nun etkileşim ortaklarını belirlemektir. Bu süreç, ikinci bir adım olarak öncelikle bakteriyel lizatlardan bir cDNA kütüphanesi hazırlanarak gerçekleştirilir. cDNA'lar, ilgi duyulan genlerle birlikte raporlayıcı konstrüktun ekspresyonuyla sonuçlanacak şekilde insan embriyonik böbrek hücrelerine transfekte edilir.

Ardından, hücreler genelindeki Grb2 lokalizasyonundaki değişiklikleri görselleştirmek amacıyla transfekte edilmiş plakalar Opera mikroskobunda analiz edilir; floresan mikroskopiye dayalı olarak, GFP etiketli Grb2'nin epidermal büyüme faktörü reseptörü aracılığıyla endozomlara toplandığını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, iki hibrit sistem gibi mevcut yöntemlere kıyasla temel avantajı, Grb2 etkileşim ortaklarının, etkileşim ortaklarının subselüler dağılımını göz önünde bulunduran fizyolojik bir durumda tanımlanabilmesidir.

Her ne kadar bu yöntem Grab two ile sinyal iletimini tanımlamak için kullanılabilse de, ilgilenilen diğer proteinler gibi farklı sistemlere de uygulanabilir. cDNA kütüphanesi, gliserol stokları içindeki tekil bakteriyel klonlar şeklinde sağlanmaktadır.

Hudson Rapid pick light'ın seçici menüsündeki re ray komutunu kullanarak 96 kuyucuklu formatta, kaynak plaktan bakteriyel klonları seçin ve 96 derin kuyucuklu bir plaktaki 1,5 milliliters lb amp içerisine inoküle edin. Derin kuyucuklu plakları gaz geçirgen bir sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve bir çalkalayıcıda 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bakteri içeren derin kuyucuklu plakları 2000 RPM'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Masaüstü santrifüjde plaka adaptörleri kullanarak, bakteriyel peleti bozmadan kuyucuklardaki medyumu aspire edin. Ardından, Tecan Freedom Evo Otomasyon iş istasyonunun platformunu burada gösterildiği gibi konfigüre edin. Plazmit hazırlama solüsyonlarını bir ile beş arasındaki oluklara dağıtın ve platforma derin kuyucuklu bir plaka yerleştirin.

Alucian çözeltisi içeren çok kuyucuklu bir tekneyi derin kuyucuklu plakanın yanına yerleştirin ve uçları uç raflarına yükleyin. Vakum manifoldunu monte edin. Plazmit bağlama plakası manifoldun içine, plazmit filtre plakası ise manifoldun üzerine yerleştirilir. Peletleri 250 µL çözelti bir ile yeniden süspande edin.

Resus süspansiyon tamponu ekleyip pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın. Peletlerin tamamen resüspande edildiğinden emin olmak, bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. Eğer pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi peleti tamamen resüspande etmezse, bir çalkalayıcı kullanılabilir.

Peletler tamamen süspanse edildikten sonra, lizis tamponuna 250 microliters çözelti ekleyerek bakterileri lize edin. Plakayı kapatın ve tam karışımı sağlamak için ters çevirin. İki dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.

Ardından, 350 µL çözelti üç ekleyin. Nötralizasyon tamponu. Plaka ağzını kapatın ve üç kez altüst ederek karıştırın.

Bakteri lizatlarını plazmit filtre plakalarına aktarın. Beş dakika boyunca vakum uygulayın. Filtre plağını çıkarın ve bağlama plağını manifoldun üzerine yerleştirin.

Bir dakika boyunca vakum uygulayın. 500 µL ek yıkama tamponu ekleyin ve iki dakika boyunca vakum uygulayın. 900 µL yıkama tamponu çözeltisi 4 ekleyin ve iki dakika boyunca vakum uygulayın.

Ardından, tekrar 900 microliters yıkama tamponu çözeltisi dört ekleyin ve 15 dakika boyunca vakum uygulayın. DNA toplama plakasını manifoldu içine yerleştirin. Bağlama plakasına 100 microliters Elucian tamponu ekleyin ve iki dakika boyunca inkübe edin.

10 dakika boyunca vakum uygulayın. Son olarak, toplama plakasını çıkarın ve NanoDrop 8, 000 kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Bu prosedüre başlamak için bu yöntemle tipik olarak mikrolitre başına yaklaşık 100 nanogram verim elde edilmesi beklenebilir.

Hec 2 9 3 hücreleri tripsinize edilip sayıldıktan sonra, bir otomatik dağıtıcı kullanarak Perkin Elmer View plakasının her kuyucuğuna 2 × 10⁴ hücre dağıtın. Hücreleri, transfeksiyon işlemi için 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.

Otomatik sıvı işleyiciyi kullanarak, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna şu karışımı hazırlayın: 25 µL serumsuz ortam içerisinde 100 ng GFP plazmit DNA ve 100 ng CD NA. Ardından, her kuyucuğa 0,5 µL transfectin içeren 25 µL serumsuz ortam ekleyin ve 30 dakikalık zamanlayıcıyı başlatın.

30 dakika sonra, cDNA transfeksiyon karışımından 50 µL'yi nazik bir dağıtma yöntemi kullanarak hücrelere aktarın. Hücreleri 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin.

Görüntüleme işlemine başlamak için Opera yazılımını çalıştırın. Konfigürasyon sekmesini seçerek 20x objektifi ve doğru plaka tipini belirleyin. Farklı plaka tipleriyle odaklama yapabilmek için objektif üzerindeki halkanın (collar) doğru değere ayarlandığından emin olun.

Ardından, mikroskop sekmesini seçin. Birinci pozlamayı fite 4 88 lazer, ikinci pozlamayı ise UV 365 lazer olarak tanımlayın. Her iki pozlamada da UV filtresini etkinleştirin ve pozlamayı atayın.

Birinci pozlama için birinci kamerayı, ikinci pozlama için ise ikinci kamerayı ayarlayın. Pozlama sürelerini birinci pozlama için 800 milliseconds ve ikinci pozlama için 40 milliseconds olarak belirleyin.

İkinci olarak, pozlama seçeneğini belirleyin ve odak yüksekliğini sıfır mikrona ayarlayın. Odaklama tamamlandığında odağı seçin. Birinci kamerayı pozlayın.

Pozlama düzlemini optimize etmek için odak yüksekliğini ayarlayın ve yükseklik al düğmesine tıklayın. Pozlama parametrelerini kaydedin, ikinci pozlama için işlemi tekrarlayın. Deney tanımı sekmesini seçin, yerleşim ve alt yerleşim oluşturun.

İlgili düzeni, pozlamayı, referans görüntüsünü, eğikliği, kırpma dosyasını ve alt düzeni sürükleyip bırakın. Deneyi kaydedin. Otomatik deney sekmesini seçin ve normal koşullar altında görüntüler edinin.

Grab two hücrenin tamamına yayılmış durumdadır. Bir büyüme faktörü reseptörünün stimülasyonu üzerine, plazma membranına transloke olur ve ardından endozomlara internalize edilir. Bu şekildede, üst panel GFP grab two ile geçici olarak transfekte edilmiş CO M altı hücrelerini göstermektedir ve beklendiği üzere, floresan hücre geneline yayılmıştır.

Ancak, GFP-Grab2 ve hücre yüzeyi reseptörü IT-EGFR ile geçici olarak transfekte edilen hücrelerde, alt panelde gösterildiği gibi Grab2 endozom benzeri yapılara yer değiştirir. Bu nedenle, genom çapında bir kütüphane uygulandığında, yeni Grab2 bağlayan hücre yüzeyi proteinlerinin tanımlanabileceği öngörülebilir. Bu yöntem, sadece hücre yüzeyi proteinlerinin tespiti ile sınırlı değildir.

Örneğin, Grb2 aracılı endositozda rol oynayan GTPaz DYNAMIN 2, Grb2'nin translokasyonunu tetikler. Bu deneyde, GFP-Grb2 ve DNM2, HEK 293T hücrelerine birlikte transfekte edilmiştir. GFP-Grb2'nin endozom benzeri yapılara yer değiştirmesi, kırmızı daire içindeki hücrelerle gösterilmiştir.

Bu prosedürün ardından, etkileşimin doğrudan mı yoksa dolaylı mı olduğu gibi daha ileri soruları yanıtlamak için immünopresipitasyon veya biyokimyasal analizler gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre altı protein etkileşimlerini tanımlamak için ekspresyon klonlamanın nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.