İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, CD NA ekspresyon klonlaması ve Grab two etiketli yeşil floresan proteinindeki değişikliklerin gözlemlenmesi ile grab two'nun etkileşim ortaklarını belirlemektir. Bu, ikinci adım olarak önce bakteri lizatlarından bir CD NA kütüphanesi hazırlanarak elde edilir. CDNA'lar insan embriyonik böbrek hücrelerinde transfekte edilir, bu da ilgilenilen genlerle birlikte raportör yapısının ekspresyonu ile sonuçlanacaktır.

Daha sonra, transfekte edilmiş plakalar, hücreler boyunca grab iki lokalizasyonundaki değişiklikleri görselleştirmek için opera mikroskobunda analiz edilir, epidermal büyüme faktörü reseptörü aracılı GFP alımını gösteren sonuçlar elde edilir. Floresan mikroskobuna dayalı olarak iki ila endozom alın. Bu tekniğin, bu iki melez gibi mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında temel avantajı, iki kapma etkileşim ortaklarının, etkileşim ortaklarının hücre altı dağılımını hesaba katan fizyolojik bir durumda tanımlanabilmesidir.

Yine de, bu yöntem Grab two ile sinyal iletimini tanımlamak için kullanılabilir. İlgilenilen diğer proteinler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. CDNA kütüphanesi, gliserol stoklarında tek bir bakteri klonu sağlar.

Hudson Rapid toplama ışığının seçici menüsündeki re ray komutunu kullanarak 96 kuyu formatında. Kaynak plakasından bakteri klonlarını seçin ve 96 derin kuyu plakasında 1,5 mililitre lb amp'ye aşılayın. Derin kuyu plakalarını gaz geçirgen bir conta ile geç kapatın ve gece boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda inkübe edin Ertesi gün, bakteri A 2000 RPM içeren derin kuyu plakalarını 20 dakika döndürün.

Bir masa üstü santrifüjde plaka adaptörleri kullanarak, bakteri peletini sağlam bırakarak kuyulardan ortamı aspire edin. Ardından, Tecan Freedom Evo Automation iş istasyonunun güvertesini burada gösterildiği gibi yapılandırın. Plazmid hazırlama çözeltilerini bir ila beş çukurlara dağıtın ve güverteye derin bir kuyu plakası yerleştirin.

Derin kuyu plakası yük uçlarının bitişiğine alucian solüsyonu içeren çok kuyulu bir oluk yerleştirin, uç raflarına yerleştirin. Vakum manifoldunu monte edin. Plazmit bağlama plakası manifoldun içine yerleştirilir ve plazmit filtre plakası, 250 mikrolitre birinci çözelti ile manifold Resus süspansiyon peletlerinin üzerine yerleştirilir.

Yukarı ve aşağı pipetleme yoluyla Resus süspansiyon tamponu. Peletlerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olmak, bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. Yukarı ve aşağı sevişme peleti tamamen yeniden askıya almazsa, bir çalkalayıcı kullanılabilir.

Peletler tamamen yeniden süspanse edildikten sonra, lizis tamponuna 250 mikrolitre çözelti ekleyerek bakteriler yatar. Plakayı kapatın ve tam karıştırmaya izin vermek için ters çevirin. İki dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın.

Daha sonra, 350 mikrolitre çözelti üç ekleyin. Nötralizasyon tamponu. Plakayı kapatın ve üç kez çizgileri ters çevirin.

Bakteri lizatlarını plazmid filtre plakalarına aktarın. Beş dakika boyunca vakum uygulayın. Filtre plakasını çıkarın ve bağlama plakasını manifoldun üzerine yerleştirin.

Bir dakika boyunca vakum uygulayın. 500 mikrolitre ek yıkama tamponu ekleyin ve iki dakika boyunca vakum uygulayın. 900 mikrolitre yıkama tamponu çözeltisi dört ekleyin ve iki dakika boyunca vakum uygulayın.

Bundan sonra, 900 mikrolitre yıkama tamponu çözeltisi dördü tekrar ekleyin ve 15 dakika boyunca vakum uygulayın. DNA toplama plakasını manifoldun içine yerleştirin. Bağlama plakasına 100 mikrolitre Elucian tamponu ekleyin ve iki dakika inkübe edin.

10 dakika boyunca vakum uygulayın. Son olarak, toplama plakasını çıkarın ve NanoDrop 8.000 kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Tipik olarak, bu prosedüre başlamak için bu yöntemle mikrolitre başına yaklaşık 100 nanogramlık bir verim beklenebilir.

Hec 2 9 3'ten sonra hücreler tripler, inize edilir ve sayılır. Bir Perkin Elmer'in her bir kuyucuğuna iki kez 10 ila dört hücre dağıtmak için otomatik bir dağıtıcı kullanın. Plakayı görüntüle hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve transfeksiyon için% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Yuvarlak tabanlı 96, kuyu plakası 100 nanogram GFP'nin her bir kuyucuğunda aşağıdaki karışımı hazırlamak için otomatik sıvı işleyiciyi kullanın. 25 mikrolitre serumsuz ortamda 100 nanogram CD NA içeren iki plazmit DNA alın. Daha sonra, kuyu karışımı başına 0,5 mikrolitre transfect içeren 25 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin ve zamanlayıcıyı 30 dakika boyunca başlatın.

30 dakika sonra, CDNA transfect'inde 50 mikrolitreyi karışım halinde hücrelere aktarın. Nazik bir dağıtım yöntemi kullanarak. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Görüntü alımına başlamak için opera yazılımını başlatın. Konfigürasyon sekmesini seçin ve 20 kez objektifi ve doğru plaka tipini seçin. Farklı plaka tipleriyle odaklanmaya izin vermek için bileziğin hedef üzerinde doğru değere ayarlandığından emin olun.

Ardından, mikroskop sekmesini seçin. Birinci pozlamayı fite 4 88 lazer ve ikinci pozlamayı UV 365 lazer olarak tanımlayın. UV filtresini her iki pozlamada da etkinleştirin ve pozlama atayın.

Biri kameraya, biri ve pozlama. İkiye kameraya iki. Pozlama sürelerini pozlama için 800 milisaniyeye, pozlama için bir ve 40 milisaniyeye ayarlayın.

İki, pozlamayı seçin, biri odak yüksekliğini sıfır mikrona ayarlayın. Odaklandıktan sonra odağı seçin. Birinci kamerayı ortaya çıkarın.

Pozlama düzlemini optimize etmek için odak yüksekliğini ayarlayın ve yüksekliği al'a tıklayın. Pozlama parametrelerini kaydedin, pozlama için tekrarlayın. İkincisi, deney tanımı sekmesini seçin, düzen ve alt düzen oluşturun.

İlgili düzeni, pozlamayı, referans görüntüsünü, eğriliği, kırpma dosyasını ve alt düzeni sürükleyip bırakın. Denemeyi kaydedin. Otomatik deney sekmesini seçin ve normal koşullar altında görüntüleri alın.

Grab two, tüm hücre boyunca lokalizedir. Bir büyüme faktörü reseptörünün uyarılması üzerine, plazma zarına yer değiştirir ve daha sonra endozomlara içselleştirilir. Bu şekilde, üst panel, GFP ile geçici olarak transfekte edilen CO M altı hücresini göstermektedir ve beklendiği gibi, floresan hücre boyunca dağıtılır.

Bununla birlikte, GFP ile geçici olarak transfekte edilen hücrelerde, iki tane al artı hücre yüzeyi reseptörü IT EGFR, alt panelde gösterildiği gibi endozom benzeri yapılara iki tane yer değiştirir. Bu nedenle, genom çapında bir kütüphane uygulandığında, yeni kavrama iki bağlayıcı hücre yüzey proteininin tanımlanabilmesi beklenebilir. Bu yöntem, hücre yüzey proteinlerinin tespiti ile sınırlı değildir.

Örneğin, iki grab'ın aracılı endositozunda yer alan GPA'nın DYNAMIN iki'si, grab two'nun translokasyonunu indükler. Bu deneyde, GFP kepçe iki, DNM iki ile HEC 2 93 T hücrelerine manşon transfekte edildi. GFP'nin iki ila endozom benzeri yapılara yer değiştirmesi, kırmızı daireler içindeki hücreler tarafından gösterilir.

Bu prosedürü takiben, etkileşimin doğrudan mı yoksa dolaylı mı olduğu gibi diğer soruları yanıtlamak için immünopresipitasyon veya biyokimyasal tahliller gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre altı protein etkileşimlerini tanımlamak için ekspresyon klonlamanın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.