Name: İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Keşfedin Grb2 protein etkileşim ortaklarını yüksek içerikli görüntüleme ile memeli hücrelerde. Bu yöntem, GFP etiketli Grb2'nin hücre içi lokalizasyon değişikliklerini görselleştirir ve genom çapında tarama olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Tıbbi Araştırma Konseyi ve Marie-Curie Uluslararası Yeniden Entegrasyon Hibe Programı (JKV için) tarafından desteklenmiştir.

1. CDNA İfade Klonlar Toplama <ol><li> CDNA kütüphanesi, bir 96-gözlü formata gliserol stokları tek bir bakteriyel klonlar olarak sağlanır. Norgen CP7200 ve seçici menüsünden Rearray komutunu kullanarak, bir 96-derin kuyu (1 ml de) plaka 1.5 ml LB / amp içine kaynak plaka ve inokülasyon bakteriyel klon almak. </li><li> Bir gaz-geçirgen keçe ile derin kuyu plakaları ve bir çalkalama kabında 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 2. CDNA İfade Kütüphanesi hazırlanması <ol><li> Bir masa üstü santrifüj plaka adaptör kullanarak 20 dakika 2.000 rpm&#39;de bakteri içeren derin kuyucuklu plakalar Spin. </li><li> Bakteriyel pelet zedelemeden, kuyulardan medya aspire. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi Lab otomasyon iş istasyonunun güverte yapılandırır. Plazmid hazırlama için çözümler 1-5 olukları içine dağıtılır ve derin kuyu plakası güverte üzerine yerleştirilir. Elüsyon çözeltisi ile bir oluk multiwellderin kuyucuklu plakaya bitişik yerleştirilir. İpuçları ucu rafları yüklenir. </li><li> Vakum manifoldunun birleştirin. Plazmid bağlayıcı levha manifoldu içine yerleştirildi ve plazmid filtre plakası manifold üstüne yerleştirilir. </li><li> Aşağı yukarı pipetleme ve tarafından 250 ul Çözüm 1 (Tekrar Süspansiyonu tamponu) pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 250 ul Çözelti 2 (lizis tamponu) ilave bakterilerin bir parçalayıcı. Plaka mühürlü ve tam karıştırma sağlamak için ters çevrilir. </li><li> 2 dakika zamanlayıcı başlatın. </li><li> 350 ul Çözüm 3 (Nötralizasyon tamponu) ekleyin. Plaka Seal ve 3 kez ters. </li><li> Plazmid filtre plakalarına bakteri lizatları aktarın. </li><li> 5 dakika süreyle vakum uygulayın. </li><li> Filtre plakasını çıkarın ve manifold üstünde bağlayıcı plaka yerleştirin. 1 dakika için vakum uygulayın. </li><li> Ilave yıkama (AW) tampon 500 ul ekleyin. </li><li> 2 dakika süreyle vakum uygulayın. </li><li> Yıkama tamponu Çözüm 4 900 ul ekleyin. 2 dakika süreyle vakum uygulayın. </li><li> Tekrar s2.14 tep. Ek bir 15 dakika boyunca vakum uygula. </li><li> Manifoldundaki DNA toplama plakası yerleştirin. Bağlayıcı levha ile elüsyon tampon 100 ul ilave edin ve 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 10 dakika için vakum. </li><li> Nanodrop 8000 kullanarak toplama plakası ve ölçü DNA konsantrasyonu çıkarın. Tipik olarak ~ bir verimle 100 ng / ml &#39;den bu yöntem ile tahmin edilebilir. </li></ol> 3. Hücre Seeding <ol><li> HEK293 hücreleri tripsinize ve sayılır. </li><li> 2 x 10 4 hücre ThermoFisher 96-multidrop kullanarak bir Perkin Elmer Viewplate her oyuğuna dağıtılır. </li><li> Hücreler gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2. </li></ol> 4. Transfeksiyon <ol><li> 25 ul serum içermeyen aracı madde içinde başına da 96-kuyulu yuvarlak dipli bir levha içinde 100 ng cDNA ile 100 ng GFP-Grb2 plazmid DNA bir karışım hazırlayın. </li><li> Kuyu başına 0.5 ul Transfectin içeren 25 ul serum serbest medya ekleyin. </li><li> Mix ve zamanlayıcı fo başlarr 30 dk. </li><li> Hafif bir dağıtma yöntemi kullanılarak hücrelere Transfectin / cDNA karışımı 50 ul aktarın. Alternatif olarak, transfeksiyon karışımı levhaları içine ilk olarak dağıtılır ve daha sonra hücreler üzerine ilave edilebilir (ters transfeksiyon). </li><li> 37 hücreleri gece boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2. </li></ol> 5. Image Acquisition <ol><li> Opera yazılımını başlatın. Deney bir düzeneğin ekran görüntüsünü, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. &quot;Yapılandırma&quot; sekmesini seçin ve 20x objektif ve doğru plaka tipini seçin. &quot;Yaka&quot; olun farklı plaka tipleri ile odaklama sağlamak için objektif üzerinde doğru değere ayarlanır. </li><li> &quot;Mikroskop&quot; sekmesini seçin. Olarak FITC (488 lazer) ve pozlama 2 olarak maruz tanımlama 1 UV (365 lazer). Hem riskler üzerine UV filtresini etkinleştirin ve kamera 1 ve kamera 2 maruziyeti 2 maruziyeti 1 atayın. Pozlama 1 ve pozlama 2 için 40 msn, 800 msn maruz kalma süreleri belirleyin. </li><li> &quot;Mikroskop&quot; sekmesini seçin. E tanımlayınUV (365 lazer) gibi FITC (488 lazer) ve pozlama 2 olarak Xposure 1. Hem riskler üzerine UV filtresini etkinleştirin ve kamera 1 ve kamera 2 maruziyeti 2 maruziyeti 1 atayın. Pozlama 1 ve pozlama 2 için 40 msn, 800 msn maruz kalma süreleri belirleyin. </li><li> Pozlama 1 seçin. Yüksekliği 0 mikron odağı ayarlayın. &quot;Odaklama&quot; öğesini seçin. Bir kez odaklı, kamera 1. açığa. Pozlama düzlemi optimize etmek ve &quot;Al yükseklik&quot; üzerine tıklayın odağı yüksekliğini ayarlayın. ~ 3.000 maksimum piksel yoğunluğu vermek pozlama süreleri ve lazer güç değiştirin. Pozlama parametreleri kaydediniz. Pozlama 2 için tekrarlayın. </li><li> &quot;Experiment Definition&quot; sekmesini seçin. Düzen ve sublayout oluşturun. Sürükle ve ilgili düzeni, pozlama, referans görüntü, skewcrop dosya ve sublayout bırakın. Deney kaydedin. </li><li> &quot;Otomatik Experiment&quot; sekmesini seçin ve görüntüleri elde. </li></ol> 6. (ImageJ 1.46h sürümü dayanarak.) Görüntü Analizi <ol><li> Kullanarak özel PerkinElmer dönüştürün. Esnek dosyaları Tagged Image Format. Tif dosyasıFlex2Volocity Acapella komut. </li><li><ol><li> Bir yığın sonuçlanan bir görüntü dizisi gibi ImageJ görüntüleri aktarın. </li><li> Hyperstack menü öğesi Resim / Hyperstack / Stack seçerek 2 kanal hyperstack içine yığın dönüştürün. Dilim sayısı alınan yığının yarısı ile ayarlanmalıdır. </li><li> Resim / Duplicate komutunu kullanarak GFP kanalı çoğaltın: Yinelenen hyperstack onay kutusunu işaretleyin ve Kanallar belirtin: 1-1. Ahiret çoğaltılamaz yığın kullanın. </li></ol></li><li> İşlem Seçin / 0.01% doymuş piksel Kontrast Geliştir, yığın histogram kullanılarak ve Image/Type/8-bit ile 8 bit dönüştürmek. </li><li> Kontrast eşiği (Parametre 1) q = 30 ile Bernsen algoritması kullanılarak 15 piksel yarıçapı yerel uyarlamalı segmentasyon tanımlayın. Görüntü ayarla / / Otomatik Yerel Eşik menüsünde siyah arka plan onay kutusunu Beyaz nesneleri işaretleyin. </li><li> Segmentasyon kalite kontrol: orijinal görüntüler üzerinde segmante nesnenin kontur bindirme oluşturur. </li><li> Fonksiyonlarıparçacıklar analiz ederek ekstraksiyon re: Ölçüm alanı, demek ve her organel toplam yoğunluğu. Sonuç dosyaları kaydedin. </li><li> R özellikleri sonucu dosya açın ve bir histogram oluşturur. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Normal şartlar altında Grb2 tüm hücre boyunca lokalizedir. Bir büyüme faktörü reseptörünün uyarılması üzerine bunun plazma membranı ile tercüme ediyor ve Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi daha sonra endozomlar içine içsellestirildi. Bağlayıcı Grb2 yeteneğine sahip bir hücre yüzey reseptörü ifade translokasyon uyarmak için yeterlidir. Tipik bir tarama deneyinde, GFP-Grb2 yerelleştirme herhangi bir değişiklik gözlenmiştir. Ancak, bir protein ifade edildiği zaman, bir alt-hücresel siteye askerler Grb2, floresan mikroskobu ile kolaylıkla görülebilmektedir olabilir lokalizasyon bir değişiklik olduğunu. Endosome benzeri yapılara GFP-Grb2 arasında relokalizasyon içinde EGFR sonuçları örneği, ifade için (Şekil4). Bu nedenle, bir genom kitaplığı uygulanırken, bu yeni Grb2-bağlayıcı hücre yüzey proteinleri ile tespit edilebilir olması beklenebilir. Bu yöntem, hücre yüzey proteinlerinin tespiti ile sınırlı değildir. Örneğin, Dynamin2 GFP-Grb2 endosome gibi işe (Şekil 5) görüntüleme alt-hücre lokalizasyonu bir değişim olmaktadır. Dynamin2 Grb2 ve C-terminal domain SH3 bağlanır ve bu kompleks 9,10 endositoz yer almaktadır. Dolayısıyla, bu yaklaşım, genel protein bağlayıcı komplekslerin belirlenmesine olanak tanır ve SH2 etki için etkileşim ortak tanımlanması ile sınırlı değildir. Translokasyon birkaç farklı türde başka sitoplazmik veziküler yapı veya çekirdek için, endozomlar için, bu tür plazma membranına yerelleştirme olarak beklenebilir. Bu nedenle, tüm görüntüleri de göz tarafından kontrol edilmesi tavsiye edilir. Bununla birlikte, büyük kümeler tarama sırasında otomatik bir cDNAgörüntü analizi algoritması daha pratiktir. Bu durumda, algoritmalannın birleşiminin bu tür hücresel şekil değişiklikleri belirlemek için mekik nükleer ve genel morfolojik algoritmaları belirlemek için endozomlar, sitoplazma / çekirdek tespit belirlemek için nokta algılama gibi arzu edilen bir durumdur. Bu farklı fenotipik algılama yöntemlerinin kullanılması başka 11 daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Şekil 1. Deney Genel düzeni. Deneme ayrıntılarının cDNA kütüphanesinin amplifikasyon ve hazırlık, ücretsiz açık yazılım ImageJ kullanılarak cDNA vektörler artı muhabiri yapıları, görüntü elde etme ve görüntü analizi transfeksiyon ile başlayan tam bir yüksek içerik tarama iş akışı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> FTecan Deck ŞEKIL 2. Yapılandırma. (1) sol tarafında, beş 100 ml olukları tamponları 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) ve A4 (100 mi) ile doldurulması gerekmektedir. Yalak A4 prosedürü sırasında bir kez yeniden doldurulması gerekir. (2) vakum manifoldu, bu örnekte pozisyon 14 üzerinde yer alır. (3) Bakteri peletleri ile derin kuyu plakası 25 ml Seyreltme Tampon maddesi ile elüsyon tampon teknesine sonraki pozisyonu, 30 üzerinde yer alır. (4) 8-kanal baş Disposable ipuçları pozisyonu 40 doldurulması gerekir kanallı kafa için sol tarafta ve ipuçları üzerinde ucu raflara yüklenmesi gerekiyor. Bu deneyde kullanılan Tecan FreedomEvo sıvı işleyici 500 ul şırınga ile donatılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> ŞekilOpera LX görüntü elde etme 3. Otomasyon. A) Yapılandırma sekmesini seçin (1). Deneme (2) için gerekli lazer çizgileri etkinleştirin. Görüntü elde etme (3) kameraları seçin. Deneme (4) plaka tipi ve objektif lens seçin. B) mikroskop sekmesini seçin (1). Işık kaynağı ve pozlama 1 (2,3) için pozlama süresini tanımlayın. Iyi birine odaklanın ve yükseklik (4) alabilir. C) Deney Tanım sekmesini seçin (1). Sürükle ve pozlama, skewcrop, referans, düzen ve sublayout dosyaları (2) bırakın. Sürükle ve deney dosya (3) bırakın. D) Otomatik Deneyi (1) seçin. Sürükle ve deneme dosyası (2) bırakın. Uygun barkod (3) ayırın. Start düğmesine (4) tıklayarak görüntü yakalama başlayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strocDNA ifadeye göre ng&gt; Şekil 4. GFP-Grb2 translokasyon. GFP-Grb2 bir transmembran büyüme faktörü reseptör ekspresyonu üzerine endosome benzeri yapılara baskın bir sitoplazmik yerleşim bölgesine yerleştirir ve akabinde endozomlar için içselleştirir. Sol tarafta, COS M6 hücrelerin mikroskop görüntüleri geçici GFP-Grb2 (üst) veya GFP-Grb2 artı EGFR (alt) ile transfekte olduğu gösterilmiştir. Endosome benzeri yapılara GFP-Grb2 arasında tehcir EGFR sonuçlarının Co-ifadesi. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Şekil 5. GFP-Grb2 cDNA indüklenen translokasyon örneği. Grb2-aracılı endositoz katılır GTPaz Dynamin2, endosome benzeri yapılar (daire) için GFP-Grb2 yerleştirir. Bu deneyde, GFP-Grb2 HEK293T hücreleri içine DNM2 ile birlikte transfekte edildi. 24 saat ve görüntüleri ope yakalanmaları sonrasında Hücreler Hoechst 33342 ile boyandıra LX. Bir yeşil (GFP) kanal görüş alanı ve UV (mavi; Hoechst 33342) görüntülenir.

<ol><li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li>
<li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr%2FAbl+and+epidermal+growth+factor+receptor%3A+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li>
<li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li>
<li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feynman+trajectories%3A+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li>
<li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22in+Live+Cells.+ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li>
<li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li>
<li>Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789%2C+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li>
<li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Ash%2FGrb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li>
<li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li>
<li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+expression+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

İfade klonlama gibi virüs reseptörleri ve kan hücre antijenleri 12 gibi yeni hücresel bileşenleri tanımlamak için geçmişte kullanılan bir güçlü bir araçtır. Burada, Grb2 bağlanan yeni varsayımsal sinyal iletim reseptörlerin belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokolü bir kaç kritik adımlar vardır. <ol><li> Otomatik plazmid hazırlanması için bu bakteriyel pelet tam olarak yeniden süspanse olması kesinlikle gereklidir. Bazı durumlarda, katı bir sallama adım ya da pipet ile daha ileri karıştırma dahil etmek için gereklidir. </li><li> Çözelti, 2 ve 3 eklendikten sonra, karışım tamamlanması önemlidir ve el ile ters mühürlü bir otomatik plaka çalkalayıcısı kullanımı çok daha etkili olduğunu bulduk. Bu DNA kesme yol açacak gibi pipetleme bu aşamada kaçınılmalıdır. </li><li> Bütün vakum adımda, bir sıvı tamamen boşaltılır sağlamak zorundadırplaka. Aksi takdirde, düşük verimler beklenmez. </li><li> Elüsyon sonra, o arındırıldı ve plazmid bağlayıcı plaka alt kısmında, su damlalarının oldukça yaygındır. Bu damlalar elüsyon plakasında toplanırken edilmesi gerekir, bu yüzden plazmid bağlayıcı levha dikkatli bir şekilde kaldırılır ve alt kısmında herhangi bir kalıntı dikkatli bir şekilde damla elüsyon için levha transfer edilmesi tavsiye edilir. </li><li> Transfeksiyondan sırasında kompleks oluşumunun zaman çok önemlidir. Biz genellikle 20-30 dk uymak. Daha kısa sürelerde tavsiye edilmez ise 1 saat kadar uzun kat, verimde bir azalma olmadan gayet iyi. </li><li> Mikroskopi için, büyütme seçimi önemlidir. Burada kullanılan Opera LX sisteminde, 20x çözünürlük yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yeterlidir. Yüksek çözünürlüklü görüntüler gerekiyorsa, nesnel hücrelerin istatistiksel olarak anlamlı numaralarını almak için değişti, ama olabilir, alanlar ve yüksek satın alma kez daha yüksek bir sayı gereklidir. Genel olarak, bu amaçkuyu başına yansıması en az 100 hücre elde etmek. </li></ol> Grb2 translokasyon tahlil EGFR kinaz aktivasyonu 6 küçük molekül inhibitörleri tanımlamak için diğer gruplar tarafından kullanılmıştır. Bu durumda, EGFR, özellikle ligand plazma membranına Grb2 alımına yol ile aktive edilir. Bu etkileşimin bozulması sonra küçük molekül bileşikleri kullanılarak incelenebilir. Benzer bir şekilde, siRNA ekranlar EGFR-Grb2 sinyal ya da c-Kit veya eritropoietin reseptörü gibi diğer Grb2-bağlayıcı büyüme faktörü reseptörleri ile ilgili endojen genlerin tanımlanması için kullanılabilir, ki öngörülebilir. Bu nedenle, bu yöntem için birden fazla potansiyel uygulamalar vardır. Benzer bir yaklaşım, SHC, Gab veya IRS gibi diğer adaptör moleküller için GFP etiketli muhabiri sistemlere uygulanabilir. Memeli hücrelerinde bu hücre-tabanlı tahlil kullanarak bir büyük avantajı, fizyolojik rel kimlik olanak tanımasıdırTemiz su ve etkileşimleri. Tahlil protein kompleksi oluşumu için bir gösterge olduğunu, ancak daha da önemlisi, ilgili etkileşimler doğru alt hücresel yerinde takip edilmektedir. Bu bağlamda, bu yöntem bu tür maya iki-hibrid ya da in vitro tahlillerin gibi diğer protein-protein etkileşimi yöntemler kalıntıların üstesinden gelir. Bu dolaylı etkileşimleri aynı zamanda Grb2 alım neden olabilir ki, ancak dikkate alınmalıdır. Benzer şekilde, bağlayıcı ortakların transkripsiyonel up-regülasyonu cDNA ifadesi neden olabilir. Bu olasılıklar arasında ayrım için, doğrudan ve dolaylı bağlayıcı etkileri ayırt etmek için uygun ikincil deneyleri gerçekleştirmek için gereklidir. Sonuç olarak, GFP-adaptör molekül translokasyon tahlil genom taraması ve ilaç keşif uygulamaları için yüksek bir potansiyele sahiptir.

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> cDNA kütüphanesi </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gaz geçirgen keçe </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin 96 Plazmid Takımı </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Özgürlük Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Vakum manifoldu ile </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr></table>

İfade klonlama tarafından grb2 sinyal kompleksi eğitim için bir yüksek içerik görüntüleme İş akışı

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Büyüme faktörü reseptörleri tarafından sinyal iletimi proliferasyon ve farklılaşma korumak için hücreleri için gerekli olan ve sıkı kontrol gerektirir. Sinyal transdüksiyonu bir transmembran reseptörü ve alt sinyalleme kaskadını aktivasyonu için harici bir ligand bağlayıcı tarafından başlatılır. Mitojenik sinyalizasyon bir anahtar regülatör Grb2, enzimatik aktivite yoksun iki SH3 etki ile çevrili bir iç SH2 (Src homoloji 2) etki oluşan modüler bir proteindir. Grb2 bir bileşeni olarak N-terminal SH3 etki yoluyla GTPaz son-of-Sevenless (SOS) ile ilişkilidir. Grb2 ve SH2 etki dolayısıyla SOS-Ras-MAP kinaz sinyal kaskad reseptör aktivasyonu kaplin fosforile tirozin kalıntılar büyüme faktörü reseptörlerine bağlanır. Buna ek olarak, sinyalleme ve reseptör endositoz bir pozitif ya da negatif bir düzenleyici olarak Grb2 için başka roller tarif edilmiştir. Grb2 ve modüler bu bileşimin özelliği, reseptör ve iletimine çeşitli dayayabilirsiniz düşündürmektedirE 1-3 farklı yollar bir sürü boyunca sinyalleri. Burada açıklanan plazma membranına Grb2 alımı izler basit bir mikroskop testtir. Bu yeşil floresan protein alt hücresel lokalizasyonu (GFP) etiketli bir uyarıcı 4-6 yanıt Grb2 değişiklikleri ölçen bir test uyarlanmıştır. Böyle aktive Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör olarak Grb2 bağlamak Plazma membran reseptörleri (EGFR) plazma cDNA ifadesi üzerine membran ve daha sonra hücreye endozomal bölmelere taşınmaya işe GFP-Grb2. Grb2 in vivo protein kompleksleri tespit etmek için bu teknik, Grb2 alt-hücre lokalizasyonu değişikliklere göre bir genom yüksek içeriğine ekran gerçekleştirmek için kullanılabilir. CDNA ifade klonlar, transfeksiyon ve görüntü elde etme hazırlanması aşağıda ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. , Maya-iki-hy olarak protein etkileşim ortakları belirlemek için kullanılan diğer genomik yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Yapışıklıklara, bu yöntem, bir basit-tabanlı tahlil mikroskobu ile etkileşim alt-hücresel yerinde, memeli hücrelerinde protein komplekslerinin görüntülenmesine izin verir. Dolayısıyla böyle bir yerelleştirme şekilleri gibi nitel özellikleri, hem de etkileşim nicel gücü gibi değerlendirilebilir.

Yetkili transmembran reseptörleri sinyal romanın tanımlanması için yüksek içerik tarama yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem büyük ölçekli otomasyon mükellef olup tanır hakkında öngörülerde<em&gt; In vivo</em&gt; Protein bağlama ve memeli hücrelerinde protein komplekslerinin alt-hücre lokalizasyonu.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Büyüme faktörü reseptörleri aracılığıyla gerçekleşen sinyal iletimi, hücrelerin proliferasyonu ve diferansiyasyonunu sürdürmeleri için gereklidir ve sıkı bir kontrol gerektirir. Sinyal...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, cDNA ekspresyon klonlaması ve yeşil floresan proteinle işaretlenmiş Grab two'daki değişimlerin gözlemlenmesi yoluyla grab two'nun etkileşim ortaklarını belirlemektir. Bu süreç, ikinci bir adım olarak öncelikle bakteriyel lizatlardan bir cDNA kütüphanesi hazırlanarak gerçekleştirilir. cDNA'lar, ilgi duyulan genlerle birlikte raporlayıcı konstrüktun ekspresyonuyla sonuçlanacak şekilde insan embriyonik böbrek hücrelerine transfekte edilir.Ardından, hücreler genelindeki Grb2 lokalizasyonundaki değişiklikleri görselleştirmek amacıyla transfekte edilmiş plakalar Opera mikroskobunda analiz edilir; floresan mikroskopiye dayalı olarak, GFP etiketli Grb2'nin epidermal büyüme faktörü reseptörü aracılığıyla endozomlara toplandığını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, iki hibrit sistem gibi mevcut yöntemlere kıyasla temel avantajı, Grb2 etkileşim ortaklarının, etkileşim ortaklarının subselüler dağılımını göz önünde bulunduran fizyolojik bir durumda tanımlanabilmesidir.Her ne kadar bu yöntem Grab two ile sinyal iletimini tanımlamak için kullanılabilse de, ilgilenilen diğer proteinler gibi farklı sistemlere de uygulanabilir. cDNA kütüphanesi, gliserol stokları içindeki tekil bakteriyel klonlar şeklinde sağlanmaktadır.Hudson Rapid pick light'ın seçici menüsündeki re ray komutunu kullanarak 96 kuyucuklu formatta, kaynak plaktan bakteriyel klonları seçin ve 96 derin kuyucuklu bir plaktaki 1,5 milliliters lb amp içerisine inoküle edin. Derin kuyucuklu plakları gaz geçirgen bir sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve bir çalkalayıcıda 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bakteri içeren derin kuyucuklu plakları 2000 RPM'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Masaüstü santrifüjde plaka adaptörleri kullanarak, bakteriyel peleti bozmadan kuyucuklardaki medyumu aspire edin. Ardından, Tecan Freedom Evo Otomasyon iş istasyonunun platformunu burada gösterildiği gibi konfigüre edin. Plazmit hazırlama solüsyonlarını bir ile beş arasındaki oluklara dağıtın ve platforma derin kuyucuklu bir plaka yerleştirin.Alucian çözeltisi içeren çok kuyucuklu bir tekneyi derin kuyucuklu plakanın yanına yerleştirin ve uçları uç raflarına yükleyin. Vakum manifoldunu monte edin. Plazmit bağlama plakası manifoldun içine, plazmit filtre plakası ise manifoldun üzerine yerleştirilir. Peletleri 250 µL çözelti bir ile yeniden süspande edin.Resus süspansiyon tamponu ekleyip pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın. Peletlerin tamamen resüspande edildiğinden emin olmak, bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. Eğer pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi peleti tamamen resüspande etmezse, bir çalkalayıcı kullanılabilir.Peletler tamamen süspanse edildikten sonra, lizis tamponuna 250 microliters çözelti ekleyerek bakterileri lize edin. Plakayı kapatın ve tam karışımı sağlamak için ters çevirin. İki dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.Ardından, 350 µL çözelti üç ekleyin. Nötralizasyon tamponu. Plaka ağzını kapatın ve üç kez altüst ederek karıştırın.Bakteri lizatlarını plazmit filtre plakalarına aktarın. Beş dakika boyunca vakum uygulayın. Filtre plağını çıkarın ve bağlama plağını manifoldun üzerine yerleştirin.Bir dakika boyunca vakum uygulayın. 500 µL ek yıkama tamponu ekleyin ve iki dakika boyunca vakum uygulayın. 900 µL yıkama tamponu çözeltisi 4 ekleyin ve iki dakika boyunca vakum uygulayın.Ardından, tekrar 900 microliters yıkama tamponu çözeltisi dört ekleyin ve 15 dakika boyunca vakum uygulayın. DNA toplama plakasını manifoldu içine yerleştirin. Bağlama plakasına 100 microliters Elucian tamponu ekleyin ve iki dakika boyunca inkübe edin.10 dakika boyunca vakum uygulayın. Son olarak, toplama plakasını çıkarın ve NanoDrop 8, 000 kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Bu prosedüre başlamak için bu yöntemle tipik olarak mikrolitre başına yaklaşık 100 nanogram verim elde edilmesi beklenebilir.Hec 2 9 3 hücreleri tripsinize edilip sayıldıktan sonra, bir otomatik dağıtıcı kullanarak Perkin Elmer View plakasının her kuyucuğuna 2 × 10⁴ hücre dağıtın. Hücreleri, transfeksiyon işlemi için 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.Otomatik sıvı işleyiciyi kullanarak, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna şu karışımı hazırlayın: 25 µL serumsuz ortam içerisinde 100 ng GFP plazmit DNA ve 100 ng CD NA. Ardından, her kuyucuğa 0,5 µL transfectin içeren 25 µL serumsuz ortam ekleyin ve 30 dakikalık zamanlayıcıyı başlatın.30 dakika sonra, cDNA transfeksiyon karışımından 50 µL'yi nazik bir dağıtma yöntemi kullanarak hücrelere aktarın. Hücreleri 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin.Görüntüleme işlemine başlamak için Opera yazılımını çalıştırın. Konfigürasyon sekmesini seçerek 20x objektifi ve doğru plaka tipini belirleyin. Farklı plaka tipleriyle odaklama yapabilmek için objektif üzerindeki halkanın (collar) doğru değere ayarlandığından emin olun.Ardından, mikroskop sekmesini seçin. Birinci pozlamayı fite 4 88 lazer, ikinci pozlamayı ise UV 365 lazer olarak tanımlayın. Her iki pozlamada da UV filtresini etkinleştirin ve pozlamayı atayın.Birinci pozlama için birinci kamerayı, ikinci pozlama için ise ikinci kamerayı ayarlayın. Pozlama sürelerini birinci pozlama için 800 milliseconds ve ikinci pozlama için 40 milliseconds olarak belirleyin.İkinci olarak, pozlama seçeneğini belirleyin ve odak yüksekliğini sıfır mikrona ayarlayın. Odaklama tamamlandığında odağı seçin. Birinci kamerayı pozlayın.Pozlama düzlemini optimize etmek için odak yüksekliğini ayarlayın ve yükseklik al düğmesine tıklayın. Pozlama parametrelerini kaydedin, ikinci pozlama için işlemi tekrarlayın. Deney tanımı sekmesini seçin, yerleşim ve alt yerleşim oluşturun.İlgili düzeni, pozlamayı, referans görüntüsünü, eğikliği, kırpma dosyasını ve alt düzeni sürükleyip bırakın. Deneyi kaydedin. Otomatik deney sekmesini seçin ve normal koşullar altında görüntüler edinin.Grab two hücrenin tamamına yayılmış durumdadır. Bir büyüme faktörü reseptörünün stimülasyonu üzerine, plazma membranına transloke olur ve ardından endozomlara internalize edilir. Bu şekildede, üst panel GFP grab two ile geçici olarak transfekte edilmiş CO M altı hücrelerini göstermektedir ve beklendiği üzere, floresan hücre geneline yayılmıştır.Ancak, GFP-Grab2 ve hücre yüzeyi reseptörü IT-EGFR ile geçici olarak transfekte edilen hücrelerde, alt panelde gösterildiği gibi Grab2 endozom benzeri yapılara yer değiştirir. Bu nedenle, genom çapında bir kütüphane uygulandığında, yeni Grab2 bağlayan hücre yüzeyi proteinlerinin tanımlanabileceği öngörülebilir. Bu yöntem, sadece hücre yüzeyi proteinlerinin tespiti ile sınırlı değildir.Örneğin, Grb2 aracılı endositozda rol oynayan GTPaz DYNAMIN 2, Grb2'nin translokasyonunu tetikler. Bu deneyde, GFP-Grb2 ve DNM2, HEK 293T hücrelerine birlikte transfekte edilmiştir. GFP-Grb2'nin endozom benzeri yapılara yer değiştirmesi, kırmızı daire içindeki hücrelerle gösterilmiştir.Bu prosedürün ardından, etkileşimin doğrudan mı yoksa dolaylı mı olduğu gibi daha ileri soruları yanıtlamak için immünopresipitasyon veya biyokimyasal analizler gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre altı protein etkileşimlerini tanımlamak için ekspresyon klonlamanın nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Keşfedin Grb2 protein etkileşim ortaklarını yüksek içerikli görüntüleme ile memeli hücrelerde. Bu yöntem, GFP etiketli Grb2'nin hücre içi lokalizasyon değişikliklerini görselleştirir ve genom çapında tarama olanağı sunar.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Daha fazla video keşfet