Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, lenfositleri fare üreme sisteminden izole etmektir. Bu, önce tüm genital kanalın çıkarılması ve lenfositlerin dokudan serbest bırakılması için dokuyu küçük parçalara ayırarak gerçekleştirilir. İnce kıyılmış doku, kollajenaz sekiz ile sindirilir ve doku 37 santigrat derecede kuvvetlice karıştırılır.

Manyetik bir karıştırma ile, lenfositler daha sonra çağrı başına gradyan ile izole edilir. Sonuç olarak, lenfositler akış sitometrisi ile karakterize edilebilir Bu tekniğin uygulanması, üreme hastalığının tanı ve tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem, genellikle dolaşımdaki sistemden izole edilen lenfositlerden farklı olan doku lenfositlerinin davranışlarını anlamamızı sağlar.

Bu yöntem üreme mukoza sistemi hakkında bilgi sağlasa da, bağırsak ve solunum mukoza sistemleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Dişi bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, düşük orta hatta bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın ve ardından cildi açın. Bağırsakları nazikçe bir kenara çekin, ucs'yi tanımlayın ve ardından tüm genital sistemi ucs'den vajinal açıklığa kadar izole edin ve çıkarın.

Genital sistemi bir Petri kabına yerleştirin. Tüm yolu uzunlamasına açmak için bir makas kullanın. Daha sonra dokuyu tam RPMI 10 ortamı olan bir Petri kabına aktarın.

Şimdi genital sistemi ince parçalar halinde kesin ve ardından parçaları tam RPMI 10 ve EDTA içeren bir şişeye aktarın. Şişeyi manyetik bir karışım üzerine yerleştirin ve son karıştırma süresinden sonra epitel hücrelerinden kurtulmak için dokuyu her seferinde oda sıcaklığında 15 dakika boyunca iki kez karıştırın, süpernatanı atın ve ardından doku parçalarını 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe dökün. EDTA kalıntısını eksiksiz bir ortamla yıkayın.

Şimdi filtrelenmiş doku parçalarını taze RPMI 10 ve kollajenaz içeren yeni bir şişeye aktarın ve bir saat sonra dokuyu kuvvetlice karıştırmak için manyetik karıştırma setinde parçaları 37 santigrat derecede sindirin, süpernatanı 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden taze 50 mililitrelik bir konik tüpe dökün ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun. Orijinal şişeye kollajenaz içeren taze RPMI 10 ekleyin ve her seferinde taze tam RPMI 10 ve kollajenaz kullanarak dokuyu iki kez daha karıştırın. Üçüncü sindirimden sonra, çözeltide görünür doku parçaları bulunmamalıdır.

Şimdi, üç sindirimden elde edilen süpernatanları bir araya getirin. Hücreleri 410 Gs ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün ve ardından süpernatanı atın. Hücre peletini çağrı başına %40'lık taze bir çözelti içinde tekrar askıya alarak başlayın.

Hücre süspansiyonunu çağrı başına% 40 ile bir gradyan tüpüne ekleyin ve ardından dikkatlice altlık ve eşit hacimde taze hazırlanmış. Çağrı başına %70. Şimdi gradyan örneklerini kopma ile oda sıcaklığında 20 dakika santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, perol gradyanları arasındaki arayüz katmanında lenfositleri dikkatlice hasat edin. Daha sonra geri kazanılan hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca RPMI bir ila üç ile yıkayın. Son olarak, destek atıldıktan sonra, lenfositleri istenen deneysel prosedüre göre uygun çözelti içinde tekrar askıya alın.

Bu nokta grafiği, intravajinal olarak enfekte olmuş bir klamidya idederm faresinin genital yolundan izole edilen bir lenfosit popülasyonunun bir örneğidir. Enfeksiyondan yedi gün sonra, tek hücreli süspansiyon CD üç pozitif lenfosit üzerine bağlandı ve geliştirildikten sonra CD dört ve CD sekiz eksprese eden hücreler için analiz edildi. Bu teknik, araştırmacının üreme lenfosit fonksiyonunu ve insan hastalıklarını taklit eden virüs fare hastalığı modelindeki hücre özelliklerini keşfetmesinin yolunu açtı.