Name: Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Öğrenin fare üreme sisteminden lenfosit izolasyonunu enzim sindirimi ve Percoll gradyanı kullanarak. Bu yöntem, doku lenfosit davranışını anlamak ve üreme hastalıkları araştırmalarına katkı sağlamak için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz finansman hibe R01-AI026328 (KAK) ve R01-AI079004 (KAK) için NIH teşekkür.

1. Genital sistem Kaldırma <ol><li> Onaylanan yönergeleri kullanarak fare Euthanize. Düşük orta hat kesi olun ve cilt geri çekin. </li><li> Oviduct vajinal açılış, bütün genital ayırın ve çıkarın. </li><li> Makas ile uzunlamasına tüm yolu açın. </li><li> Tam RPMI-10/EDTA ile bir petri tabağına ince parçalar (&lt;1 mm kadar) (aşağıdaki formül bakınız) içine ince cerrahi makas ile genital kesin ve ayarlamak için bir manyetik karıştırıcı üzerinde, oda sıcaklığında 125 ml&#39;lik şişe içerisinde doku ilave edin 15 dk. Bu prosedür iki kez tekrarlandı ve daha sonra epitel ve diğer artıkları içeren süpernatan, göz ardı edilir. </li><li> Bir hücre süzgeç (40μm) yoluyla balonun içeriği dökün. Tam orta EDTA ile kalıntı yıkayın. Isı ile inaktive edilmiş 500 ml RPMI (Gibco),% 10 fetal sığır serumu (FBS), 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml 1 M HEPES: Tam RPMI/10. Komple RPMI-10/EDTA: 5 mikron E ile% 10 RPMI (yukarıdaki gibi),DTA </li></ol> 2. Genital doku hazmetmek <ol><li> 20 ml taze RPMI-10/collagenase ile yeni şişesi (aşağıdaki tarife bakınız) için doku parçaları aktarın ve şiddetle doku karıştırmaya ayarlanmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde 1 saat süreyle 37 ° C de doku sindirmek. Komple RPMI-10/collagenase: Sağ kullanımdan önce, sulandırmak kollajenaz tip VIII (Sigma; -20 mağaza ° C, ya da üreticinin talimatlarına göre.), 450-500U/ml bir nihai konsantrasyonu tam RPMI/10 içine ekleyin. </li><li> Birinci sindirim sonra, 100 mikron hücre süzgecinden süpernatan toplamak buz üzerinde hücreleri tutmak. </li><li> Yeni bir şişeye sindirilmemiş doku aktarın ve 3 ayrı sindirimler toplam taze tam RPMI-10/collagenase kullanarak adım 2.1 iki kez daha tekrarlayın. Bu noktada, görünür bir doku parçaları çözelti içinde olması gerekir. </li><li> Havuz her bir örneklem araya süpernatanlar ve 100 mikron hücre süzgecinden toplamak. C Spinaşağı arşın. Hücre peletleri Percoll gradyanları kullanılarak ayrılır. </li></ol> 3. Percoll gradyanlar kullanarak genital sistem hücreleri ayırmak <ol><li> Kullanımdan önce Percoll her bir konsantrasyonu hazırlanması: <ul><li> 100% izotonik Percoll: mix 9:01 stok Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. HCL ile 7.4 pH bunu. </li><li> % 40 Percoll çözelti: karışım% 100 izotonik Percoll ve komple RPMI 60 ml, 40 ml. </li><li> % 70 Percoll çözelti: komple RPMI 30 ml ile karışım% 100 izotonik Percoll 70 ml. </li></ul></li><li> 40% Percoll çözümleri 6. adımdan itibaren her hücre pelletini tekrar. % 70 Percoll eşit hacimde bir gradyanlar yapmak için kullanılır. Degrade tüpleri kurmanın iki yolu vardır: <ol><li> Under-katman: sonra dikkatlice altında katman% 70 Percoll, önce bir degrade tüp içine 40% Percoll ile hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> Aşırı tabaka: İlk tüp içine 70% Percoll ekleyin, sonra dikkatlice ve yavaşça üzerindeki hücreler içeren 40% Percoll yüklenemeditop. </li></ol></li><li> Gradyan örnekleri fren kapalı ile 20 dakika süre ile, 900 x g&#39;de @, oda sıcaklığında santrifüje edilir. </li><li> Lenfositler% 40 ve% 70 Percoll katman arasındaki ara tabaka olacaktır. Dikkatle, arabirim katmanı hasat RPMI 1:3 yıkayın ve 740 xg&#39;de aşağı spin. Lenfosit hücre pelet olmak ve kullanım için hazır olacaktır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Fare genital ve akış sitometrisi (FACS) analizi ile lenfosit izolasyon bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Genital sistem 7 gün sonra enfeksiyon bulaşmış intravajinal fare Chlamydia muridarum çıkarıldı. İki genital yolları FACS tarafından fonksiyonel ve fenotip muayene için yeterli lenfosit için birlikte birleştirildi. Dissected dokular yukarıda belirtildiği gibi sindirim ve izolasyon adımlar ile işleme tabi tutulmuştur. Tek bir hücre süspansiyonu çeşitli florokrom-konjuge için boyandıfare CD3, CD4 ve CD8 karşı monoklonal antikorlar. Şekil 1 CD3 pozitif T lenfositler kapılanan CD8 pozitif T hücreleri karşı CD4 pozitif T hücrelerinin bir nokta-arsa sunumu gösterir. Bizim prosedürü fare modeli değişik hastalıkların çeşitli immün hücre fonksiyonel ve fenotipik özelliklerini belirlemek için farklı hastalık modellerinin genital yolları izole lenfositlerin inceleyebilirsiniz. Bunlar, örneğin dendritik hücreler, nötrofil, makrofajlar NK, NKT, T hücreleri (Ag-spesifik T-hücreleri), B hücreleri gibi 3-10 kadar çeşitli bağışıklık hücreleri içerir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> Şekil 1. Lenfositler Burada sunulan yöntem kullanarak, Klamidya muridarum ile enfekte farelerde genital yolları izole edilmiştir. Tam bir ayırma işlemi sonrası, lenfositler florokrom-konjuge CD3, CD4 ve CD8 ile boyandı. Kadranda veriler, CD3 + lenfosit kapılanan vardıCD4 + göstererek karşı CD8 + ve Geçitli hücrelerin yüzdesi.

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
<li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li>
<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
<li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li>
<li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li>
<li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokolde, fare genital yolları lenfosit hazırlamak için nasıl gösterilir ve kolayca hakim. Bu sürecin en kritik nokta buz üzerinde hücreleri tutarak hücre canlılığını muhafaza etmektir. Bu yöntem hücre verimi beceri, fare enfeksiyon durumu (saf ya da enfeksiyon sonrası gün), patojen (bakteriyel, viral, fungal) ve fare üreme sisteminin irdelenmesi bölümünde (yumurtalık, rahim, işleme, tekniği bağlıdır vajinal segment veya tüm genital sistem). Bizim grup ve diğerleri 5-7 fare genital farklı lenfosit toplul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Sigma Yaşam Bilimleri </td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare Bio-Bilimleri </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Yaşam Teknolojileri tarafından Gibco </td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

fare genital sistemlerinin mukozanin gelen lenfosit İzolasyonu

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

, Gastrointestinal ürogenital ve solunum yolları, bu tür virüs ve bakteri gibi patojenlerin 1 için giriş portalları sağlamak dahil Mukozal yüzeyler. Mucosae gibi bağırsak Peyers yamalar ve solunum yollarında nazal ilişkili lenforetiküler doku gibi patojenlere karşı bağışıklık oluşturmak için de konak endüktif sitelerdir. Bu benzersiz özellik, konak savunma sisteminin önemli bir oyuncu olarak mukozal bağışıklık getiriyor. Birçok çalışma, gastrointestinal ve solunum mukoza alanlarında odaklanmıştır. Ancak, üreme mukozal siteleri küçük bir araştırma olmuştur. Genital mukoza bakteriyel ve viral enfeksiyonlar dahil olmak üzere cinsel yolla bulaşan hastalıklar (STD) için primer enfeksiyon sitedir. CYBH, bugün dünyanın karşı karşıya olduğu en önemli sağlık sorunlarından biridir. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 19 milyon yeni enfeksiyon her yıl olduğunu tahmin ediyor. AzizDs her yıl 2 ABD sağlık sistemi 17000000000 $ maliyeti ve acil ve yaşam boyu sağlık sonuçlarının maliyet bireyler daha. Bu meydan yüzleşmek için, üreme mukozal bağışıklık daha büyük bir anlayış gerekli ve lenfositler izole bu çalışmaların önemli bir bileşenidir. Burada, tekrarlanabilir diğer türlere adaptasyon için modifiye edilebilir immünolojik çalışmalar için fare dişi genital yollarında gelen lenfositler izole etmek için bir yöntem mevcut. Aşağıda tarif edilen yöntem, bir fare dayanmaktadır.

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de uyarlanabilmektedir

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Gastrointestinal, ürogenital ve solunum yolları dahil olmak üzere mukozal yüzeyler, virüsler ve ... gibi patojenler için giriş kapıları sağlar.

Bu prosedürün genel amacı, fare üreme sisteminden lenfositleri izole etmektir. Bu işlem, önce tüm genital sistemin çıkarılması ve lenfositlerin dokudan serbest kalması için dokunun küçük parçalar halinde kıyılmasıyla gerçekleştirilir. İnce kıyılmış doku, kolajenaz sekiz ile sindirilir ve doku 37 °C'de şiddetli şekilde karıştırılır.Manyetik karıştırma ile lenfositler daha sonra percoll gradyanı ile izole edilir. Son olarak, lenfositler akış sitometrisi ile karakterize edilebilir. Bu tekniğin uygulamaları, üreme sistemi hastalıklarının teşhis ve tedavisine kadar genişlemektedir. Bu yöntem, genellikle dolaşım sisteminden izole edilen lenfositlerden farklılık gösteren doku lenfositlerinin davranışını anlamamıza olanak tanır.Bu yöntem reprodüktif mukoza sistemi hakkında bilgi sağlasa da, intestinal ve respiratuar mukoza sistemleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Dişi bir fareyi ötanize ettikten sonra, düşük orta hat kesisi yapmak için cerrahi makas kullanın ve ardından cildi açın. Bağırsakları nazikçe yana itin, ucs'yi tanımlayın ve ardından tüm genital kanalı ucs'den vajinal açıklığa kadar izole edip çıkarın.Genital kanalı bir Petri kabına yerleştirin. Tüm kanalı boylamsal olar

isolation-of-lymphocytes-from-mouse-genital-tract-mucosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Miltenyi MAC kiti kullanılarak lenfositlerin İzolasyon tüm lenfoid doku homojenatlarında hücreleri arındırmak için güvenilir bir yol. Miltenyi sistemini kullanarak saflaştırılmış Hücreler genellikle ≥% 96 saf. Burada, CD4 + T hücreleri, Miltenyi tarafından sunulan birçok kitleri biri izole etmek için atılan adımları göstermektedir.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Bu videoda, hasat edilmiş bir fare Peyer'in yamasından lenfositlerin izolasyonunu gösteriyoruz. İzole edilen lenfositler daha fazla analiz için kullanılabilir.

Bir Fare Peyer Yamasından Lenfositlerin İzolasyonu

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Öğrenin fare üreme sisteminden lenfosit izolasyonunu enzim sindirimi ve Percoll gradyanı kullanarak. Bu yöntem, doku lenfosit davranışını anlamak ve üreme hastalıkları araştırmalarına katkı sağlamak için uygundur.

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Daha fazla video keşfet