Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama

Bu deneysel yaklaşım, BRDU inklüzyonunu floresan yerinde hibritleme ile birleştirir. Memeli kromozomlarının replikasyon zamanlamasını nicel olarak analiz etmek için, önce canlı hücrelere BRDU inklüzyonu gerçekleştirilir ve metafaz kromozomları toplanır.

Ardından, tekil replike kromozomları tanımlamak için ardışık BRDU antikor boyaması ile kombine edilmiş DNA FISH uygulayın. Daha sonra, bireysel mitotik figürlerdeki FISH sinyallerini ve BRDU inklüzyonunu görüntülemek için foto-mikroskopi kullanın. CytoVision yazılımını kullanarak, izole edilen her kromozom üzerindeki BRDU veya DPI sinyallerinin temsil ettiği piksellerin alanını ve yoğunluğunu hesaplayın.

Sonuçlar, yeniden düzenlenmiş münferit kromozomlardaki ve hololarındaki BRDU inklüzyonunu nicelendirebilir ve karşılaştırabilir. Burada açıklanan yöntem münferit hücreleri değerlendirdiği için, yakın zamanda geliştirilen yüksek kapasiteli mikro-dizi ve DNA sekanslama protokollerine kıyasla, bir popülasyondaki hücrelerin yalnızca bir kısmında mevcut olan kromozomal yeniden düzenlemelerdeki replikasyon ve zamanlama değişikliklerini tespit etme yeteneğine sahiptir. Bu yöntem, aynı hücre içinde bulunan homolog kromozomların doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.

Ayrıca, kromozom replikasyonunu etkileyen kromozom yeniden düzenlemelerini kesin bir şekilde tanımlama yeteneğine sahiptir. Prosedürü gösteren tüm kromozomların zamanlaması, laboratuvarımdaki bir araştırma görevlisi olan Leslie Smith tarafından gerçekleştirilecektir. Hücreleri 150 milimetrelik bir doku kültürü kabına yaklaşık %70 konfluensle ekin ve uygun süre boyunca 24 saat boyunca bir hücre inkübatörüne yerleştirin.

Hasat öncesi noktalar. Besiyerini, mililitre başına 10 mikrogram BRDU içeren taze tamamlanmış besiyeri ile yenileyin. Hücrelerin BRDU içeren besiyerinde kültüre edildiği süre, hücre tipine ve türe göre değişiklik gösterecektir.

Genellikle G2 evresi iki ile beş saat arasındadır. Plakadan kültür ortamını uzaklaştırın ve 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne 10 mL saklayın. Hücreleri 10 mL PBS ile durulayın ve kalan PBS'yi vakum aspirasyonu ile uzaklaştırın.

Ardından beş mililitre %0,25 trypsin ekleyin ve hücreler plakadan ayrılana kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Hücreleri hasat edin ve süspansiyonu ayrılmış olan 10 mililitre besiyerine aktarın. Hücreleri santrifüj ile pelitleyin ve besiyerinin 0,5 mililitresi hariç geri kalanını aspire edin.

Şimdi, hücreleri pipetleme yoluyla iyice resüspande edin; hücrelerin ozmotik olarak şişmesi için 37 °C'ye ısıtılmış 75 mM potasyum klorürden üç damla ekleyin ve hücre süspansiyonunu pipetleyerek karıştırın. Ardından, 0,5 mL daha hipotonik çözelti ekleyin. Hipotonik çözelti toplam hacmini beş mL'ye tamamlayın ve pipetleme ile karıştırın.

Hücre süspansiyonunu, hücre tipine bağlı olarak 37 °C'de 20 ila 45 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin süspansiyon halinde kalması için tüpleri eğik bir açıyla inkübe edin. Ardından 400 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantın 0,5 milimetresi hariç geri kalanını aspire edin ve hücre peletini nazikçe yeniden süspande etmek için bir pastir pipeti kullanın. Ozmotik olarak şişmiş hücreler bu aşamada hassas olacaktır, bu nedenle sitoplazmik membranların bozulmamasına dikkat edilmelidir. Ardından, üç damla karnoy fiksatif ekleyin ve nazikçe karıştırın.

Ek olarak 0,5 mililitre fiksatör ekledikten sonra, fiksatör hacmini beş mililitreye tamamlayın ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için pipetleyin. Bu fikse edilmiş hücreler, -20 °C'de karanlıkta birkaç ay boyunca saklanabilir. Fikse edilmiş hücreleri santrifüjle toplayın, fiksatörü aspire edin ve peleti, buz üzerinde soğuk tutulan bir mikroskop altında 10 hacim fiksatör içerisinde yeniden süspande edin.

Lamı yaklaşık 45 derecelik bir açıyla eğin. Hücre süspansiyonunu yaymak için damla damla ekleyin. Lamı tespit çözeltisi ile doldurun ve fazlalığı süzün.

Ardından, hava ile kuruması için lamı kağıt havlu üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Bir ters mikroskop kullanarak örnekleri mitotik yayılımlar açısından değerlendirin. Her lama 2 µL 10 µg/mL RNase A içeren 2X SSC ekleyin ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Oda sıcaklığında, pH 7.0'da iki XSSC ile üç kez, her biri üç dakika sürecek şekilde yıkama yapın. Ardından, numuneleri oda sıcaklığında üçer dakikalık etanol serileriyleyerekye dehidrate edin. Numuneleri oda sıcaklığında havada kuruttuktan sonra soğutulmuş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Dört mikrogram işaretli nükleotid DNA substratı, 10 X NIC translasyon tamponu, DNTP karışımı ve NIC translasyon enzimi ekleyin. Reaksiyonu 16 °C'de gece boyunca inkübe edin, reaksiyonu durdurmak için 70 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından beş dakika boyunca buz üzerinde soğutun.

DNA'yı etanol ile çöktürmek için 48 µL 3 M sodyum asetat, 160 µL 0.25 µg/µL cot-1 DNA ve 1.2 mL %100 etanol ekleyin. DNA'nın çökelmesi için numuneyi -80 °C'de 10 dakika ile bir gece arasında saklayın; santrifüjle çöktürün ve peleti %70 etanol ile yıkayın. Hava ile kurutulmuş DNA probunu, back-SEP eş zamanlı hibridizasyonu için işaretlenmiş back DNA'nın final konsantrasyonu 100 ng/µL olacak şekilde 40 µL çift distile su içinde yeniden süspande edin. Eşlik eden makalede detaylandırıldığı üzere, cot-1 DNA içeren iki ayrı prob kokteyli hazırlayın.

Prob kokteyllerini 75 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin. Ardından, cot 1D NA'nın tekrarlayan dizilere bağlanması için 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Şimdi, arka probu S probu ile numune başına 25 µL olacak şekilde üçe iki oranında birleştirin.

Numuneleri denatüre etmek için lamları kullanın. Lamları 72 °C'de %70 formamid içeren 2X SSC içinde üç dakika boyunca inkübe edin. Numuneleri derhal, 4 °C'de üçer dakikalık sürelerle etanol serisi üzerinden geçirerek dehidrate edin.

Prob hazırlığının tamamlanmasından önce her bir örneği oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca hava ile kurutun. Lamları 45 °C'lik bir lam ısıtıcıda dengeleyin. Ardından 25 µL back S prob karışımı ekleyin.

Hibritleme adımı için her slayta nazikçe bir lamelle kapatıcı yerleştirin ve tüm kenarlarını kauçuk çimento ile mühürleyin. Numuneleri nemlendirilmiş bir odacıkta, 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. 38 ila 40 °C'de, %50 IDE içeren 2X SSC pH 7.0 içerisinde, her biri üç dakika süren üç adet hibritleme sonrası yıkama işlemi gerçekleştirin.

Yıkama işlemlerinin optimal sıcaklığı kullanılan proba bağlıdır. Yüksek arka plan hibridizasyonu varsa yıkama sıcaklığını artırın. Aksine, prob sinyali zayıfsa ve arka plan yoksa yıkama sıcaklığını düşürün.

Oda sıcaklığında üç dakika boyunca PN tamponu ile bir kez yıkama işlemi gerçekleştirin. BRDU tespiti için, her slayda 200 µL PNM bloklama tamponu ekleyin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve slaytlardaki fazla sıvıyı bir kağıt havlu üzerinde süzün.

Ardından 100 µL 50 µg/mL anti-BRDU-FITC konjuge antikor ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında PN tamponu ile üç kez üçer dakikalık yıkama yapın. Her lam üzerindeki fazla PN tamponunu uzaklaştırın.

Ardından 20 µL dappy Antifa montaj solüsyonu ekleyin. Lamı bir kağıt havlu ile kapatın ve hava kabarcıklarını ve fazla montaj solüsyonunu dışarı itmek için lamellenin üzerine bastırın. Görüntüleri, bir CCD kameraya bağlı floresan mikroskobu ile yakalayın.

100 x objektif, otomatik filtre tekerleği ve CytoVision yazılımını kullanarak; FITC filtresi ile BrdU'yu, Cy3 veya Texas Red filtresi ile kromozom boyaları ve sentromer problarını görüntüleyin. Ayrıca çekirdek boyaması için DAPI filtresi kullanın. CytoVision yazılımında, ilgilenilen bireysel kromozomları BAC probe'ları veya kromozoma özgü boyama probları ile tanımlayın.

İlgilenilen her bir kromozomu metafaz yayılımından bütün olarak kesin. DPI ve FITZY kromozom görüntülerini yeni bir pencereye kopyalayıp yapıştırın. Araç menüsündeki grafik simgesini seçin; bu simge, her bir bireysel kromozom boyunca hem Fitz hem de dappy boyamasının alanını ve yoğunluğunu temsil eden bir grafiğin oluşturulmasını sağlar.

Bu işlem, kromozomun kısa kolundan uzun koluna kadar uzunluğu boyunca bir hat çizilerek gerçekleştirilir. Araç menüsünden veri simgesini seçin ve ZI ile dpi için hesaplanan alan ve yoğunluğu gösteren bir tablo oluşturun. Ardından, ilgili kromozomlar için ZI ve DPI sinyallerini seçin.

Ardından tablo simgesi üzerindeki yoğunluk (intensity) ve alan (area) düğmelerine tıklayın. Yazılım, her bir sinyal için inç kare başına piksel cinsinden sayısal bir ölçüm oluşturur. Sonrasında, her bir kromozomun ortalama piksel yoğunluğu, bu pikseller tarafından kaplanan alanla çarpılır.

Kromozomların en son replike olan bölgelerinin görselleştirilmesi için toplam piksel sayısını elde etmek amacıyla, kromozomların aktif olarak replike olan bölgeleri için BRDU inklorasyonunun bant paternini değerlendirin. Ardından, BRDU bantlama paternindeki farklılıklara dayanarak kromozom çiftleri arasındaki replikasyon zamanlaması farklarını hesaplayın. Memeli hücrelerindeki kromozomlar, S-fazının başında erken ve sonunda geç replikasyonun gerçekleştiği zamansal bir programa göre replike olurlar.

Memeli hücrelerde tipik bir S fazı sekiz ila 10 saat sürer ve G2 tipik olarak iki ila beş saattir. Bu deneysel sistemde, bu hücrelerin içerdiği 6q16.1 bölgesinde yer alan insan ASAR6 geninin delesyonunu etiketlemek amacıyla kromozomların replike olan son kısımlarını işaretlemek için artan sürelerde BRDU eklenir. Beş saatlik BRDU uygulamasının ardından mitotik hücreler toplanmış ve BRDU inkorporasyonu ile kromozom 6 boyama probu kullanılarak floresan in situ hibridizasyon için işlenmiştir; iki kromozom 6, üç floresan etiket sergilemektedir.

BRDU bantlama paternindeki belirgin fark, kromozom altılarından birinin replikasyon zamanlamasındaki iki saatten fazla olan gecikme ile uyumludur. Cyto vision yazılımı, asenkron replikasyona işaret eden iki kromozom altısı üzerindeki DPI ve BRDU için farklı sinyal yoğunluğu profillerini göstermektedir. Ayrıca, DPI boyamasının benzer bir analizi ile karşılaştırıldığında, toplam BRDU inklüzyon miktarında önemli bir fark bulunmaktadır.

İnsan AR six geni içeren bir geri probun kullanımı, bu hücrede uzun kolunda delesyon bulunan tek kromozom 6'yı belirginleştirmektedir. İlginç bir şekilde, non-ED kromozom 6'ya kıyasla daha yoğun bir BRDU inklüzyonu ve daha geniş bir BRDU inklüzyonu bantlaşma paterni görülmektedir. İki kromozom 6 arasındaki replikasyon zamanlaması farkının kantifikasyonu için yedi farklı hücreden elde edilen mitotik yayılımlar işlenmiştir.

BRDU seviyeleri, delesyonlu ve non-ED kromozom altıların toplam piksel değerleri arasında iki kattan fazla bir fark göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik üç gün içinde uygun şekilde gerçekleştirilebilir. Artık aynı hücre içinde bulunan homolog kromozomların replikasyonunun ve zamanlamasının nasıl ölçüleceğini ve replikasyondaki değişikliklerle ilişkili kromozomal yeniden düzenlemelerin nasıl kesin olarak tanımlanacağını iyi anladığınızı umuyoruz.

Tüm kromozomların zamanlaması.