Yerli, Fibröz Uzun Aralığı ve Bölümlere Uzun Aralığı Kollajen in vitro sentezi olarak

Bu prosedürlerin genel amacı, kollajen monomerinin tekrarlanabilir bir şekilde nasıl kullanılabileceğini göstermek, üç farklı türde yüksek dereceli kollajen yapısı yapmaktır. Doğal kollajen, kollajen monomer çözeltisinin pH'ının yükseltilmesiyle, lifli uzun aralıklarla yapılır. Kolajen, kolajen monomerinin alfa bir asit glikoproteini ve segmental uzun aralık ile birleştirilmesiyle yapılır.

Kolajen, kolajen monomerinin bir TP ile karıştırılmasıyla yapılır. Sonuç olarak, atomik kuvvet mikroskobu, oluşan üç farklı kollajen yapısını karakterize etmek için kullanılır. Bu protokollerin daha önce yayınlanmış prosedürlere göre en büyük avantajı, istenen kollajen yapılarını oluşturmada daha basit ve çok tekrarlanabilir olmalarıdır. Bu protokoller, son 10 yılda laboratuvarımızda geliştirilmiştir ve prosedürü gösteren bir başlangıç materyali olarak güvenilir bir ticari kollajen monomer kaynağından yararlanarak, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Calvin Chang olacaktır.

Bir ısı bloğunu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtarak başlayın. Daha sonra, tampon çözeltisini bir mikro santrifüj tüpünde, mililitre başına üç miligramlık bir kollajen monomer çözeltisinin dört mikrolitresinde hazırlayın ve iyice karıştırın. Elde edilen çözelti berrak ve renksiz olmalıdır.

Doğal kollajen fibrillerini oluşturmak için karışımı 37 derece Santigrat derece ön ısıtma ısı bloğuna üç ila dört saat boyunca yerleştirin. Nihai çözelti hafif bulanık olmalı ve lifli uzun aralıklı kollajen hazırlamak için esas olarak doğal kollajen fibrilleri içerecektir. Birincisi, mililitre başına üç miligramlık bir kollajen monomer çözeltisinin bir mililitresi, 12 ila 14 kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesme zarına.

Daha sonra 400 mililitre suya karşı diyalize girin ve suyu 24 saatlik bir süre içinde dört kez değiştirin. Daha sonra, diyalize edilmiş kollajen monomerinin 20 mikrolitresini 20 mikrolitre ultra saf su ve mililitre başına 20 mikrolitre üç miligram ile birleştirin. Sudaki alfa bir asit glikoproteini bir mikro santrifüj tüpüne karıştırın ve karıştırın.

Fibröz akciğer aralığı kollajeninin 30 dakikalık bir süre boyunca oda sıcaklığında toplanmasına izin verin. Bu süre zarfında, çözüm, hasta zihinsel uzun aralıklar oluşturmak için açıktan bulutluya gidecektir. Kollajen. İlk olarak, asidik tamponu bir mikro santrifüj tüpünde hazırlayın.

Tampon çözeltisine mililitre başına 40 mikrolitre 10 miligram, su içinde bir TP ekleyin ve karıştırın. Son olarak, mililitre başına üç miligramlık bir kollajen monomer çözeltisi olan 0.01 mikrolitre ekleyin. Normal hidroklorik asit ve birleştirmek için karıştırın.

Segmental uzun aralıklı kollajenin iki saatlik bir süre boyunca oda sıcaklığında toplanmasına izin verin. Nihai çözüm, tarif edilen diğer iki kollajen formunun aksine, bu preparatta net olacaktır. Atomik kuvvet mikroskobu veya FM için temiz bir düz yüzey elde etmek için, MICA'dan yapılmış bir A FM alt tabakasına bir parça yapışkan bant yapıştırın ve en az bir katmanı soyun.

Tüm katmanın kaldırıldığını onaylamak için bandı kontrol edin. Uygun bir yüzey elde edildikten sonra, mika substratına 20 mikrolitre kollajen FI solüsyonu uygulayın ve beş dakika bekletin. Beş dakika sonra, MICA® substratının kenarına su ekleyerek ve numune boyunca 10 ila 15 saniye akmasına izin vererek fazla fibrilleri durulayın.

Numune alanına doğrudan su eklemeyin. Ardından, alt tabakanın bir kenarından hafif bir nitrojen gazı akışı kullanarak yüzeyi kurutun. Akışı numunenin merkezine doğrultmamaya dikkat edin.

Numuneyi optik mikroskop altında 200 x büyütmede, doğal ve lifli uzun aralıkta kontrol edin. Kollajen örnekleri fibro kümeleri gösterirken, segmental uzun aralıklı kollajen görünmez. Farklı kollajenin benzersiz özellikleri en iyi şekilde gözlenir.

Bir A FM kullanarak, ilk 100 x 100 mikrometre kare tarama yapın ve ardından 10 x 10 mikrometre kare ve son olarak iki x iki mikrometre kare tarama boyutlarına yakınlaştırın. Doğal ve fibröz akciğer aralığının bantlama periyodikliğini gözlemlemek. Kolajen, segmental akciğer aralıklı kolajenin daha ince özellikleriydi.

Doğal kollajen filer için, lifli uzun aralık ve segmental uzun aralık için bir silikon bir FM probu kullanarak atomik kuvvet mikroskobunu aralıklı temas modunda çalıştırın. Kollajen fis, atomik kuvvet mikroskobunu temas modunda çalıştırır ve en iyi sonuçlar için silikon nitrit a FM probları kullanır. İlk taramaların temsili olduğunu doğrulamak için kollajen numunesi üzerinde en az iki başka bölgeyi kontrol edin.

Bir FM'nin yüksek uzamsal çözünürlüğü, bu videoda açıklanan farklı kollajen preparatlarını karakterize etmek için idealdir. Doğal kollajen liflerini, fibröz uzun aralıklı kollajeni ve segmental uzun aralıklı kollajen optik mikroskobu gibi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu tekniklerini kolayca ayırt eder, ancak bu yöntemlerde hazırlanan üç tip kollajeni birbirinden ayıran nanometre ölçeği özelliklerini gösteremez. Tipik bir örnekte, bir FM tarafından rastgele 100 x 100 mikrometre kare taraması, beş ila 50 mikron uzunluğunda ayrı ayrı ayrılmış en az birkaç fibril gösterir.

Kollajen fisleri bu aşamada kolayca tanımlanabilir, 10 mikrometre kare tarama boyutuna katılmak için yakınlaştırma tüm fislerin bantlı olduğunu gösterir. Bantlama periyodikliğini doğru bir şekilde ölçmek için, ikiye iki mikrometre kare tarama boyutuna yakınlaştırmak en iyisidir. 10 x 10 mikrometre kare tarama boyutuna yakınlaştırma, tüm fibrillerin bantlı olduğunu gösterir.

Bantlama periyodikliğini doğru bir şekilde ölçmek için, ikiye iki mikrometre kare tarama boyutuna yakınlaştırmak en iyisidir. Kollajen, uzun aralıklı kollajen prosedürüne göre hazırlandığında bantlama süresi artar ve lif uzunluğu boyunca 270 nanometre tekrarı üretir. Tipik bir örnekte, bir FM tarafından rastgele 100 x 100 mikrometre kare taraması en az birkaç fibril gösterir.

Bantlama periyodikliği, 10 x 10 mikrometre kare taramaya yakınlaştırılarak görülebilir ve iki x iki mikrometre kare tarama ile kolayca ölçülebilir. Son olarak, segmental uzun aralıklı kollajen hiç lif oluşturmaz, ancak tek tek segmentler oluşturur. Tipik bir örnekte, bir FM tarafından rastgele 100 x 100 mikrometre kare taraması birçok ayrı nokta gösterir.

Daha yakın bir 10 x 10 mikrometre kare tarama, birkaç SLS kristalitini gösterir ve iki x iki mikrometre kare tarama, bir SLS kristal ışığının daha ince yapısını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, ticari olarak temin edilebilen kolajen monomerinden tek tip olgun doğal FLS ve SLS kolajen yapılarının nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Kolajen, büyüyen hücreler ve dokular için bir substrat veya iskele olarak yararlı olan biyouyumlu bir malzemedir.

Bu prosedür, bu ve diğer uygulamalar için arzu edilen kollajen yapılarıyla başlamanızı sağlayacaktır.