Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme Arabidopsis Kotiledon Epidermis

Aşağıdaki deneyin amacı, hücresel düzeyde tohum çimlenmesinden sonra epidermal gelişimin erken olaylarını görselleştirmektir. Bu, ikinci adım olarak kosinin net bir şekilde görülmesini sağlamak için önce tohum kabuğunun çıkarılmasıyla elde edilir. Kosin, onları hareketsiz hale getiren ve bir sonraki gelişimlerini destekleyen bir agar ortamı tabakasının altına monte edilir: Epidermal hücrelerin in vivo olarak büyümesini ve bölünmesini gözlemlemek için birkaç gün boyunca hızlandırılmış görüntüleme yapılır.

Görünür floresansa dayalı dinamik gen ekspresyonu ve protein lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edildi. Bu tekniğin, Gus boyamanın hareketsiz görüntüleri veya GFP füzyonları gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hücre bölünmesi ve farklılaşması sırasında proteinlerin dinamik hareketini göstermesidir. Bu deney için Arabidopsis tohumları, 1.7 mililitrelik bir tüpte %33 ev tipi çamaşır suyu ve %0.1 Triton X 100 yer tohumlarından oluşan bir tohum sterilizasyon solüsyonunda sterilize edilir ve bir mililitre sterilizasyon solüsyonu uygulanır, 15 dakika boyunca bir mutatör üzerinde inkübe edilir.

Steril bir kapüşonda, tohumları geride bırakarak sterilizasyon solüsyonunu tüpten çıkarmak için bir pipet kullanın. Bir mililitre steril su ile durulayın. Dördüncü durulamadan sonra dört kez tekrarlayın.

İki veya daha fazla gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hazneyi hazırlamak için, slayt ortamını 20 mililitre% 0.5 bact çözeltisini, 200 mililitrelik bir şişede su içinde agar ve çözünene kadar mikrodalgada karıştırın. Çözeltiyi kaynatırken dikkatli olun.

Çözümü yaklaşık 60 santigrat dereceye çağırın. Çok sıcak veya çok hızlı uygulanan bir çözelti, yapıştırıcıyı eritebilir veya hazne sürgüsünün camını çatlatabilir. Agar çözeltisi yeterince soğuduğunda, bir pipetle bir mililitre toplayın ve hemen hazne sürgüsünün içindeki kapak camına yavaşça uygulayın.

İkinci bir mililitre agar çözeltisi ekleyin. Agar Media artık hazne sürgüsünün altını tamamen kaplamalıdır. Bu minimal ortam, nemi koruyarak ve gaz difüzyonuna izin vererek dört ila beş gün boyunca depolanmış besinleri içeren bir bitki oleininde gelişmeyi desteklemek için yeterlidir.

Hazne tezgah üzerinde kapalıyken slaydı çağırın. Bu işleme başlamak için, steril tohum tüpünü dört santigrat derece depodan çıkarın. Diseksiyon mikroskobu tablasına bir kağıt mendil yerleştirin, suyla ıslatın ve pürüzsüz bir yüzey oluşturacak şekilde ayarlayın.

Doku, diseksiyon sırasında tohumları stabilize etmek için kullanılır. Tüpten 20 ila 30 tohumu doku üzerine pipetleyin ve bunları diseksiyon kapsamının görüş alanına yerleştirmeye dikkat edin. Eş leadin'in diseksiyonu bu prosedürün en zorlu yönüdür.

Düşük büyütme ve keskin forseps kullanmak ve çok dikkatli olmak, keskin forseps kullanarak başarılı bir diseksiyon sağlamaya yardımcı olacaktır. Tohum kabuğunu fide içinden dikkatlice çıkarın, hem dış hem de iç bütünlükler çıkarılmalıdır. Ardından, manşon kurşununu hiper cottle ve radikalden arındırmak için bir neşter kullanın.

Görüntüleme için hiper manşonu ve radikali çıkarmak faydalıdır, çünkü sağlam kalırsa hiper kot önemli ölçüde düzleşir ve uzar. Koss Leadin'i hızlandırılmış görüş alanından çıkararak, disseke edilmiş cos leadin'i suya batırılmış halde tutun. İstenilen Olean sayısına ulaşılana kadar tohum diseksiyonunu tekrarlayın.

Olean'ı oda kızağına monte etmeden önce 15 ila 20 başarılı diseksiyon önerilir. Hazne sürgüsünü kotan montajına hazırlamak için, agar ortamını kesmek için küçük bir örtü lamı kullanın ve tüm katmanı haznenin cam tabanından yukarı kaldırın. Pipet disseke kotanı minimum miktarda su ile tutma borusundan hazneye kaydırın.

Kaldırılan agar tabakasının altına kaydırın. Agarı yavaşça sedinlerin üzerine indirin. Fazla su varsa, bir mendille ıslatın.

Montaj tamamlanırken sedinleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Numuneler artık kolayca hareket etmemelidir. Kapağı hazne sürgüsünün üzerine yerleştirin ve sürgüyü mikroskop tablasına aktarın.

Görüntülemeden önce, istenen Fluor'u görüntülemek için ters konfokal mikroskobu ayarlayın. LSM 700 parametreleri, 488 nanometrenin GFP uyarımı ve toplanması içindir. 440 ila 530 nanometrede bant geçiren bir filtre ve 555 nanometrede RFP uyarımı ve toplama için.

570 ila 610 nanometrede 20 kat objektifli bir bant geçiren filtre ile. ACO'nun girişine odaklanın ve hedefi odanın merkezine taşıyın. Çekim modunda kaydırın, yakınlaştırmayı 0,5 ve çerçeve boyutunu 48 x 48 piksel olarak değiştirin.

Konumlar onay kutusunu seçin ve genel bakış görüntüsünü tarayın, ardından yatay ve dikey döşeme sayılarını 30 ila 35'e yükseltin. Taramayı başlatmak için tara düğmesine tıklayın. Tarama tamamlandığında, boyutlar sekmesinin altındaki konumlar düğmesine tıklayın ve gözlemlemek için her bir bebek karyolası girişine Artı işaretleri yerleştirin.

Monte edilmiş numunelerde hasar olup olmadığını kontrol edin. Yalnızca görüntüleme için uygun numuneleri bırakmak için hasarlı coss leadin'e karşılık gelen konumları silin. Ardından, tüm örneklerin coss leadin epidermisini kapsayan bir Z serisi oluşturun.

Zack onay kutusunu tıklayın. Konum listesinin altındaki her bir konumu seçin ve taşı düğmesine tıklayın. Epidermisteki cos lead'in en üst düzlemine odaklanın ve Zack'in altındaki ilk ayarla düğmesine tıklayın.

Epidermisin yararlı bir şekilde görülebildiği en düşük konuma odaklanın. Ve son ayarla düğmesine tıklayın. Ayarlanacak en iyi Z dilimi kalınlığını gösteren optimal'in yanındaki düğmeyi tıklayın.

Bu ayarların tüm örnekleri kapsadığını doğrulamak için her bir kos girişini kontrol edin. Z parametreleri bireysel pozisyonlar için ayarlanamaz. Burada kullanılan Zen 2009 yazılımında, üç gün boyunca 15 ila 30 dakikalık istenen çözünürlük ve uzunluk aralıklarına sahip zaman serileri kurmak, epidermal hücre bölünmesindeki protein dinamikleri için etkilidir, ancak aralıklar gerektiği gibi değiştirilebilir.

Zaman serisi onay kutusunu tıklayın, metin alanına yazarak istenen görüntü sayısı için döngüleri ayarlayın, aralığı 30'a ayarlayın ve açılır menüyü kullanarak MIN öğesini seçin, XY, ZT çok konumlu taramayı başlatın, çerçeve boyutunu istenen çözünürlüğe değiştirin ve denemeyi başlatın. Konum sayısının tarama özellikleriyle sınırlandırılması gerektiğini unutmayın. Toplam tarama süresi istenen aralıktan daha büyükse, zaman noktaları doğru olmayacaktır.

Bu sistemi kullanarak, 30 dakikalık bir aralıkta 59 Z diliminde GFP ve RFP'yi görüntülerken maksimum altı eşzamanlı konum mümkündür. Bu yöntemle toplanan bir dizi bilgilendirici zaman noktası örneği burada gösterilmiştir. Hücre zarları RFP ile etiketlenir ve GFP, doğal promotörü altında bir polar proteini kaynaştırır.

Seri A'daki görüntüler, polar GFP'nin başlangıçta eşit dağılmış göründüğünü, daha sonra ok uçlarıyla gösterilen asimetrik bölünmelerden yaklaşık iki saat önce göründüğünü göstermektedir. Polar GFP, 47 saat sonra ok ucu ile gösterilen ilk asimetrik bölünmeyi takiben B serisinde yeni başlayan meister OID'nin bölgesinden ayrılır. Polar GFP her iki hücrede de kaybolur.

Meris oid tarafından koruyucu ana hücre durumuna hızlı geçişi ima eden yıldız işareti ile gösterilen koruyucu ana hücre simetrik olarak bölünür ve stoma koruyucu hücreleri oluşturmak üzere farklılaşırken, sistoma hücresi muhtemelen daha sonraki bir asimetrik bölünmeden önce polar GFP ekspresyonunu yeniden kazanır. Burada, bir stoma öncü hücresinin amplifikasyonu ve aralığı sırasında polar GFP lokalizasyonunun kolaylaştırılmış kayıtlı bir videosu gösterilmektedir. Başlangıçta polar GFP, çimlenmeden 39 saat sonra hücrede homojen bir şekilde görünür.

40 saatlik bir bölünmeden hemen önce güçlü bir şekilde polarize olur ve hücrenin diğer ucuna daha küçük bir hizmetçi yerleştirir. Sağdaki daha büyük hücre de stoma soy kimliğini yeniden kazanır ve 45 saat sonra Polar GFP lokalizasyonu stoma öncüsürüne bitişik hareket eder. 47 saatlik bölünme, sağda mevcut me stamoidinden sola doğru yönlendirilmiş yeni bir steroid üretir.

Sonuç, iki stomanın bir hücre ile ayrılmasıdır. Bu videoyu izledikten sonra, gelişim sırasında epidermiste gen ekspresyonunu ve protein lokalizasyonunu değerlendirmek için çimlenen bir ortak leadinin uzun süreli zaman atlamalı uygulamasının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.