Name: Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme Arabidopsis Kotiledon Epidermis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis kotiledon epidermisinde uzun süreli konfokal time-lapse görüntüleme ile hücre bölünmesi ve protein dinamiklerini gözlemleme yöntemini. Bu teknik, stomata farklılaşmasını canlı olarak incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz POLAR :: POLAR-eGFP oluşturmak için zaman atlamalı protokolü ve Lynn Pillitteri geliştirmede yardım için Amanda Rychel ederim. Biz de am-rb inşa sağlamak için ABRC minnettarız. Bu protokol, Japonya Bilim Teknoloji ve Kurumu&#39;ndan PRESTO ödülü bir destek ile geliştirilmiştir. POLAR Araştırma ayrıca, Washington Royalty Araştırma Fonu (RRF-4098) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB-0855659) Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. KMP bir NSF Lisansüstü Araştırma Görevlisi (DGE-0718124) ve KUT bir HHMI-GBMF dedektif.

1. Tohum Sterilizasyon <ol><li> % 33 ev tipi çamaşır suyu,% 0.1 Triton X-100: Tohum sterilizasyon çözeltisi hazırlayın. </li><li> İstenen flüoresan raportör yapı (lar) ve genotip (ler) 1.7 ml tüp içinde ve sterilizasyon çözeltinin 1 mL&#39;si uygulamak taşıma il tohumlar. 15 dakika nutator inkübe edin. </li><li> Steril bir başlık olarak, geride tohum bırakarak, tüpten sterilizasyon çözüm kaldırmak için bir pipet kullanın. 1 ml steril su ile durulayın. Dört kez tekrarlayın. </li><li> İki veya daha fazla gün boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 2. Oda Slide Ortam hazırlanması <ol><li> Çözünene kadar Bacto bir 200 ml şişeye, su içinde Agar (saf olmayan agaroz), ve mikrodalga% 0.5 çözelti 20 ml karıştırılır. Çözüm kaynar dikkatli olun. </li><li> Yaklaşık 60 ° C ile çözelti soğutulur </li><li> Bir pipet ile agar solüsyonu 1 ml toplayın ve yavaşça odasına slayt (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Almanca coverglass Sistemi) iç cam kapak için geçerlidir. Çözüm which çok sıcak ya da yapıştırıcı veya çatlak cam eritmek olabilir çok hızlı uygulanır. </li><li> Hemen agar çözeltisi bir ikinci ml eklenir. Agar ortamı artık tamamen slayt bölmesinin alt kapsamalıdır. Bu minimal ortam nem korumak ve gaz difüzyon vererek dört ila beş gün için saklanan besin içeren bir bitki kotiledon, in gelişimini desteklemek için yeterlidir. </li><li> Odası ile benchtop Cool slayt kaplıdır. Şişeyi sıkıca kapalı ise, çözümü kaydedilir ve gelecekteki kullanım için ısıtılmış olabilir. </li></ol> 3. Tohum Diseksiyon <ol><li> 4 ° C depolama steril tohum borusunu sökün. </li><li> Diseksiyon mikroskop sahnede bir kağıt mendil koyun ve su ile nemlendirin. Pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için doku ayarlayın. Doku diseksiyon için tohum stabilize etmek için kullanılır. </li><li> Tüpten dokuya Pipet 20-30 tohum, görüş diseksiyon kapsamı tarlasında yerleştirmek için dikkatli olmak. </li><li> Keskin forseps (Roboz, # 5 biyoloji ucu) kullanma, Dikkatle fide içeriden çiğit çıkarın. Dış ve iç iki integuments kaldırılması gerekir. </li><li> Zaman görüntüleme kotiledon, bu hipokotil ve radikula kaldırmak için faydalıdır. Kotiledonlar Bu protokol kapsamında birkaç gün geliştirmek için yeterli besinleri içerir. Sağlam olursa, hipokotil görünümünün zaman atlamalı alan kotiledon dışarı taşıyarak, dramatik düzeltin ve uzatacaktır. Hipokotil ücretsiz kotiledon dilim için bir neşter kullanın. </li><li> Bir mikrotüp veya benzeri, suya disseke kotiledon tutun. </li><li> Kotiledon istenen sayıda ulaşılana kadar 3.4-3.6 tekrarlayın. 15-20 başarılı diseksiyonlar montaj yapılması tavsiye edilir. </li></ol> 4. Odası Slayt Montaj Kotiledonlar <ol><li> Bir küçük (18 mm 2) kapak kayma, agar besiyerinde kesti ve odasına slayt cam tabanından tüm katmanın yukarı kaldırın kullanma. </li><li> Pipet tutarak suyun minimum kotiledon dissekekaldırdı agar tabakasının altında odasına slayt içine tüp. </li><li> Yavaşça kotiledon üzerine agar indirin. Fazla su varsa, kotiledon rahatsız etmemek için dikkatli olmak, bir doku ile uzak ıslatın. Montaj tamamlandığında numuneler artık kolayca hareket etmelidir. </li><li> Odasına slayt ve mikroskop sahne için hareket slayt kapağı yerleştirin. </li></ol> 5. Time Lapse Görüntüleme <ol><li> Görüntü istenen fluorofor (ler) için ters konfokal mikroskop ayarlayın. Kullanılan LSM700 parametreleri: GFP, 440-530 nm&#39;de filtre band pass ile 488 nm ve toplama uyarma; RFP, 570-610 nm&#39;de filtre band pass ile 555 nm ve toplama uyarma için. </li><li> Hasar monte örnekleri inceleyin. Sağlam bir yerleri programlayın, düzgün mikroskop yazılım içine kotiledon monte. Zen 2009 yılında: 20x objektif ile kotiledon odaklanın ve oda slayt merkezine amacı taşımak. Toplama Modu altında, 0.5 Zoom değiştirebilir ve Çerçeve Boyutu &lt;48x48 piksel / em&gt;. Pozisyonlar altında Pozisyonlar onay ve Tarama genel görüntü ... düğmesini seçin, sonra 30-35 Yatay ve Dikey kiremit sayısını artırmak. Tarama tamamlandığında, gözlemlemek için her kotiledon az Boyutlar sekmesinde yer ve crosshair&#39;i altında Pozisyonlar düğmesini tıklatın. </li><li> Tüm samples.In Zen 2009 kotiledon epidermisin kapsayan z serisi ayarlayın: Z-Stack onay kutusunu tıklatın. Görev Listesi altında her bir pozisyon seçin ve düğmesini Taşı tıklayın. Kotiledon epidermisin üst düzlemi odaklanın ve Z-Stack altında Set İlk düğmesini tıklatın. Epidermis yararlı görünür olduğu en düşük konuma Odak ve Set Son düğmesini tıklatın. Ayarlamak için en iyi z-kesit kalınlığı gösteren, Optimal yanındaki düğmesini tıklatın. Bu ayarları tüm örnekleri kapsayacak onaylamak için her kotiledon kontrol edin; z parametreleri indiv için ayarlanamazZen, 2009 yılında idual pozisyonları. </li><li> İstediğiniz çözünürlüğü ve uzunluk zaman serileri ayarlayın. Üç gün için 15-30 dakika aralıklarla epidermal hücre bölünme protein dinamik için etkilidir. Bu aralık gerektiğinde değiştirilebilir. Zen 2009 yılında: Zaman Serisi onay kutusunu tıklatın. Zaman Serisi altında, metin alanına kaymak veya yazarak kullanarak istenen görüntü sayısı için döngüleri ayarlayın. 30 Aralık ayarlayın ve min seçmek için açılan menüyü kullanın. </li><li> Xyzt çok pozisyonlu tarama başlayın. Konumların sayısını tarama özellikleri ile sınırlı olması gerektiğine dikkat ediniz; toplam tarama süresi, istenen aralığından daha büyük olduğu takdirde, zaman noktası doğru olmayacaktır. Görüntüleme GFP ve TTT 59 bir 30 dakikalık aralıklarla z-dilim sistemimiz kullanırken aynı anda altıya pozisyonların maksimum mümkündür. Zen 2009 yılında: Değişim Çerçeve Boyutu istenen çözünürlük ve Başlat Deney tıklatın. </li></ol> 6. Video Düzenleme <ol><li> Konfokal veri dosyası itibaren, maksimum yoğunluğu TIFF gibi kayıpsız bir format içinde görüntü dosyaları gibi her zaman / konum birleşimi ve ihracat z-projeksiyon yapmak. Dosya adları, bir film onları birleştirmek için yazılım için pozisyon başına bir dizi (örneğin, POLAR-GFP_0001_pos1, vb, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 değil) olmalıdır. Zen 2009 yılında: Kullanımı: Kopyala ardından ayrı dosyalar Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu içine pozisyonları bölmek İşleme sekmesi altında Altküme. (: - Serisi İhracat, Tam çözünürlüklü görüntü penceresinde Dosya) Nihayet, TIFF gibi ihracat. </li><li> BUnwarpJ makro 9 (: Kayıt: bUnwarpJ Plugins) çalıştırarak ardışık görüntüleri hizalamak için FIJI 7,8 kullanın. Mono Kayıt Modu değiştirin. Tüm Gelişmiş Seçenekler varsayılan değerleri kullanabilirsiniz. Uzun zaman atlamalı dizileri için, indirmek ve kurmak makro &quot;Afin + Tutarlı Elastik 2D Görüntü Kaydı,&quot; görüntülerin otomatik olarak bir dizi bUnwarpJ geçerli olacak ve açık yDosya kullanarak bizim veriler: İthalat: kullanmak için Görüntü Sırası. MOPS görülecek ekstraksiyon ve çalışma işaretini kaldırın. </li><li> Hizalanmış görüntüler dizisini açın ve istediğiniz video formatı (AVI iyi bir seçimdir) kaydetmek FIJI / ImageJ veya Quicktime Pro kullanın. </li></ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64(1983).</li>
<li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoe%2C+V+%22Development+of+Drosophila+melanogaster%22">Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).</li>
<li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449(1995).</li>
<li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854(2002).</li>
<li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division%2C+Cell+Growth%2C+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74(2004).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260(2011).</li>
<li>Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: 
		
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji">http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji</a> (2008).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36(2004).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArganda-Carreras%2C+I+%22Computer+Vision+Approaches+to+Medical+Image+Analysis%2C+ser.+Lecture+Notes+in+Computer+Science%22">Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science</a>. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).</li>
<li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+of+the+Mouths+of+Plants%3A+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296(2010).</li>
<li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011(2007).</li>
<li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619(2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu hızlandırılmış konfokal teknik fluoresan etiketli protein ekspresyonu Kutup ve başka dinamik olarak değişen bir protein halinde kendi işlevini uygun bir anlaşılması için önemli olan Arabidopsis kotiledon epidermis, bireysel hücrelerin içinde lokalizasyon uzunlamasına çalışmalar izin verir. Önceden, sürekli zaman atlamalı görüntüleme Arabidopsis kök mantar enfeksiyonu 11 ve meristem büyüme 5,12 incelemek için kullanılan, ancak kotiledon epidermisin ekleyerek bu tekniğin çok yönl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Tek odacıklı slayt </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Ya da iki odacıklı (155.379) </td></tr><tr><td> Lazer tarama konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Zen 2009 yazılımı </td></tr><tr><td> 20x objektif lens </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0.8, Plan-APOCHROMAT </td></tr><tr><td> Mikroskop Diseksiyon </td><td> Benz (Ulusal) </td><td> 431TBL </td><td> Alttan yanar </td></tr><tr><td> # 5 forseps, biyoloji ucu </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> SC-4978 </td><td> Çok ince ipuçlarıkritik </td></tr></tbody></table>

uzun süreli, yüksek çözünürlüklü konfokal time lapse görüntüleme<em&gt; arabidopsis kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; epidermis

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Gelişimsel bir sıra boyunca hücresel davranışı in vivo dinamiği Görüntüleme doku desenlendirme mekaniğini anlamak için güçlü bir teknik olabilir. Hayvan gelişimi sırasında, anahtar hücre çoğalması ve desenlendirme olaylar çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Örneğin, Caenorhabditis elegans larva vücut planı için gerekli tüm hücre bölünmeleri yedi mitotik çevrimleri 1, döllenmeden sonra altı saat içinde tamamlanır; Drosophila embriyo on altı veya daha fazla mitoz az 24 saat 2 görülür. Buna karşılık, bitkisel gelişimi sırasında hücre bölünmesi, genellikle günde bir 3,4,5 düzeni üzerinde, yavaştır. Bu eşsiz bir meydan okuma ve hücre bölünmesi ve bitki organogenez sırasında farklılaşma olayları dinamik davranışları belgelemek için uzun vadeli canlı görüntüleme için bir ihtiyaç yüklemektedir. Arabidopsis Epidermis araştıran sinyalizasyon, hücre kaderinin ve bitkilerin gelişim için mükemmel bir model sistemi. Kotiledon, bu doku oluşur hava ve eşit dağıtılmış stoma serpiştirilmiş suya dayanıklı kaplama hücreleri, vanalar açılır ve gaz değişimi ve su kaybı kontrol yakındır. Bu stoma Uygun aralık kendi işlevi için önemlidir ve onların gelişimi asimetrik bölünme ve organize epidermis (Şekil 1) üretmek için hücre farklılaşması bir dizi adımı izler. Bu protokol, gelişme birkaç gün boyunca hücreleri ve epidermis içinde proteinlerin gözlem izin verir. Bu zaman çerçevesi kök hücre bölünmeleri ve stoma ve epidermal kaldırım hücreleri de dahil olmak üzere epidermal hücrelerin farklılaşma hassas belgelere sağlar. Floresan proteinleri hücre bölünmesini ve farklılaşmasını işlemleri sırasında dinamik değerlendirmek için ilgi çekici proteinler oluşturacak şekilde eklenebilir. Bu teknik, th stomatal-soy hücrelerinin proliferasyonu aşaması sırasında, bize yeni bir protein, POLAR 6 lokalizasyonu anlamak olanak tanırasimetrik bölünme olayları ve bölünmesi meydana kısa bir süre önce hücre korteksin karakteristik bir alana hamle önceki hücrelerde ifade edilir e Arabidopsis kotiledon epidermis. Görüntüleri kayıt ve akıcı görüntü kolaylıkla zamanla değişebilir gibi dinamik protein lokalizasyonu ve hücre tipleri görselleştirmek için kamuya açık yazılımı kullanılarak üretilebilir.

<html> Bu yöntem ile elde bilgilendirici zaman noktalarında bir dizi Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Hücre zarları RFP (pm-rb) ve GFP 30 dk zaman ölçeğinde (POLAR :: POLAR-GFP) onun yerli promotör altında POLAR protein 6 birleşmesini ile etiketlenir, biz protein yerelleştirme değişiklikleri ile birlikte hücre bölünmeleri bakın kendilerinden önceki. Asimetrik hücre stoma soyu şeklinde bölünmeler kök hücre benzeri daha asimetrik bölünme geçmesi yeteneği korumak meristemoids, ve onların ...

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Gelişimsel bir dizi boyunca hücresel davranışın in vivo dinamiklerinin görüntülenmesi, doku mekaniklerini anlamak için güçlü bir teknik olabilir...

Aşağıdaki deneyin amacı, tohum çimlenmesinden sonraki epidermal gelişimin erken evrelerini hücresel düzeyde görselleştirmektir. Bu, öncelikle tohum kabuğunun çıkarılmasıyla ve ikinci adım olarak kosin yapılarının net bir şekilde görülmesinin sağlanmasıyla gerçekleştirilir. Kosinler, onları immobilize eden ve gelişimlerini destekleyen bir agar besiyeri tabakası altına yerleştirilir; ardından, epidermal hücrelerin in vivo büyümesini ve bölünmesini gözlemlemek amacıyla birkaç gün boyunca zaman aşımıyla görüntüleme yapılır.Görünür floresans temelinde dinamik gen ekspresyonu ve protein lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin, Gus boyamasının durgun görüntüleri veya GFP füzyonları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre bölünmesi ve farklılaşması sırasında proteinlerin dinamik hareketini göstermesidir. Bu deney için Arabidopsis tohumları, %33 ev tipi çamaşır suyu ve %0,1 Triton X 100 içeren bir tohum sterilizasyon solüsyonunda sterilize edilir; istenilen floresan raporlayıcı konstrüktları ve genotipleri taşıyan tohumlar 1,7 mililitrelik bir tüpe yerleştirilir ve bir mililitre sterilizasyon solüsyonu uygulanarak 15 dakika boyunca bir çalkalayıcıda inkübe edilir.Steril bir kabinde, tohumlar tüpte kalacak şekilde sterilizasyon çözeltisini uzaklaştırmak için bir pipet kullanın. Bir mililitre steril su ile durulayın. Dördüncü durulamadan sonra işlemi dört kez tekrarlayın.Dört santigrat derecede iki gün veya daha fazla süre inkübe edin. Chamber slide ortamını hazırlamak için, 200 mililitrelik bir erlenmayer içerisinde 20 mililitre %0,5'lik su bazlı bact to agar çözeltisini karıştırın ve çözülene kadar mikrodalga fırında ısıtın. Çözelti kaynarken dikkatli olun.Çözeltiyi yaklaşık 60 derece Celsius'a kadar ısıtın. Çok sıcak olan veya çok hızlı uygulanan bir çözelti, yapıştırıcıyı eritebilir veya chamber slaytın camını çatlatabilir. Agar çözeltisi yeterince soğuduğunda, bir pipetle bir mililitre alın ve hemen chamber slayt içindeki lam üzerine yavaşça uygulayın.Bir mililitre daha agar çözeltisi ekleyin. Agar ortamı artık oda slaytının tabanını tamamen kaplamalıdır. Nemin korunmasını sağlaması ve gaz difüzyonuna izin vermesi sayesinde, bu minimum ortam, dört ila beş gün boyunca depolanmış besin maddeleri içeren bir bitki oleininde gelişimi desteklemek için yeterlidir.Kamerası örtülü olan lamı tezgahın üzerine yerleştirin. Bu prosedüre başlamak için, steril tohum tüpünü dört derece santigrat sıcaklıktaki saklama alanından çıkarın. Bir diseksiyon mikroskobunun tablasına bir kağıt mendil yerleştirin, suyuyla nemlendirin ve pürüzsüz bir yüzey oluşturacak şekilde ayarlayın.Doku, diseksiyon sırasında tohumları sabitlemek için kullanılır. Tüpten 20 ila 30 tohumu, diseksiyon mikroskobunun görüş alanına yerleştirmeye dikkat ederek dokunun üzerine pipetle aktarın. Koleatın diseksiyonu, bu prosedürün en zorlayıcı kısmıdır.Düşük büyütme ve keskin pensler kullanarak ve çok dikkatli davranarak diseksiyonun başarıyla gerçekleştirilmesini sağlayabilirsiniz. Keskin pensler kullanarak, içerideki fidandan tohum kabuğunu dikkatlice çıkarın; hem dış hem de iç integumentler çıkarılmalıdır. Ardından, kotiledonu hipokotil ve radikalden ayırmak için bir bistüri kullanın.Görüntüleme için hiper kotun ve radikalin çıkarılması faydalıdır; çünkü eğer bütün kalırlarsa, hiper kot dramatik bir şekilde düzleşecek ve uzayacaktır. Koss Leadin'i zaman atımlı görüntüleme alanının dışına taşıyarak, diseke edilmiş cos leadin'i suyun içinde tutun. İstenilen Olean sayısına ulaşana kadar tohum diseksiyonunu tekrarlayın.Olean'ı odağa yerleştirmeden önce 15 ila 20 başarılı diseksiyon yapılması önerilir. Cotan'ı yerleştirmek için odağı hazırlamak amacıyla, agar ortamını kesmek ve tüm tabakayı odağın cam tabanından kaldırmak için küçük bir lam kestireli kullanın. Pipetle diseksiyonu yapılmış cotan'ı, tutma tüpünden odağın içine minimal miktarda su ile aktarın.Kaldırılan agar tabakasının altına kaydırın. Agarı nazikçe sedinslerin üzerine indirin. Fazla su varsa, bir mendil yardımıyla emdirerek alın.Montaj tamamlandığında sedimentlerin dağılmamasına dikkat edin. Örnekler artık kolayca hareket etmemelidir. Lam camının üzerine örtü camını yerleştirin ve lamı mikroskop tablasına aktarın.Görüntüleme öncesinde, ters konfokal mikroskobunu istenen floroforun görüntülenmesi için ayarlayın. LSM 700 parametreleri, 488 nanometre GFP eksitasyonu ve koleksiyonu için; 440 ile 530 nanometre arasındaki bir bant geçiren filtre ile 555 nanometre RFP eksitasyonu ve koleksiyonu içindir.20x objektif ve 570 ila 610 nanometre aralığında bir bant geçiren filtre kullanarak. ACO girişine odaklanın ve objektifi odacığın merkezine taşıyın. Görüntüleme modunda kaydırarak zoom ayarını 0,5'e ve çerçeve boyutunu 48 x 48 piksele getirin.Pozisyonlar onay kutusunu ve genel tarama görüntüsünü seçin, ardından yatay ve dikey karo sayılarını 30 ile 35 arasına getirin. Taramayı başlatmak için tara butonuna tıklayın. Tarama tamamlandığında, boyutlar sekmesi altındaki pozisyonlar butonuna tıklayın ve gözlemlenecek her bir kot ucuna artı imleçleri yerleştirin.Monte edilmiş örnekleri hasar açısından inceleyin. Sadece görüntüleme için uygun örnekler kalacak şekilde, hasarlı coss leadin kısımlarına karşılık gelen konumları silin. Ardından, tüm örneklerin coss leadin epidermisini kapsayan bir Z serisi oluşturun.Zack onay kutusuna tıklayın. Pozisyon listesi altındaki her bir pozisyonu seçin ve taşı butonuna tıklayın. Epidermisteki cos lead'in en üst düzlemine odaklanın ve Zack altındaki ilkini ayarla butonuna tıklayın.Epidermisin faydalı şekilde görülebildiği en alt konuma odaklanın ve "set last" butonuna tıklayın. Ardından, ayarlanması gereken en iyi Z dilim kalınlığını gösteren "optimal" yanındaki butona tıklayın.Bu ayarların tüm örnekleri kapsadığını onaylamak için her bir kos girişini kontrol edin. Z parametreleri tekil konumlar için ayarlanamaz. Burada kullanılan Zen 2009 yazılımında, istenen çözünürlükte zaman serileri oluşturun; epidermal hücre bölünmesindeki protein dinamikleri için üç gün boyunca 15 ila 30 dakikalık uzunluk aralıkları etkilidir, ancak aralıklar gerektiğinde değiştirilebilir.XY, ZT çok pozisyonlu taramayı başlatmak için, zaman serisi set döngüleri altındaki zaman serisi onay kutusuna tıklayın, metin alanına istenen görüntü sayısını yazın, aralığı 30 olarak ayarlayın ve dakika seçmek için açılır menüden MIN'i seçin; ardından çerçeve boyutunu istenen çözünürlüğe getirin ve deneyi başlatarak verileri toplayın. Pozisyon sayısının tarama özellikleri ile sınırlandırılması gerektiğini unutmayın. Toplam tarama süresi istenen aralıktan daha fazla olursa, zaman noktaları doğru olmayacaktır.Bu sistem kullanılarak, GFP ve RFP'nin 30 dakikalık aralıklarla 59 Z kesitiyle görüntülendiği durumlarda, aynı anda en fazla altı pozisyon mümkündür. Bu yöntemle toplanan bilgilendirici zaman noktaları setine bir örnek burada gösterilmiştir. Hücre membranları RFP ile, polar bir protein ise kendi doğal promotörü altında GFP ile işaretlenmiştir.A serisindeki görüntüler, polar GFP'nin başlangıçta eşit dağıldığını, ardından ok uçlarıyla belirtilen asimetrik bölünmelerden yaklaşık iki saat önce ortaya çıktığını göstermektedir. 47. saatteki ok ucuyla belirtilen ilk asimetrik bölünmeyi takiben, B serisinde polar GFP, başlangıç aşamasındaki meister OID bölgesinden uzağa ayrışır. Polar GFP her iki hücrede de kaybolur.Meristoid tarafından bekçi ana hücre durumuna hızlı bir geçişin ima edildiği, yıldızla belirtilen bekçi ana hücre simetrik olarak bölünür ve stomatal bekçi hücrelerini oluşturmak üzere farklılaşır; bu sırada kisto hücre, muhtemelen daha sonra gerçekleşecek asimetrik bir bölünme öncesinde polar GFP ekspresyonunu yeniden kazanır. Burada, tek bir stomatal öncül hücrenin amplifikasyonu ve aralanması sırasında polar GFP lokalizasyonunun hızlandırılmış kayıtlı videosu gösterilmektedir. Başlangıçta polar GFP, çimlenmeden 39 saat sonra hücrede homojen olarak görülür.40. saatte, bölünmeden hemen önce güçlü bir şekilde polarize olur ve hücrenin karşı ucuna daha küçük bir meristemi yerleştirir. Sağdaki daha büyük hücre aynı zamanda stomatal soy kimliğini yeniden kazanır ve 45. saate gelindiğinde Polar GFP lokalizasyonu stomatal öncülünün yanına taşınır. 47. saatteki bölünme, sağ tarafta, soldaki ilk meristemiyle ters yönde konumlanmış yeni bir steroid üretir.Sonuç olarak, iki stoma bir hücre ile birbirinden ayrılmış olur. Bu videoyu izledikten sonra, gelişim sırasında epidermiste gen ekspresyonunu ve protein lokalizasyonunu değerlendirmek için çimlenen bir kotiledonun uzun süreli time-lapse görüntülemesinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz perfluorodecalin infiltratif montaj aracı olarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu görüntüleme derinliğini artırmak için basit bir yöntem.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir.

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Bu makalede, ana kök ve kök tüyleri tek bir optik uçağı için confines bir iki katlı mikrosıvısal platformda Arabidopsis thaliana fidan kültür gösterilmiştir. Bu platform iyi kök morfolojisi de yüksek çözünürlüklü görüntüleme gelince gerçek zamanlı optik görüntüleme için başka araçlar tarafından kullanılabilir.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Floresan canlı görüntüleme Arabidopsis thaliana yaprakların uzun bir zaman aralığı içinde gerçekleştirmek için basit ve çok yönlü bir yöntemi bildirin. Biz bir transgenik Arabidopsis bitki bitki bağışıklık yanıtı kronolojik zamanmekansal anlayış kazanıyor için bir örnek olarak bir bağışıklık ile ilgili düzenleyici denetimi altındaki bir floresan muhabir gen ifade kullanın.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Öğrenin, Arabidopsis kotiledon epidermisinde uzun süreli konfokal time-lapse görüntüleme ile hücre bölünmesi ve protein dinamiklerini gözlemleme yöntemini. Bu teknik, stomata farklılaşmasını canlı olarak incelemeyi sağlar.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme

Daha fazla video keşfet