Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanarak nöron-ggl etkileşimlerini analiz etmek için yeni bir nöronal akson ve Astroglia ko-kültür platformu oluşturur. İlk olarak, mikroakışkan kültür odasını monte edin, nöronal kültürler hazırlayın ve nöronal aksonları MCP'nin diğer tarafına girmeye teşvik edin. Daha sonra, konfokal immünofloresan mikroskobu ile hızlandırılmış görüntüleme de dahil olmak üzere bölümlere ayrılmış bir ko-kültür sistemi oluşturmak için kültürlenmiş astrositler ekleyin, aksonlar, astroglia ve nöronal aksonlar arasındaki etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, nöronal sürecin nöronal sekresyona karşı etkisini GT bir regülasyonuna ayırmaya çalışırken aklımıza geldi. Tipik olarak, yönteme yeni olan bireyler, aksonu hücresel bölmenin diğer kısmına indüklemekle mücadele edeceklerdir. Nöronal tarafta kaplanmış yüksek yoğunluklu sağlıklı nöronlar gerektirir ve nöron merkezi kanalların yakınında kaplanır.

MCP açık odaları, farklı hücre tiplerinin bölmeli kültürleri için tasarlanmıştır, ko-kültürdeki nöronları ve astrositleri kaplamak için poliüretan ve laminin kaplamalar gereklidir. İlk olarak, steril cam tabanlı tabaklara mililitre poliüretan çözeltisi başına bir miligram uygulayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kaplanmış cam alt bulaşıkları çift damıtılmış su ile üç kez yıkayın ve ardından kuruması için steril bir çeker ocak altına koyun.

Daha sonra, çanağı mililitre başına bir miligram, laminin ile kaplayın ve bir saat boyunca UV ışığı altında kurutun. MCP'nin cam alt tabağa montajı kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. Mikroakışkan kültür platformunu, merkezi bağlantı kanalları alt tarafında olacak şekilde konumlandırın ve kaplanmış cam ile sıkı bir sızdırmazlık oluşturun.

Alt tabaklar. Birleştirilmiş MCP'nin her iki tarafına düzenli nöron veya astrosit kültür ortamları ekleyin. Odayı 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin ve MCP ile cam arasında sızıntı olmadığını doğrulayın.

Alt tabak. Cortico nöronal hücre kültürleri, embriyonik 14 ila 16 günlük fare beyinlerinden taze olarak hazırlanır. Fare beyninin diseksiyonunu takiben, diseksiyon mikroskobu altında meninksleri korteksten çıkarın.

Dokuyu küçük doku bloklarına ayırmak için bir tıraş bıçağı kullanın ve kıyma dokusu bloklarını santrifüjlemeden sonra bir tüpe yerleştirin. Ortamı peletin üzerine atın ve% 0.05 ekleyin10 dakika ve 37 santigrat derece su banyosu yapın. Ateşle parlatılmış bir makarna pipeti ile nazikçe tarayarak hücreleri ayırın.

Nöron kaplaması kullanarak berrak bir nöronal hücre süspansiyonu toplamak için numuneyi 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Orta% 5 FBS tohumu ile desteklenmiştir. Monte edilmiş MCP plakasının sağ tarafında 150 mikrolitre nöron.

Sadece hücre tutma alanına bağlanan nöronlar, merkezi kanallardan birleştirilmiş MCP'nin diğer tarafına aksonlar yetiştirebildiğinden, yüksek yoğunluklu nöronlar. Ertesi gün. Ortamı odanın hücre kaplama alanından dikkatlice aspire edin ve nöron kaplama ortamını normal nöron kültürü ile değiştirin.

Orta, odanın astrosit tarafına mililitre başına 20 nanogram, glial türevli nörotrofik faktör veya GDNF ekleyin. Bu, monte edilmiş MCP'nin merkezi kanalları boyunca nöronal taraftan akson büyümesini indüklemeye yardımcı olacak kimyasal bir gradyan oluşturur. İki gün sonra, merkezi kanala giren aksonları izleyin.

Aksonlar merkezi kanala girdikten sonra, genellikle bir gün içinde diğer tarafa girerler. Aksonlar normalde diğer tarafa girdikten sonra en az bir hafta boyunca bozulmadan kalır. Beyni P'den bir ila üç fare ponponu ayırdıktan sonra, astrositleri poliüretan kaplı 10 santimetrelik tabaklara tohum atıyor.

Kültür, hücreler gece boyunca astrosit kültür ortamını sonraki iki gün boyunca günlük olarak yeniler ve daha sonra astrositlerin tripsin kullanarak% 90 birleşik tek katmanlı hasat hücreleri oluşturduğu yedi gün sonra her üç günde bir Nöronların kaplanmasından yaklaşık beş gün sonra GDNF'den aspire edilir. Daha sonra, yeniden askıya alınmış astrositlerin 150 mikrolitresini monte edilmiş MCP'nin sol tarafına tohumlayın. Aksonlar girmek üzereyken veya astrositlerin yeniden kaplanmasından sonra yeni girdiklerinde, monte edilmiş MCP'nin sol tarafına giren aksonlar, doğrudan aksonal temas veya çözünür faktörlerin salınması yoluyla astrositlerle doğrudan etkileşime girer.

Astrositleri hücre tutma alanına bağlanma açısından izleyin. Aksonlar ve astrositler arasındaki etkileşimde yer alanlar gibi spesifik proteinleri görselleştirmek için bölümlere ayrılmış ko-kültür sistemindeki hücreleri immün boyayın. Bölmeli nöron ve astrosit ko-kültür sistemi, yalnızca nöronal süreçlere, özellikle aksonların astrositlerle seçici olarak etkileşime girmesine izin verir.

Burada astroglia glutamat taşıyıcısının akson kaynaklı transkripsiyonel aktivasyonunu açıklıyoruz. Bu çalışmalar, GT bir genomik promotörün kontrolü altında bir EGF floresan raportörünün ifadesini barındıran transgenik fareler kullanır. Birleştirilmiş MCPA'nın hücre tutma alanında yüksek yoğunluklu nöronlar kültürlenir, büyütülmüş görünüm, aksonların merkezi kanalları geçtiğini ve akson büyüme konisini ortaya çıkaran beta üç tübülin boyaması ile diğer tarafa girdiğini gösterir.

MCP sistemi, akson demetlerinin merkezi kanaldan büyüyüp diğer tarafa girerken izlenmesine izin verir. GT için immünos boyama, MCP sisteminin glial tarafındaki astrositleri tanımlarken ortaya çıktı. Resim, burada aksonlar ve GLT bir pozitif astrositler arasındaki teması göstermektedir.

EGFP raportörünün ekspresyonu, endojen GT bir promotör aktivasyonu, protein ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite ile ilişkilidir. C iki'deki tek astrositlerde GT bir promotör aktivitesinin değerlendirilmesi, bölümlere ayrılmış ko-kültür sisteminde önemli ölçüde artmış bir GLT bir immünoreaktivite gösterir. Daha da önemlisi, MCP sistemi, dinamik değişiklikleri izlemek için hızlandırılmış görüntülere izin verir.

Örneğin, bu veriler, astrositlerin kaplanmasından bir gün sonra geri GT bir EGFP astrositleri ve vahşi tip nöronlar ile akson kaynaklı GT bir promotör aktivasyonunu göstermektedir. Çok minimumda, EGFP floresan gözlenir. EGFP yoğunluğu, aksonlar astrositlerin tarafına iyice girdiğinde ve burada astrositlerle doğrudan temas ederek etkileşime girdiğinde, ko-kültürden 48 saat sonra önemli ölçüde artar.

Birleştirilmiş MCP'nin nöronal tarafında kinin tedavisi, nöronal hücre ölümüne neden oldu. İlginç bir şekilde, akson retraksiyonu ve dejenerasyonunun yanı sıra aksonal EGFP floresansındaki azalmayı da uyardı. Aksonlara yanıt olarak EGFP floresan yoğunluğunun bu dinamik değişiklikleri, Astroglia GT bir promotör aktivitesinin akson etkileşimi tarafından modüle edildiğini açıkça göstermiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir kez ustalaştıktan sonra mikroakışkan kültür platformunu kullanarak çekirdek kültür sisteminin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız, bu teknik birkaç gün içinde düzgün bir şekilde gerçekleştirilebilir.