Name: Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Öğrenin mikroakışkan kültür platformu kullanarak nöronal akson ve astroglia ko-kültür sistemini kurmayı. Bu yöntem yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile nöron-glia etkileşimlerini detaylı analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz BAC GLT1 eGFP fareler ve GLT1 antikor sağlamak için Dr Jeffrey Rothstein teşekkür etmek istiyorum; değerli çekirdek imkanları sağlamak için; Sinirbilim Araştırmaları Tufts Merkezi (PI, Rob Jackson NIH P30 NS047243); Yeni öğretim üye hibesi (NIH P30 5P30NS069254-02 ; Tufts Sinirbilim Anabilim PI, Phil Haydon).

1. Mikroakışkan Kültür Odası Meclisi (MCP) <ol><li> MCP (Şekil 1) hücreleri, 4 farklı bölmeli kültür için tasarlanan açık odaları vardır. Tipik olarak, merkezi kanal (çapı 3 um) ile bağlanmış iki bölmeden oluşmaktadır. Cam tabanlı yemekleri ile MCP Meclisi kültür ve sonraki görüntü analiz hazırlamak için gereklidir. </li><li> İlk olarak, Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kat steril cam tabanlı bir bulaşık sodyum tetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8.5) içinde çözüldü ve 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edildi </li><li> Ertesi gün, kaplanmış cam tabanlı bir bulaşık GKD 2 O ile üç kez yıkandı ve steril davlumbaz altında kurutulmuştur. Cam tabanlı tabaklar daha sonra daha fazla laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kaplanır, 1 saat için UV ışık altında kurutulmuştur. Kaplanmış bulaşık kullanıma hazır veya kullanıma dek -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Bu kaplamaco-kültür kaplama nöronların ve astrositler için gerekli yeniden. </li><li> Kültür platformu montajı için, mikroakışkan kültür platformları sıkı bir mühür oluşturmak için onun alt tarafında merkezi bağlayan kanalları ile kaplı cam zeminli yemeklerin üstüne yerleştirildi. Normal nöron veya astrosit kültür ortamlarda monte MCP her iki tarafı da (Şekil 1) (hücre kaplama alanlarından) eklendi ve 37 ° C&#39;de 2-4 saat inkübe, MCP ve cam arasında hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak için yapıldı dipli çanak. Biz hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak için kaplama hücreleri önce orta ile test ettik. Cam dipli çanak MCP montajı taze kullanılmadan önce hazırlanmalıdır. </li></ol> 2. Montajlı MCP nöronal Aksonlar nöronal Kültür ve İndüksiyon hazırlanması <ol><li> Kortikal nöronal hücre kültürleri taze embriyonik 14-16 günlük eski fare beyninden hazırlanmıştır. Nöron kültür ortamı neurobasal ortamı,% 2 B27 neurobasa oluşmaktadırl takviyesi, 100x GlutaMAX% 1 ve% 1 penisilin-streptomysin ekleyerek glutamin 2 mM. Fare beyin disseksiyon takiben, zarları mikroskop altında korteks çıkarıldı. Doku daha sonra tripsin ile maruz kalan yüzey alanını arttırmak için küçük doku blokları için bir jilet ile kıyılmış edildi. Doku blokları 37 ° C su banyosu içinde 10 dakika için (Sigma-Aldrich,% 0.05 tripsin) tripsinize ve bir ateş cilalı Pastör pipeti ile tritürasyon ile ayrılmış ve sonra yavaşça edildi. Disosiye berrak nöronal hücrelerin hücre süspansiyonu toplamak için bir 70 mikron filtre içinden filtre edildi. </li><li> Nöronların hücre tutma alanı (Şekil 1) bağlamak ve böylece nöronların (2-3 x 10 6 / ml, 150 ul) toplandı MCP sağ tarafında (Şekil 1) hücre kaplama alanı üzerine ekildi. Taze hazırlanmış nöronlar düzenlemeler içine% 5 fetal sığır serumu (Hyclone) ile desteklenmiş nöron orta kaplama ile kaplanmıştırr nöron kültür ortamı. Hücre tutma alanında takmak sadece nöronlar merkezi kanaldan monte MCP diğer tarafına aksonlar büyümesi için gerekli olduğundan, yeterli nöron bağlı olan sağlamak için hücre kaplama alanında nöron plaka yüksek yoğunluk önemlidir hücre saklama alanı. Nöronal aksonların yüksek yoğunluklu bir temsilcisi, görüntü Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. </li><li> Ertesi gün, nöron kaplama orta düzenli nöron kültür ortamı ile değiştirildi. Değişen ortam dikkatlice odasının hücre kaplama alanından orta aspirasyon ile gerçekleştirilir, ancak monte MCP hücre tutma alanı, hücre tutma alanı ve merkezi bağlantı kanalı içinde hava kabarcıkları önlemek için. Edildi Hava kabarcıkları ciddi MCP merkez kanal içine akson akıbet ve izleyen girdi inhibe olacaktır. Glial-hücresi kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF, 10-20 ng / ml), aynı zamanda, diğer (sol) tarafında eklendimonte MCP (Şekil 2A) merkez kanalları aracılığıyla nöronal yan ve çapraz akson akıbet 5 indüksiyonu kolaylaştırmak için aynı gün odasından. GDNF olmadan spontan akson uzantısı rayiç miktarı da monte MCP merkezi kanallardan nöronal yan ve çapraz görülmektedir. Merkez kanal içine girmek Aksonlar genellikle 2-3 gün sonra kaplama görülür. Aksonlar merkez kanal içine girdikten sonra, genellikle bir gün içinde diğer tarafı girin. Aksonlar diğer yan girdikten sonra, en az bir hafta süreyle normal olarak sağlamdır. </li></ol> 3. Bir Bölümlere Co-kültür Sistemi Kurmak MCP için Kültürlü astrositlerin eklenmesi Primer astrosit kültürleri, P1-3 pup fare beyninden hazırlandı. Beyin ayrışma işlem yukarıda tarif edilen nöronal hücre izolasyon prosedürü ile aynıdır. Astrositler ilk ön edildi 10 cm çanak içine ekildiPolyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kaplanmıştır. Astrosit besiyeri (DMEM,% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomysin) enkaz kaldırmak için önümüzdeki iki gün boyunca her gün değiştirildi. Bundan sonra, ortam her üç günde bir değiştirildi. <ol><li> Astrositler 90% konfluent haline ve 7 gün sonra bir tek tabaka oluştururlar. Konfluent astrositler tripsinize edildi ve akson yaklaşık girmek için olan ya da sadece sol tarafında içine girdikten sonra yeniden askıya alınmış astrositler (1x10 6 / ml) 150 ul monte MCP sol tarafında hücre kaplama alanı içine yeniden ekildi MCP toplandı. Nöronlar kaplama vardı sonra astrositler genellikle 4-5 gün ekildi. GDNF birinci MCP sol tarafına astrositlerin yeniden kaplama önce çıkarıldı. Yeniden kaplama astrositler gibi immun GFAP (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücre tutma bölgesinde bağlanmıştır. Odacıkların her iki tarafı arasında orta sadece asgari akım (d floresan ile belirlenirDaha önce 4,6 gösterildiği gibi evet), MCP bulundu. </li><li> Astrositler 90% konfluent haline ve 7 gün sonra bir tek tabaka oluştururlar. Konfluent astrositler aksonlar yaklaşık girmek için veya sadece sol içine girmiş olduğu zaman monte MCP sol tarafında hücre kaplama alanı içine yeniden ekildi tripsinize ve yeniden asılı astrositler (1 x 10 6 / ml) 150 ul edildi monte MCP tarafı. Nöronlar kaplama vardı sonra astrositler genellikle 4-5 gün ekildi. GDNF birinci MCP sol tarafına astrositlerin yeniden kaplama önce çıkarıldı. Yeniden kaplama astrositler gibi immun GFAP (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücre tutma bölgesinde bağlanmıştır. Daha önce gösterildiği gibi, 4,6 odacıkların her iki tarafı arasında orta sadece asgari akım (floresan boyalar ile belirlenen), MCP bulunmuştur. </li><li> Astrositlerin yeniden kaplama sonra, bir araya MCP sol tarafında girilen aksonların doğrudan doğruya astr ile etkileşimeDoğrudan aksonal temas veya çözünebilir faktörlerin salınımını biri tarafından ocytes. Astroglial plazma membranı glutamat taşıyıcı GLT1 ve nöronal βIII-tubulin immün Şekil 2D-F gösterildiği gibi, aksonların ve astrositler arasındaki etkileşimi görselleştirmek için yapıldı. </li></ol>

<ol><li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+signaling+in+the+development+and+plasticity+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Signals%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits.</a> Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).</li>
<li>Paixao, S., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+communication+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity.</a> Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).</li>
<li>Fields, R. D., Stevens-Graham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+neuron-glia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New insights into neuron-glia communication.</a> Science. 298, 556-562 (2002).</li>
<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuromuscular+synapse+development+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+neurturin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).</li>
<li>Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+astroglial+excitatory+neurotransmitter+transporter+GLT1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1.</a> Neuron. 61, 880-894 (2009).</li>
<li>Regan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+promoter+activity+reveal+a+differential+expression+and+physiology+of+glutamate+transporters+by+glia+in+the+developing+and+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS.</a> The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).</li>
<li>Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+glutamate+transporter+subtype+expression+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes.</a> The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).</li>
<li>Schlag, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+glial+Na%2B-dependent+glutamate+transporters+by+cyclic+AMP+analogs+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons.</a> Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).</li>
<li>Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+system+for+rodent+and+human+oligodendrocyte+specification%2C+lineage+progression%2C+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Debanne, D., Rama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+shape+axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Astrocytes shape axonal signaling.</a> Science signaling. 4, pe11(2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

MCP tabanlı nöron ve astrosit ko-kültür sistemi sadece aksonlar merkez kanalları geçmesine izin ve Astroglial hücreleri ile etkileşerek astroglial sinyal yolları ayrıntılı nöronun diseksiyon sağlar. Bu ko-kültür sistemi rahatlıkla konvansiyonel nöron ve astrosit kültürü prosedürleri ile kurulabilir. Biz de Astrositlerde akson bağımlı GLT1 organizatörü aktivasyonu gösteren bir eGFP tabanlı muhabiri istihdam ederek bu ko-kültür sistemi pratik bir uygulama nitelendirdi. Bir de 1) yüksek çözünür...

<table border="1"><tbody><tr><td> Fetal bovin serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td> nöron cutlure orta nöron kaplama için </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4135 </td><td> astrosit kültür ortamı için </td></tr><tr><td> Glial türetilen sinir faktörü </td><td> Ar-Ge sistemleri </td><td> 212-GD </td><td> Odanın nöron tarafına 10-20 ng / ml Uygula </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiye kartal orta yüksek glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 11995 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mm hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Steril cam alt tabak </td><td> Mattek Corporation, </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikroakışkan kültür platformları </td><td> Xona Mikroakiskan LLC </td><td> SND150 </td><td></td></tr><tr><td> Kültür plakasının 6 kuyu </td&gt; <td> Cellstar </td><td> 657 160 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Neuron kültür ortamı <ul><li> Neurobasal orta </li><li> % 2 B27 Neurobasal takviyesi </li><li> % 1 100x GlutaMAX eklenmesi ile 2 mM glutamat </li><li> % 1 Penisilin-streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Kaplama hücre Nöron kültür ortamı <ul><li> Neurobasal orta </li><li> % 2 B27 Neurobasal takviyesi </li><li> % 1 100x GlutaMAX eklenmesi ile 2 mM glutamat </li><li> % 1 Penisilin-streptomysin </li><li> % 5 fetal sığır serumu SH30070.03 </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Astrosit kültür ortamı <ul><li> Dulbecco modifiye eagle orta yüksek glukoz </li><li> % 10 fetal bovin serumu F4135 </li><li> % 1 Penisilin-streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Mikroakışkan kültür platformu tabanlı nöronal akson ve glia ko-kültür sisteminde kullanılan Tablo 1. Malzemeler. </td></tr></tbody></table>

mikroakışkan kültür platformu glia etkileşimi (mcp) tabanlı nöronal akson ve glia co-kültür sistemi nöron görüntülenmesi analizi

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Glia etkileşim Uygun nöron merkezi sinir sistemi (MSS) fizyolojik fonksiyonu için önemlidir. Bu çift yönlü iletişim sophisticatedly nöron ve glia 1,2 arasında belirli sinyal yolakları aracılık etmektedir. Bu sinyal yollarının tanımlanması ve karakterizasyonu glia etkileşim şekilleri MSS fizyolojisi nasıl nöronun anlayışı esastır. Önceleri, nöron ve glia karışık kültürlerin yaygın nöron ve glia arasındaki sinyal yolları test ve karakterizasyonu için kullanılmıştır. In vivo araçları bu müstahzarlar ve diğer öğrendim Ne Ancak, nöron ve glia arasında karşılıklı sinyalleşme sıklıkla nöronlar (yani, akson, dendrit veya soma) 3 içinde belirli bölümlerinde meydana geldiğini öne sürdü. Bu önemli nöronal bölmeleri ayrılması olanak sağlayan yeni bir kültür sistemi geliştirmek için yapar ve özellikle glia ve nöro arasındaki etkileşimi inceliyornal akson / dendrit. Buna ek olarak, geleneksel bir karışık kültür sisteminde çözünür faktörler ve nöron ve glia arasında doğrudan bir kontak sinyali ayırıcı zar yeteneğine sahip değildir. Ayrıca, geleneksel ko-kültür sisteminde nöronların ve glial hücreler ve büyük miktarda, tek bir akson ve bir glial hücre arasındaki etkileşimi gözlemlemek için gerekli çözünürlüğü yoksundur. Bu çalışmada, bir mikroakışkan kültür platformu (MCP) kullanılması ile bir yeni akson ve glia ko-kültür sistemi açıklanmaktadır. Bu ko-kültür sisteminde, nöronlar ve glial hücreler birden santral kanallar aracılığıyla bağlanan iki ayrı odalarında kültüre. Bu mikroakışkan kültür platformu, sadece nöronal süreçleri (özellikle aksonlar) merkezi kanallardan glial tarafında girebilirsiniz. Güçlü floresan protein etiketleme ile birlikte, bu sistem, böyle bir akson / dendrit ve glial etkileşimler arasındaki sinyal yolakları, direkt bakı sağlarnöronal terminalleri glia, glia-aracılı reseptör ticareti, ve glia-aracılı akson büyüme ler akson-aracılı transkripsiyonel düzenleme. Odasının çapı önemli derecede dar akson / dendrit ve glial yüzeyler arasındaki doğrudan zar protein etkileşimi kolaylaştırmak sondalama, glial odasına nöron-zenginleştirilmiş orta akışını engeller.

Astrositlerde akson indüklenen GLT1 organizatörü aktivasyon Time-lapse görüntüleme analizi Bölmeli nöron ve astrosit ko-kültür sistemi sadece nöronal süreçleri, özellikle aksonlar, seçici astrositler ile etkileşim sağlar. Monte MCP içinde akson ve astrosit (veya diğer glial hücreler) ko-kültür başarılı kurulmasını takiben, akson-glia etkileşimleri farklı tür olarak ele alınabilir; Astroglial gen promoter aktivasyonu, astrosit indüklenen akson rehberlik akson indüklenen aktivasyonu , akson indük...

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Uygun nöron-glia etkileşimi, merkezi sinir sisteminin (MSS) fizyolojik fonksiyonu için kritiktir. Bu çift yönlü iletişim ...

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanarak nöron-glia etkileşimlerini analiz etmek için yeni bir nöronal akson ve astroglia ko-kültür platformu kurmaktadır. İlk olarak, mikroakışkan kültür odasını birleştirin, nöronal kültürleri hazırlayın ve nöronal aksonların MCP'nin diğer tarafına girmesini sağlayın. Ardından, bölmelendirilmiş bir ko-kültür sistemi oluşturmak için kültürlenmiş astrositler ekleyin; konfokal immünofloresan mikroskopi ile zaman serili görüntüleme dahil olmak üzere elde edilen sonuçlar, aksonlar, astroglia ve nöronal aksonlar arasındaki etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, nöronal süreçlerin etkisini, GT-1 regülasyonu üzerindeki nöronal salgılamanın etkisinden ayırmaya çalışırken edindik. Genellikle, yönteme yeni başlayan kişiler aksonların hücresel bölmenin diğer kısımlarına yönlendirilmesinde zorluk yaşarlar. Bu işlem, nöronal tarafa ekilmiş, merkezi kanalların yakınında konumlanmış sağlıklı ve yüksek yoğunluklu nöronlar gerektirir.MCP açık odacıkları, farklı hücre tiplerinin bölmeli kültürleri için tasarlanmıştır; nöronların ve astrositlerin ko-kültür şeklinde ekimi için poliüretan ve laminin kaplamaları gereklidir. İlk olarak, steril cam tabanlı kaplara mililitre başına bir miligram poliüretan çözeltisi uygulayın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Kaplanmış cam tabanlı kapları çift distile su ile üç kez yıkayın ve ardından kuruması için steril bir çeker ocak altına yerleştirin.Ardından, tabağı 1 mg/mL laminin ile kaplayın ve bir saat boyunca UV ışığı altında kurutun. Cam tabanlı kap üzerindeki MCP düzeneği, kullanım öncesinde taze olarak hazırlanmalıdır. Mikroakışkan kültür platformunu, alt tarafındaki merkezi bağlantı kanalları gelecek şekilde konumlandırın ve kaplanmış cam ile sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.Alt kaplar. Monte edilmiş MCP'nin her iki tarafına standart nöron veya astrosit kültür ortamları ekleyin. Hazneyi 37 °C'de iki ila dört saat boyunca inkübe edin ve MCP ile cam arasında sızıntı olmadığını doğrulayın.Alt kap. Kortikal nöronal hücre kültürleri, 14 ila 16 günlük embriyonik fare beyinlerinden taze olarak hazırlanır. Fare beyninin diseksiyonunu takiben, diseksiyon mikroskobu altında korteksteki meningesler uzaklaştırılır.Dokuyu küçük doku blokları haline getirmek için bir jilet kullanın ve santrifüj işleminden sonra kıyılmış doku bloklarını bir tüpe yerleştirin. Peletin üzerindeki medyumu dökün; %0.05 Tryin ekleyin ve 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika bekletin. Hücreleri, ucu ateşle cilalanmış bir pasta pipetiyle nazikçe tritasyon yaparak ayrıştırın.Nöron ekim işlemi için berrak bir nöronal hücre süspansiyonu toplamak amacıyla, numuneyi 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. %5 FBS ile desteklenmiş besiyeri ekleyin. Hazırlanmış MCP plakasının sağ tarafına 150 microliters nöron ekleyin.Sadece hücre tutma alanına tutunan nöronlar, merkezi kanallar aracılığıyla monte edilmiş MCP'nin diğer tarafına doğru aksonlar büyütebildiği için yüksek nöron yoğunluğu sağlanır. Ertesi gün, hücre ekim alanındaki besiyerini dikkatlice aspire edin ve nöron ekim besiyerini standart nöron kültürü besiyeri ile değiştirin.Besiyerine, odağının astrosit tarafına mililitre başına 20 nanogram glial türevli nörotrofik faktör veya GDNF ekleyin. Bu işlem, birleştirilmiş MCP'nin merkez kanalları boyunca nöronal taraftan akson çıkışını teşvik edecek bir kimyasal gradyan oluşturur. İki gün sonra, merkez kanala giren aksonları takip edin.Aksonlar merkezi kanala girdikten sonra, genellikle bir gün içinde karşı tarafa geçerler. Aksonlar, karşı tarafa geçtikten sonra normalde en az bir hafta boyunca sağlam kalırlar. Bir ila üç günlük fare yavrularından beyni disosiye ettikten sonra, astrositleri poliüretan kaplı 10 santimetrelik kaplara ekerim.Hücreleri gece boyunca kültüre edin, sonraki iki gün boyunca astrosit kültür ortamını günlük olarak yenileyin ve ardından yedi gün sonra, astrositler %90 konfluensle tek bir tabaka oluşturduğunda her üç günde bir trypsin kullanarak hücreleri hasat edin. Nöronlar ekildikten yaklaşık beş gün sonra GDNF'yi aspire edin. Ardından, resüspande edilmiş astrositlerin 150 µL'sini birleştirilmiş MCP'nin sol tarafına ekleyin. Astrositlerin yeniden ekilmesinin ardından, aksonlar girmek üzereyken veya yeni girdiklerinde, birleştirilmiş MCP'nin sol tarafına giren aksonlar, ya doğrudan aksonal temasla ya da çözünür faktörlerin salınımı yoluyla astrositlerle doğrudan etkileşime girer.Astrositlerin hücre tutma alanına yapışmasını takip edin. Aksonlar ve astrositler arasındaki etkileşimde rol oynayanlar gibi spesifik proteinleri görselleştirmek için bölmelendirilmiş ko-kültür sistemindeki hücreleri immün boyayın. Bölmelendirilmiş nöron ve astrosit ko-kültür sistemi, yalnızca nöronal uzantıların, özellikle de aksonların astrositlerle seçici olarak etkileşime girmesine olanak tanır.Burada, astroglia glutamat taşıyıcısının aksonla tetiklenen transkripsiyonel aktivasyonunu tanımlıyoruz. Bu çalışmalar, GT1 genomik promotör kontrolü altında bir EGF floresan raporer ekspresyonuna sahip transgenik fareleri kullanmaktadır. Birleştirilmiş MCPA'nın hücre tutma bölgesinde yüksek yoğunlukta nöronlar kültüre edilmiştir; büyütülmüş görünüm, merkezi kanalları geçen ve diğer tarafa giren aksonları göstermekte olup, beta three tubulin boyaması akson büyüme konisini ortaya çıkarmaktadır.MCP sistemi, akson demetlerinin merkezi kanal boyunca büyümelerinin ve karşı tarafa girişlerinin izlenmesine olanak tanır. GT one için yapılan immün boyama, MCP sisteminin glial tarafında ortaya çıkan astrositleri tanımlar. Görüntü, aksonlar ile GLT one pozitif astrositler arasındaki teması göstermektedir.EGFP raporörünün ekspresyonu, endojen GT one promotör aktivasyonu, protein ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite ile korelasyon gösterir. C two'daki tekil astrositlerde GT one promotör aktivitesinin değerlendirilmesi, kompartmanize edilmiş ko-kültür sisteminde anlamlı düzeyde artmış GLT one immünreaktivitesini göstermektedir. Önemle, MCP sistemi, dinamik değişimleri izlemek için zaman ayarlı (time-lapse) görüntülere olanak tanır.Örneğin bu veriler, astrositlerin ekilmesinden bir gün sonra, back GT one EGFP astrositler ve vahşi tip nöronlar ile aksonla tetiklenen GT one promotör aktivasyonunu göstermektedir. Çok düşük düzeyde EGFP floresansı gözlemlenir. Aksonların astrosit tarafına iyice ilerlediği ve buradaki astrositlerle doğrudan temas ederek etkileşime girdiği ko-kültürün 48. saatinde EGFP yoğunluğu önemli ölçüde artar.Kurulmuş MCP'nin nöronal tarafına uygulanan kinin tedavisi, nöronal hücre ölümünü tetikledi. İlginç bir şekilde, bu işlem aksonal EGFP floresansındaki azalmanın yanı sıra akson geri çekilmesini ve dejenerasyonunu da stimüle etti. Aksonlara yanıt olarak EGFP floresans yoğunluğunda gözlenen bu dinamik değişiklikler, Astroglia GT 1 promotör aktivitesinin akson etkileşimi ile modüle edildiğini açıkça göstermiştir.Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan kültür platformu kullanılarak temel kültür sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız; bu teknik bir kez kavrandığında, birkaç gün içinde uygun şekilde uygulanabilir.

imaging-analysis-neuron-to-glia-interaction-microfluidic-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

BioMEMS: Biyologlar ve Mühendisler Arasında Yeni İşbirlikleri Dövme

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Bu video, çok elektrotlu dizilere sahip bir mikroakışkan cihaz kullanılarak hiPSC'den türetilmiş kortikal glutamaterjik nöronların ve glioma hücrelerinin bir ko-kültüründe nöronal elektriksel aktivitenin değerlendirmesini göstermektedir.

Bir ko-kültürde glutamaterjik nöronlar ve glioma hücreleri etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Son çalışmalar, yüksek dereceli pediatrik glioma (pHGG) hücreleri üzerindeki nöronal etkiyi ve bunların karşılıklı etkileşimlerini ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, pHGG hücrelerini ve glutamaterjik nöronları birlikte kültleyen bir in vitro modelin gelişimini göstermektedir ve bu etkileşimleri taklit etmek için elektrofizyolojik etkileşimlerini kaydetmektedir.

Glutamaterjik Nöronların ve Pediatrik Yüksek Dereceli Glioma Hücrelerinin Mikroakışkan Cihazlara Ortak Kültürü Elektriksel Etkileşimleri Değerlendirmek İçin

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Bu protokol, aksonal yaralanma sonrası nöronal metabolik dinamikleri modelleyen, görüntüleme, çoklu omik analiz ve içsel metabolik yeniden şekillenmenin mekanik çalışmalarını mümkün kılan bir mikroakışkan sistemi tanımlar.

Aksonal Yaralanma Modelleri Yapımı ve Çoklu Omik Analizin Etkinleştirilmesi için Mikroakışkan Çip

Öğrenin mikroakışkan kültür platformu kullanarak nöronal akson ve astroglia ko-kültür sistemini kurmayı. Bu yöntem yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile nöron-glia etkileşimlerini detaylı analiz etmenizi sağlar.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi (Video) | JoVE Journal

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Daha fazla video keşfet