Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanarak nöron-glia etkileşimlerini analiz etmek için yeni bir nöronal akson ve astroglia ko-kültür platformu oluşturur. İlk olarak, mikroakışkan kültür odasını kurun, nöronal kültürleri hazırlayın ve nöronal aksonların MCP'nin diğer tarafına girmesini sağlayın. Ardından, bölmelendirilmiş bir ko-kültür sistemi kurmak için kültürlenmiş astrositleri ekleyin; konfokal immünofloresan mikroskopi ile zaman ayarlı görüntüleme dahil olmak üzere elde edilen sonuçlar, aksonlar, astroglia ve nöronal aksonlar arasındaki etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, nöronal süreçlerin etkisini nöronal sekresyonun GT-1 düzenlemesi üzerindeki etkisinden ayırmaya çalışırken ortaya çıktı. Genellikle, yöntemde yeni olan kişiler aksonları hücresel bölmenin diğer kısmına yönlendirmekte zorlanırlar. Bu durum, nöronal tarafa yüksek yoğunlukta sağlıklı nöron ekilmesini ve nöronların merkezi kanalların yakınına yerleştirilmesini gerektirir.

MCP açık odacıkları, farklı hücre tiplerinin bölmeli kültürleri için tasarlanmıştır; nöronların ve astrositlerin ko-kültürde ekilmesi için poliüretan ve laminin kaplamaları gereklidir. İlk olarak, steril cam tabanlı kaplara bir miligram/mililitre poliüretan çözeltisi uygulayın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Kaplanmış cam tabanlı kapları çift distile su ile üç kez yıkayın ve ardından kurumaları için steril bir çeker ocak altına yerleştirin.

Ardından, kabı 1 mg/mL laminin ile kaplayın ve bir saat boyunca UV ışığı altında kurutun. Cam tabanlı kap üzerindeki MCP kurulumu, kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. Mikroakışkan kültür platformunu, alt tarafındaki merkezi bağlantı kanalları gelecek şekilde konumlandırın ve kaplanmış cam ile sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.

Alt kaplar. Birleştirilmiş MCP'nin her iki tarafına standart nöron veya astrosit kültür ortamları ekleyin. Hazneyi 37 °C'de iki ila dört saat boyunca inkübe edin ve MCP ile cam arasında sızıntı olmadığını doğrulayın.

Alt kap. Kortikal nöronal hücre kültürleri, 14 ila 16 günlük embriyonik fare beyinlerinden taze olarak hazırlanır. Fare beyninin diseksiyonunun ardından, korteksteki meningesler diseksiyon mikroskobu altında uzaklaştırılır.

Dokuyu küçük doku blokları halinde kıymak için bir jilet kullanın ve santrifüj sonrası kıyılmış doku bloklarını bir tüpe yerleştirin. Peletin üzerindeki besiyerini uzaklaştırın ve 37 °C su banyosunda 10 dakika boyunca %0,05 Trypsin ekleyin. Hücreleri, ucu ateşle pürüzsüzleştirilmiş bir pasta pipeti ile nazikçe tritüre ederek ayrıştırın.

Nöron ekimlemesi için kullanılan, %5 FBS ile desteklenmiş besiyerini kullanarak berrak bir nöronal hücre süspansiyonu toplamak amacıyla numuneyi 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Kurulmuş MCP plağının sağ tarafına 150 microliters nöron ekleyin.

Hücre tutma alanına tutunan nöronlar, monte edilmiş MCP'nin merkezi kanalları aracılığıyla karşı tarafa akson büyütebildikleri için yüksek bir nöron yoğunluğu oluşur. Ertesi gün, ortamın hücre ekim alanındaki besiyerini dikkatlice aspire edin ve nöron ekim besiyerini standart nöron kültürü besiyeri ile değiştirin.

Besiyerine, odağındaki astrosit tarafına mililitre başına 20 nanogram glia kaynaklı nörotrofik faktör veya GDNF ekleyin. Bu işlem, monte edilen MCP'nin merkezi kanalları boyunca nöronal taraftan akson uzamasını tetiklemeye yardımcı olacak bir kimyasal gradyan oluşturur. İki gün sonra, merkezi kanala giren aksonları izleyin.

Aksonlar merkezi kanala girdikten sonra, genellikle bir gün içinde diğer tarafa geçerler. Aksonlar, diğer tarafa geçtikten sonra normalde en az bir hafta boyunca sağlam kalırlar. Bir ila üç günlük fare yavrularından beyin dokusunu ayrıştırdıktan sonra, astrositleri poliüretan kaplı 10 santimetrelik kaplara ekerim.

Hücreleri gece boyunca kültüre edin, sonraki iki gün boyunca astrosit kültür ortamını günlük olarak yenileyin ve ardından, astrositler %90 konfluens düzeyinde bir tek tabaka oluşturduğunda yedinci günden itibaren her üç günde bir yenileyin; hücreleri tripsin kullanarak hasat edin. Nöronlar ekildikten yaklaşık beş gün sonra GDNF'yi aspire edin. Ardından, yeniden süspanse edilen astrositlerden 150 µL'yi monte edilmiş MCP'nin sol tarafına ekin. Astrositlerin yeniden ekilmesinin ardından, aksonlar girmek üzereyken veya yeni girmişken, monte edilmiş MCP'nin sol tarafına giren aksonlar, ya doğrudan aksonal temas ya da çözünür faktörlerin salınımı yoluyla astrositlerle doğrudan etkileşime girer.

Astrositlerin hücre tutma alanına tutunup tutunmadığını izleyin. Aksonlar ve astrositler arasındaki etkileşimde rol oynayanlar gibi spesifik proteinleri görselleştirmek için bölmelendirilmiş ko-kültür sistemindeki hücreleri immünboyayın. Bölmelendirilmiş nöron ve astrosit ko-kültür sistemi, yalnızca nöronal süreçlerin, özellikle de aksonların astrositlerle seçici olarak etkileşime girmesine olanak tanır.

Burada, astroglia glutamat taşıyıcısının akson kaynaklı transkripsiyonel aktivasyonunu tanımlıyoruz. Bu çalışmalarda, GT1 genomik promotör kontrolü altında bir EGF floresan raporlayıcı ekspresyonuna sahip transgenik fareler kullanılmıştır. Birleştirilmiş MCPA'nın hücre tutma alanında yüksek yoğunlukta nöronlar kültüre edilmiştir; büyütülmüş görünüm, merkezi kanalları geçen ve beta-3 tübülin boyamasının akson büyüme konilerini ortaya çıkardığı diğer tarafa giren aksonları göstermektedir.

MCP sistemi, akson demetlerinin merkezi kanal boyunca büyümelerini ve karşı tarafa girişlerini izlemeye olanak tanır. GT one için yapılan immün boyama, MCP sisteminin glial tarafında ortaya çıkan astrositleri tanımlar. Görüntü, burada aksonlar ile GLT one pozitif astrositler arasındaki teması göstermektedir.

EGFP raporerinin ekspresyonu, endojen GT one promotör aktivasyonu, protein ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite ile korelasyon gösterir. C two'daki tekil astrositlerde GT one promotör aktivitesinin değerlendirilmesi, kompartmanize edilmiş ko-kültür sisteminde GLT one immünreaktivitesinde anlamlı bir artış olduğunu göstermektedir. Önemli bir nokta olarak, MCP sistemi dinamik değişikliklerin izlenmesi için zaman ayarlı (time-lapse) görüntülere olanak tanır.

Örneğin, bu veriler, astrositlerin ekilmesinden bir gün sonra, GT1 EGFP astrositler ve vahşi tip nöronlarla birlikte akson kaynaklı GT1 promotör aktivasyonunu göstermektedir. EGFP floresansı oldukça minimum düzeyde gözlemlenir. Aksonlar astrosit tarafına iyice ilerlediğinde ve burada astrositlerle doğrudan temas kurarak etkileşime girdiğinde, ko-kültürden 48 saat sonra EGFP yoğunluğu önemli ölçüde artar.

Kurulmuş MCP'nin nöronal tarafına uygulanan kinin tedavisi, nöronal hücre ölümünü tetikledi. İlginç bir şekilde, bu tedavi aynı zamanda akson retraksiyonunu ve dejenerasyonunu uyardığı gibi aksonal EGFP floresanında azalmaya da neden oldu. Aksonlara yanıt olarak EGFP floresan yoğunluğunda meydana gelen bu dinamik değişiklikler, Astroglia GT 1 promotör aktivitesinin akson etkileşimi tarafından modüle edildiğini açıkça göstermiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan kültür platformunu kullanarak temel kültür sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız; bu teknik bir kez ustalıkla öğrenildiğinde, birkaç gün içinde uygun şekilde uygulanabilir.