Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanarak nöron-glia etkileşimlerini analiz etmek için yeni bir nöronal akson ve astroglia ko-kültür platformu kurmaktadır. İlk olarak, mikroakışkan kültür odasını birleştirin, nöronal kültürleri hazırlayın ve nöronal aksonların MCP'nin diğer tarafına girmesini sağlayın. Ardından, bölmelendirilmiş bir ko-kültür sistemi oluşturmak için kültürlenmiş astrositler ekleyin; konfokal immünofloresan mikroskopi ile zaman serili görüntüleme dahil olmak üzere elde edilen sonuçlar, aksonlar, astroglia ve nöronal aksonlar arasındaki etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemle ilgili ilk fikri, nöronal süreçlerin etkisini, GT-1 regülasyonu üzerindeki nöronal salgılamanın etkisinden ayırmaya çalışırken edindik. Genellikle, yönteme yeni başlayan kişiler aksonların hücresel bölmenin diğer kısımlarına yönlendirilmesinde zorluk yaşarlar. Bu işlem, nöronal tarafa ekilmiş, merkezi kanalların yakınında konumlanmış sağlıklı ve yüksek yoğunluklu nöronlar gerektirir.

MCP açık odacıkları, farklı hücre tiplerinin bölmeli kültürleri için tasarlanmıştır; nöronların ve astrositlerin ko-kültür şeklinde ekimi için poliüretan ve laminin kaplamaları gereklidir. İlk olarak, steril cam tabanlı kaplara mililitre başına bir miligram poliüretan çözeltisi uygulayın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Kaplanmış cam tabanlı kapları çift distile su ile üç kez yıkayın ve ardından kuruması için steril bir çeker ocak altına yerleştirin.

Ardından, tabağı 1 mg/mL laminin ile kaplayın ve bir saat boyunca UV ışığı altında kurutun. Cam tabanlı kap üzerindeki MCP düzeneği, kullanım öncesinde taze olarak hazırlanmalıdır. Mikroakışkan kültür platformunu, alt tarafındaki merkezi bağlantı kanalları gelecek şekilde konumlandırın ve kaplanmış cam ile sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.

Alt kaplar. Monte edilmiş MCP'nin her iki tarafına standart nöron veya astrosit kültür ortamları ekleyin. Hazneyi 37 °C'de iki ila dört saat boyunca inkübe edin ve MCP ile cam arasında sızıntı olmadığını doğrulayın.

Alt kap. Kortikal nöronal hücre kültürleri, 14 ila 16 günlük embriyonik fare beyinlerinden taze olarak hazırlanır. Fare beyninin diseksiyonunu takiben, diseksiyon mikroskobu altında korteksteki meningesler uzaklaştırılır.

Dokuyu küçük doku blokları haline getirmek için bir jilet kullanın ve santrifüj işleminden sonra kıyılmış doku bloklarını bir tüpe yerleştirin. Peletin üzerindeki medyumu dökün; %0.05 Tryin ekleyin ve 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika bekletin. Hücreleri, ucu ateşle cilalanmış bir pasta pipetiyle nazikçe tritasyon yaparak ayrıştırın.

Nöron ekim işlemi için berrak bir nöronal hücre süspansiyonu toplamak amacıyla, numuneyi 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. %5 FBS ile desteklenmiş besiyeri ekleyin. Hazırlanmış MCP plakasının sağ tarafına 150 microliters nöron ekleyin.

Sadece hücre tutma alanına tutunan nöronlar, merkezi kanallar aracılığıyla monte edilmiş MCP'nin diğer tarafına doğru aksonlar büyütebildiği için yüksek nöron yoğunluğu sağlanır. Ertesi gün, hücre ekim alanındaki besiyerini dikkatlice aspire edin ve nöron ekim besiyerini standart nöron kültürü besiyeri ile değiştirin.

Besiyerine, odağının astrosit tarafına mililitre başına 20 nanogram glial türevli nörotrofik faktör veya GDNF ekleyin. Bu işlem, birleştirilmiş MCP'nin merkez kanalları boyunca nöronal taraftan akson çıkışını teşvik edecek bir kimyasal gradyan oluşturur. İki gün sonra, merkez kanala giren aksonları takip edin.

Aksonlar merkezi kanala girdikten sonra, genellikle bir gün içinde karşı tarafa geçerler. Aksonlar, karşı tarafa geçtikten sonra normalde en az bir hafta boyunca sağlam kalırlar. Bir ila üç günlük fare yavrularından beyni disosiye ettikten sonra, astrositleri poliüretan kaplı 10 santimetrelik kaplara ekerim.

Hücreleri gece boyunca kültüre edin, sonraki iki gün boyunca astrosit kültür ortamını günlük olarak yenileyin ve ardından yedi gün sonra, astrositler %90 konfluensle tek bir tabaka oluşturduğunda her üç günde bir trypsin kullanarak hücreleri hasat edin. Nöronlar ekildikten yaklaşık beş gün sonra GDNF'yi aspire edin. Ardından, resüspande edilmiş astrositlerin 150 µL'sini birleştirilmiş MCP'nin sol tarafına ekleyin. Astrositlerin yeniden ekilmesinin ardından, aksonlar girmek üzereyken veya yeni girdiklerinde, birleştirilmiş MCP'nin sol tarafına giren aksonlar, ya doğrudan aksonal temasla ya da çözünür faktörlerin salınımı yoluyla astrositlerle doğrudan etkileşime girer.

Astrositlerin hücre tutma alanına yapışmasını takip edin. Aksonlar ve astrositler arasındaki etkileşimde rol oynayanlar gibi spesifik proteinleri görselleştirmek için bölmelendirilmiş ko-kültür sistemindeki hücreleri immün boyayın. Bölmelendirilmiş nöron ve astrosit ko-kültür sistemi, yalnızca nöronal uzantıların, özellikle de aksonların astrositlerle seçici olarak etkileşime girmesine olanak tanır.

Burada, astroglia glutamat taşıyıcısının aksonla tetiklenen transkripsiyonel aktivasyonunu tanımlıyoruz. Bu çalışmalar, GT1 genomik promotör kontrolü altında bir EGF floresan raporer ekspresyonuna sahip transgenik fareleri kullanmaktadır. Birleştirilmiş MCPA'nın hücre tutma bölgesinde yüksek yoğunlukta nöronlar kültüre edilmiştir; büyütülmüş görünüm, merkezi kanalları geçen ve diğer tarafa giren aksonları göstermekte olup, beta three tubulin boyaması akson büyüme konisini ortaya çıkarmaktadır.

MCP sistemi, akson demetlerinin merkezi kanal boyunca büyümelerinin ve karşı tarafa girişlerinin izlenmesine olanak tanır. GT one için yapılan immün boyama, MCP sisteminin glial tarafında ortaya çıkan astrositleri tanımlar. Görüntü, aksonlar ile GLT one pozitif astrositler arasındaki teması göstermektedir.

EGFP raporörünün ekspresyonu, endojen GT one promotör aktivasyonu, protein ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite ile korelasyon gösterir. C two'daki tekil astrositlerde GT one promotör aktivitesinin değerlendirilmesi, kompartmanize edilmiş ko-kültür sisteminde anlamlı düzeyde artmış GLT one immünreaktivitesini göstermektedir. Önemle, MCP sistemi, dinamik değişimleri izlemek için zaman ayarlı (time-lapse) görüntülere olanak tanır.

Örneğin bu veriler, astrositlerin ekilmesinden bir gün sonra, back GT one EGFP astrositler ve vahşi tip nöronlar ile aksonla tetiklenen GT one promotör aktivasyonunu göstermektedir. Çok düşük düzeyde EGFP floresansı gözlemlenir. Aksonların astrosit tarafına iyice ilerlediği ve buradaki astrositlerle doğrudan temas ederek etkileşime girdiği ko-kültürün 48. saatinde EGFP yoğunluğu önemli ölçüde artar.

Kurulmuş MCP'nin nöronal tarafına uygulanan kinin tedavisi, nöronal hücre ölümünü tetikledi. İlginç bir şekilde, bu işlem aksonal EGFP floresansındaki azalmanın yanı sıra akson geri çekilmesini ve dejenerasyonunu da stimüle etti. Aksonlara yanıt olarak EGFP floresans yoğunluğunda gözlenen bu dinamik değişiklikler, Astroglia GT 1 promotör aktivitesinin akson etkileşimi ile modüle edildiğini açıkça göstermiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan kültür platformu kullanılarak temel kültür sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız; bu teknik bir kez kavrandığında, birkaç gün içinde uygun şekilde uygulanabilir.