Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi

Bu prosedürün genel amacı, xip yumurta ekstraktlarını bir model sistem olarak kullanarak DNA hasar kontrol noktasını incelemektir. İlk olarak, xip yumurtalarından düşük hızlı ekstrakt hazırlayın. Ardından, MMS ve UV ışığı gibi DNA hasarı veren yöntemlerle hasarlı sperm kromatini hazırlayın.

Ayrıca DNA hasarını taklit eden yapıyı hazırlayın. Hasarlı sperm kromatini veya aT70 ile LSE'de DNA hasarı kontrol noktasını tetiklemek için aT70 prosedürünü uygulayın. Sonuç olarak, blotlardan elde edilen veriler, Xenopus yumurta ekstraktındaki aTR-kontrol 1 aracılı DNA hasarı kontrol noktasına dair bilgiler sağlayabilir.

Merhaba. Ben UNC Charlotte biyoloji bölümünden CH Y. Bugün size, damage tech point sinyalizasyonundaki hasarı araştırmak için model sistem olarak pus ekstraktının nasıl kullanıldığını göstereceğiz.

Bu yöntem, DNA hasar kontrol noktasının nasıl aktive olduğu gibi dinamik instabilite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokol, hem opus yumurta özütünün hem de DNA hasar kontrol noktasını indükleyen reaktiflerin hazırlanması ile DNA hasar kontrol noktasının ve xap'ın analizine yöneliktir. Bu teknikler, dört NQO ve etoposid dahil olmak üzere çeşitli DNA hasarı verme yaklaşımlarına uyarlanabilir.

DNA hasar kontrol noktasını incelemek için başlayalım. Dişi kurbağaları deri altına priming yapmak için, dorsal lenf keselerine 100 ünite PMSG enjekte edin. Priming sonrası en az iki gün bekledikten sonra, her bir primed kurbağanın dorsal lenf kesesine deri altına 500 ünite insan koriyonik gonadotropini enjekte ederek yumurta bırakımını indükleyin; enjekte edilen kurbağaları, iki litre Marx modifiyeli ringer çözeltisi içeren ayrı kovalarda 14 ila 20 saat boyunca inkübe edin.

Kurbağaları kovalardan çıkarın ve MMR çözeltisini yaklaşık 100 mililitre kalana kadar dökün. Ardından yumurtaları kovalardan 250 mililitrelik bir behere aktarın; yaklaşık her 30 saniyede bir 100 mililitre %2 sisteini pH 7.8 ekleyerek yumurtaların jölemsi tabakasını çözün. Yumurtaları, 0,7 santimetre çapında ters çevrilmiş bir cam pastoral pipetle nazikçe karıştırın, ardından sisteini çözeltisini döküp taze sisteini ile iki kez değiştirin.

Detaylandırma işlemi yaklaşık beş ila 15 dakika içinde tamamlanacaktır. Yumurtalar beherin dibinde daha yoğun bir tabaka oluşturduğunda, sisteini çözeltisini boşaltın ve yumurtaları 0.25 XMMR çözeltisi ile üç kez yıkayın. Yumurtaları cam bir pipetle hafifçe karıştırın ve beherin merkezinde toplanma eğilimi gösteren, şişkin beyaz bozuk yumurtaları kontrol edin.

Bozuk yumurtaları bir pastör pipeti ile uzaklaştırın. Ardından, yumurtaları üç kez yumurta liziz tamponu ile yıkayın. Varsa diğer bozuk yumurtaları temizleyin ve ardından yumurtaları 14 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın.

Yumurtaları 188 ×g'de 55 saniye boyunca santrifüj ederek sıkıştırın. Salıncak kovalı rotorlu klinik bir masaüstü santrifüj kullanarak, yumurta tabakasının üzerindeki fazla pufereyi uzaklaştırın. Şimdi, sıkıştırılmış yumurtaların her mililitresi için 0,5 µL 10 mg/mL aprotinin, leptin veya AL ve 0,5 µL 5 mg/mL sitokin B veya cyto B ekleyin; yumurtaları 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.500 ×g'de santrifüjleyin. HB 6 salıncak kovalı rotorlu Sarva RC 6 plus süper hızlı santrifüj kullanıldığında, santrifüj sonrası yumurtalar tüpte üç tabakaya ayrılır: yukarıdan aşağıya sırasıyla lipid özütü ve vitellus pigmenti. Falcon tüpünün yan kısmını, orta özüt tabakasının alt bölümünden 21 gauge iğne ile delin.

Plastik malzeme tarafından engellenebileceği için ponksiyon iğnesini dikkatlice çıkarın. Ekstraktı toplamak için, bir mililitrelik bir şırıngaya takılı taze bir 21 gauge iğneyi ponksiyon bölgesine yerleştirin.

Lipit ve yumurta sarısı pigment katmanlarıyla kontaminasyondan ve hava kabarcıklarından kaçınarak ekstreyi yavaşça aspire edin. Ekstreleri soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Her bir mililitre yumurta ekstresi için 10 mikrolitre 10 miligram/mililitre ekleyin.

10 mg/mL'den bir µL sikloheksimid. Bir µL 5 mg/mL leptin, bir µL 1 M DTT ve 10 mg/mL'den 0,33 µL sitokin B. Yumurta özütü en az 10 kez nazikçe tersyüz edilerek karıştırılmalıdır, ancak LSE kalitesi bozulduğu için düşük hızda hazırlanan özüt dört saat içinde kullanılmalıdır.

Dört saat sonra veya serbest çözünme gerçekleştiğinde, iki sentetik oligonükleotidi mikrolitre başına iki mikrogram konsantrasyonda suda çözün. Her bir oligodan 100 mikrolitreyi 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve 95 °C sıcaklıktaki bir ısıtma bloğunda beş dakika inkübe edin. Oligo karışımını içeren tüple birlikte kuru banyo bloğunu çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın; -20 °C'de saklamak üzere 10 mikrolitrelik alikotlar halinde bölün.

AL örneği şu anda 2 µg/µL nihai konsantrasyonda bir A T 70 dupleksidir. Tudor ve Walter tarafından tarif edildiği şekilde 0,5 mL kromatin ile normal sperm kromatinini hazırlayın. 5,5 µL 9,1 M MMS ekleyin.

Örnek tüpünü, sallanan kova rotorlu ve tüp adaptörlü IE CCL iki klinik santrifüj kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rotatöre yerleştirin. Örneği oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 686 ×g hızda döndürün. Süpernatantı atın ve peleti B-S-A-D-T-T-A proin ve leptin içeren 0,5 mL tampon X ile yıkayın.

Bu işlemi üç kez tekrarlayın ve pellet'i 0,5 mililitre Tampon x içerisinde yeniden süspanse edin. Sperm kromatin konsantrasyonunu bir hemositometre ile belirleyin.

Ardından numuneyi mikrolitre başına 100.000 sperm olacak şekilde dilüe edin ve beş mikrolitrelik alikotları -80 °C'de saklayın. Bir parfilm parçasına istenen miktarda normal sperm kromatinini ekleyin ve numuneyi bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. İstenen enerji parametresini ayarlayın ve UV ışığı ile sperm kromatinini hasarlamaya başlayın.

Hazırlanan düşük hızlı özütte DNA hasarı kontrol noktasını tetiklemek için UV işleminden geçmiş sperm kromatinini hemen kullanın. 50 µL LSE, 1 µL enerji karışımı ve 2 µL hasarlı sperm kromatinini birleştirin. Reaksiyonu oda sıcaklığında 90 dakika boyunca inkübe edin; ilk 30 dakikadan sonra her 10 dakikada bir tüpü hafifçe vurarak karıştırmayı unutmayın.

İnkübasyon için, bir mikroskop lamı üzerine bir mikrolitre reaksiyon karışımı damlatın ve bir mikrolitre nükleer boya solüsyonu ekleyin. Bir lam pili yerleştirin ve floresan mikroskobu aracılığıyla çekirdek oluşumunu kontrol edin. Genellikle, 30 dakikalık inkübasyonun ardından DNA replikasyonunun başladığını gösteren yuvarlak çekirdekler oluşacaktır.

Ayrıca, reaksiyon karışımının 10 µL'sini anti check one antikorlarını kullanarak immünoblotlama ile değerlendirin. Bir mikrosantrifüj tüpünde 50 µL LSE, 1 µL enerji karışımı ve 1,6 µL toto mycin stok çözeltiyi birleştirin. Ardından, 2 µg/µL'lik T 70 DNA dupleksinden 1,25 µL veya negatif kontrol için su ekleyin.

Reaksiyonları oda sıcaklığında 90 dakika boyunca inkübe edin ve reaksiyon tüplerini her 10 dakikada bir hafifçe sallayın. Şimdi, check one proteininin western kan analizi için reaksiyon karışımından 10 µL'yi 90 µL örnek tamponuna ekleyin. Kontrol MMS indüklemesine kıyasla, hasarlı sperm kromatini veya DNA hasarını taklit eden yapı, xop yumurta ekstrakt sistemindeki ATR check one aracılı DNA hasarı kontrol noktasını etkili bir şekilde tetikler.

TR kinaz aktivasyonunun bir göstergesi olan Syrian 3 44'deki check one fosforilasyonunu kontrol edin. Benzer şekilde, DNA hasarını taklit eden bir yapı olan T 70 de check one fosforilasyonunu tetikler. Uzmanlaşıldığında LSE hazırlığı yaklaşık bir saatte tamamlanabilir.

Ekstre kalitesi yaklaşık dört saat sonra azaldığından, hız ve verimlilik esastır. Bu yöntemler, kritik soruları yanıtlamak ve DNA hasarı kontrol noktası sinyalizasyonunu incelemek için diğer yaklaşımlarla birlikte kullanılabilir. Örneğin, bir hedef proteinin DNA hasarı kontrol noktasında gerekli olup olmadığını test etmek için immün tükenme gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, model sistem olarak püskül özütü kullanarak D hasar kontrol noktasının nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.