Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi Xenopus Yumurta ayıklar

Bu prosedürün genel amacı, xip yumurta ekstraktlarını bir model sistem olarak kullanarak DNA hasar kontrol noktasını incelemektir. İlk olarak, xip yumurtalarından düşük hızlı ekstrakt hazırlayın. Ardından, MMS ve UV ışığı gibi DNA hasarı veren yöntemlerle hasarlı sperm kromatini hazırlayın.

Ayrıca DNA hasarını taklit eden yapıyı hazırlayın. Hasarlı sperm kromatini veya a T 70 ile LSE'de DNA hasarı kontrol noktasını tetiklemek için a T 70 prosedürünü uygulayın. Sonuç olarak, blot analizlerinden elde edilen veriler, xenopus yumurta ekstraktındaki a TR check one aracılı DNA hasarı kontrol noktasına dair içgörüler sağlayabilir.

Merhaba. Ben UNC Charlotte biyoloji bölümünden CH Y. Bugün size, damage tech point sinyalizasyonundaki hasarı incelemek için pus ekstraktının nasıl model sistem olarak kullanıldığını göstereceğiz.

Bu yöntem, DNA hasarı kontrol noktasının nasıl aktive olduğu gibi dinamik instabilite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokol, hem opus yumurta özütünün hem de DNA hasarı kontrol noktasını indükleyen reaktiflerin hazırlanması ile DNA hasarı kontrol noktasının ve xap'ın analizini kapsamaktadır. Bu teknikler, 4-NQO ve etoposid dahil olmak üzere çeşitli DNA hasarı verme yaklaşımlarına uyarlanabilir.

DNA hasar kontrol noktasını incelemek için başlayalım. Dişi kurbağaları deri altına ön hazırlık yapmak için, dorsal lenf keselerine 100 ünite PMSG enjekte edin. Ön hazırlıktan sonra en az iki gün bekleyip, her bir hazırlanan kurbağanın dorsal lenf kesesine deri altına 500 ünite insan koryonik gonadotropini enjekte ederek yumurta bırakımını tetikleyin; enjekte edilen kurbağaları, iki litre Marx modifiyeli Ringer çözeltisi içeren ayrı kovalarda 14 ila 20 saat boyunca inkübe edin.

Kurbağaları kovalardan çıkarın ve yaklaşık 100 mililitre kalana kadar MMR çözeltisini dökün. Ardından yumurtaları kovalardan 250 mililitrelik bir behere aktarın; yaklaşık her 30 saniyede bir 100 mililitre %2 sistein pH 7.8 ekleyerek yumurtaların jölesini çözün. Yumurtaları 0,7 santimetre çapında, ters çevrilmiş cam bir pastör pipeti ile nazikçe karıştırın, ardından sisteini iki kez döküp taze sistein ile değiştirin.

Detaylandırma işlemi yaklaşık beş ila 15 dakika içinde tamamlanacaktır. Yumurtalar beherin tabanında daha yoğun bir tabaka oluşturduğunda, sistein çözeltisini dökün ve yumurtaları üç kez 0,25 XMMR çözeltisi ile yıkayın. Yumurtaları bir cam pipetle karıştırın ve beherin merkezinde toplanma eğiliminde olan şişmiş beyaz bozuk yumurtaları kontrol edin.

Bozuk yumurtaları bir pastör pipetiyle uzaklaştırın. Ardından, yumurtaları yumurta lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Varsa diğer bozuk yumurtaları temizleyin ve ardından yumurtaları 14 mililitrelik bir falcon tüpüne boşaltın.

Yumurtaları 188 ×g kuvvetinde 55 saniye boyunca santrifüj ederek sıkıştırın. Sallanan kova rotorlu klinik bir masaüstü santrifüj kullanarak, yumurta tabakasının üzerindeki fazla tampon çözeltiyi uzaklaştırın. Şimdi, sıkıştırılmış yumurtaların her mililitresi için 0,5 µL 10 mg/mL aprotinin, leptin veya AL ve 0,5 µL 5 mg/mL sitokin B veya cyto B ekleyin; yumurtaları 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.500 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Sarva RC 6 Plus süper hızlı santrifüj ve HB 6 sallanan kova rotor kullanıldığında, santrifüjleme sonrası yumurtalar tüp içinde yukarıdan aşağıya doğru sırasıyla lipid özütü ve vitellus pigmenti şeklinde üç tabakaya ayrışır. Falcon tüpünün yan kısmını, orta özüt tabakasının alt bölümünden 21 gauge bir iğne ile delin.

Delme iğnesi plastik tarafından engellenmiş olabileceğinden, iğneyi dikkatlice çıkarın. Özütü toplamak için, bir mililitrelik şırıngaya takılı yeni bir 21 gauge iğneyi delme bölgesine yerleştirin.

Lipid ve yumurta sarısı pigment tabakalarıyla kontaminasyonu ve hava kabarcıklarını önleyerek ekstrakteyi yavaşça aspire edin. Ekstraktleri soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Her 1 mililitre yumurta ekstrakti için, 10 miligram/mililitre konsantrasyonda 10 mikrolitre ekleyin.

Sikloksimidin 10 mg/mL konsantrasyonunda bir mikrolitresi. Pronin leptin, 5 mg/mL konsantrasyonunda bir mikrolitresi, sitokin B'nin bir molar DTT ile bir mikrolitresi ve 10 mg/mL konsantrasyonunda 0,33 mikrolitresi. Karışım, yumurta özütü en az 10 kez nazikçe tersyüz edilerek karıştırılmalıdır. Ancak LSE kalitesi bozulduğundan, düşük hızdaki özüt dört saat içinde kullanılmalıdır.

Dört saatlik bir sürenin ardından veya serbest çözünme sonrası, iki sentetik oligonükleotidi mikroliter başına iki mikrogram konsantrasyonundaki suda çözün. Her bir oligodan 100 mikrolitreyi 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve 95 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı blokta beş dakika boyunca inkübe edin. Oligo karışımını içeren tüpü kuru banyo bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın; -20 °C'de saklamak üzere 10 mikrolitrelik alikotlar halinde porsiyonlayın.

AL örneği şu anda 2 µg/µL nihai konsantrasyonda bir A T 70 dupleksidir. Tudor ve Walter tarafından tanımlandığı şekilde 0,5 mL kromatin için normal sperm kromatini hazırlayın. 5,5 µL 9,1 M MMS ekleyin.

Numune tüpünü, sallanan kova rotorlu ve tüp adaptörlü IE CCL iki klinik santrifüj kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rotatora yerleştirin. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 686 ×g hızda döndürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i B-S-A-D-T-T-A proini ve leptin içeren 0,5 mL tampon X ile yıkayın.

Bu işlemi üç kez tekrarlayın ve peleti 0,5 mililitre Tampon x içinde yeniden süspande edin. Sperm kromatin konsantrasyonunu bir hemositometre ile belirleyin.

Ardından örneği mikrolitre başına 100.000 sperm olacak şekilde seyreltin ve beş mikrolitrelik alikotları -80 °C'de saklayın. Bir parfilm parçası yüzeyine istenen miktarda normal sperm kromatini ekleyin ve örneği bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. İstenen enerji parametresini ayarlayın ve UV ışığı aracılığıyla sperm kromatinini hasarlamaya başlayın.

Hazırlanan düşük hız ekstresinde DNA hasarı kontrol noktasını indüklemek için UV işlemine tabi tutulmuş sperm kromatinini hemen kullanın. 50 µL LSE, 1 µL enerji karışımı ve 2 µL hasarlı sperm kromatinini birleştirin. Reaksiyonu oda sıcaklığında 90 dakika boyunca inkübe edin ve ilk 30 dakikadan sonra her 10 dakikada bir tüpü hafifçe vurduğunuzdan emin olun.

İnkübasyon aşamasında, bir mikroskop lamı üzerine bir mikrolitre reaksiyon karışımı damlatın ve bir mikrolitre nükleer dice çözeltisi ekleyin. Bir kapatma camı yerleştirin ve floresan mikroskop aracılığıyla çekirdek oluşumunu kontrol edin. Genellikle, 30 dakikalık inkübasyon sonrası yuvarlak çekirdeklerin oluşması DNA replikasyonunun başladığını gösterir.

Ayrıca, reaksiyon karışımının 10 µL'sini anti check one antikorları kullanarak immün blotting ile değerlendirin. Bir mikrosantrifüj tüpünde 50 µL LSE, 1 µL enerji karışımı ve 1,6 µL toto mycin stok çözeltisini birleştirin. Ardından, 2 µg/µL konsantrasyonda T 70 DNA dupleksi veya negatif kontrol için suyun 1,25 µL'sini ekleyin.

Reaksiyonları oda sıcaklığında 90 dakika boyunca inkübe edin ve her 10 dakikada bir reaksiyon tüplerini hafifçe vurun. Şimdi, check one proteininin western kan analizi için reaksiyon karışımından 10 µL'yi 90 µL örnek tamponuna ekleyin. Hasarlı sperm kromatini veya DNA hasarını taklit eden yapı, kontrol MMS indüklemesine kıyasla xop yumurta özütü sistemindeki ATR check one aracılı DNA hasarı kontrol noktasını etkili bir şekilde tetikler.

TR kinaz aktivasyonunun bir göstergesi olan Syrian 3 44'teki check one fosforilasyonunu kontrol edin. Benzer şekilde, DNA hasarını taklit eden bir yapı olan T 70 de check one fosforilasyonunu tetikler. Uzmanlaşıldığında, LSE hazırlama işlemi yaklaşık bir saatte tamamlanabilir.

Ekstrakt kalitesi yaklaşık dört saat sonra azaldığı için hız ve verimlilik esastır. Bu yöntemler, kritik soruları yanıtlamak ve DNA hasarı kontrol noktası sinyalizasyonunu incelemek için diğer yaklaşımlarla birleştirilebilir. Örneğin, bir hedef proteinin DNA hasarı kontrol noktasında gerekli olup olmadığını test etmek için immün tükenme gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, model sistem olarak pus özütü kullanarak D hasar kontrol noktasının nasıl inceleneceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.