Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve

Bu prosedürün genel amacı, davranışsal testler sırasında hipokampal metabolizmayı ölçmektir. Bu işlem, deney hayvanının mikrodiyaliz kılavuz kanülü ile cerrahi olarak hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Test gününde, kanülün içine bir mikrodiyaliz probu yerleştirilir ve PERFUSE akışı doğrulanır.

Ardından, hayvan bir kontrol odasında beklerken probun dengelenmesine izin verilir. Nihayetinde, örneğin glukoz oksidaz, NADP, N-A-D-P-H reaksiyonu ve florimetrik analiz gibi uygun analitik yöntemler kullanılır. Test süreci boyunca metabolizma düzeyini ve/veya nörokimyasal salınımı göstermek için glukoz ölçümü kullanılıyorsa, bu tekniğin en zor yönlerinden biri mikrodiyaliz tüplerinin kullanımında gösterilmesi gereken özenle ilgilidir; zira dikkat edilmediği takdirde hayvanlar tüpleri sıklıkla çiğneyebilir veya hatları birbirine dolayabilir.

Davranışsal testler sırasında hipokampal mikrodiyalizi ilk kez lisansüstü çalışmalarım sırasında kullandım ve mevcut glikoz tedarik modellerinin, glikozun belleği güçlendirmesine ilişkin bilinen psikolojik verilerle gerçekten uyumlu olup olmadığını kontrol etmek istedik. Bu metodoloji, beyne uygulanan mevcut glikoz modellerinin aslında tamamen yanlış olduğunu göstermemize olanak tanıdı.

Standart cerrahi prosedürleri izleyerek hayvanı hazırlayın, kafatasını açığa çıkarın ve kanül yerleşimi için delikler açın. Önceden belirlenmiş koordinatlarda bir kanül yerleştirin ve ardından kanülü yavaşça hedef derinliğe indirin. Doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra, kanülü diş hekimi çimentosu ile sabitleyin.

Gerektiğinde, yarayı kapatmak için steril bir cerrahi sütür kullanın. Son olarak, kanül açıklığını korumak için bir stilet kullanılır. Ardından, mikrodiyaliz için kullanılacak PERFUSE eight cihazını hazırlayın.

Optimum sonuçlar için sıvı kompozisyonunun doğru olmasının esas olduğu unutulmamalıdır. Test gününde sığır serum albümini BSA eklenmeli ve tamamen çözünmelidir. Hazırlama işleminden sonra, PERFUSE eight 0.2 mikronluk bir filtreden süzülmelidir.

Ardından, varsa beyne uygulanacak olan tedaviyi, hazırlanan A ECF'den bir alikot kullanarak hazırlayın. Burada, hipokampusa iletilmek üzere insülin hazırlanmıştır. Taze bir mikrodiyaliz probu ve hattı, testten bir gün önce hazırlanmalıdır.

Giriş ve çıkış için iki ayrı hat oluşturun. İki adet bir metre uzunluğundaki FEP boruyu birbirine bağlamak için PE 50 boru kullanın ve hatlar arasında minimum ölü hacim olduğundan emin olun. PE 50 konnektörlere kolayca yerleştirilebilmesi için borular, gösterildiği gibi uçları eğimli olacak şekilde kesilmelidir.

Giriş borusunu, steril filtrelenmiş deiyonize su ile doldurulmuş bir mililitrelik Hamilton şırıngasına bağlayın ve ölçümler yapılırken hayvanın serbestçe hareket edebilmesi için probu diğer uca takın. Giriş ve çıkış hatlarını iki kanallı bir döner ekleme (swivel) bağlayın. Ardından, çıkış borusunu pompaya bağlayın ve prob üzerindeki çıkış borusundan deiyonize su gelene kadar pompayı 1.5 µL/dakika hızında çalıştırın.

Pompayı kapatın ve çıkış tüpü ile numune toplama tüpü arasındaki diğer hattı bağlayın. Tüpten beş mililitre sıvı geçirin ve prob ucunun her zaman ıslak kaldığından emin olarak probu, steril deiyonize su içeren bir flakonda gece boyunca bekletin. Testten 24 saat önce, sahte stileti çıkararak ve sadece bu amaçla kullanılan bir mikrodiyaliz probu yerleştirerek test deneğini önceden hazırlayın.

Ardından 10 dakika boyunca, sahte probu çıkarın ve sıçanı kafesine geri koyun. Alternatif olarak, bu aşamada yeni bir prob kullanın ve ölçümler alınana kadar çıkarmadan yerinde bırakın. Ertesi gün.

Mikrodiyaliz gününde, Hamilton şırıngasını ve sintilasyon şişesini filtrelenmiş A ECF ile doldurun ve pompanın bir saat boyunca dengelenmesini sağlayın. Gerekiyorsa, ikinci bir Hamilton şırıngasını hazırlanan tedavi solüsyonu ile doldurup şırınga pompasına yerleştirin. Bu prosedürdeki başarının anahtarı, sakin kalmak ve hayvanla oldukça kapsamlı bir şekilde ilgilenmektir.

Bu nedenle sakin kalın, yavaş ve hassas hareket edin ve her şeyden önce pratik yapın. Dengelenme tamamlandığında, sahte stilet'i çıkarın ve dengelenmiş mikrodiyaliz probunu kanül aracılığıyla sıçanın beynine nazikçe yerleştirin. Sıçanı, içinde sıçanın kendi yuva malzemelerinin bulunduğu şeffaf plastik bir kutuya yerleştirin.

Hortumların dengelendiğinden emin olun. Yerçekiminin mikrodiyaliz hatlarını bükülmeyecek ancak gergin kalmayacak şekilde tutması için, kafesin dışındaki hortumlara suyla doldurulmuş 1,6 mililitre mikro santrifüj tüpü takın. Probun ve sıçanın iki saat boyunca dengelenmesine izin verin.

Bu dönemin başında, Perfuse eight akışının engellenmediğini doğrulayın. Bunun için, örnekleri toplamaya başlamadan önce, belirli bir süre boyunca PERFUSE eight çıkış akışını toplayın ve beklenen hacmin sistemden çıktığını doğrulamak için örneği tartın. Örnek diyalizi ve toplama arasındaki korelasyonun doğru şekilde hesaplandığından emin olun.

Burada, prob ile toplama noktası arasında dakikada 1.5 µL hızla 30 µL hacim bulunmaktadır. Numunenin beyinden çıkışı ile toplanması arasında 20 dakikalık bir gecikme süresi vardır. Dengeleme süresinden sonra, sıçan ana bölmede dinlenirken en az üç numune toplayın.

Davranışsal testlerden önce ölçümler için kararlı bir temel hat oluşturmak amacıyla, beyne uygulanacak tedavinin iletim zamanlamasını dikkatlice planlayın. Şırınga ucu ile hayvanın beynine giren prob arasında 30 µL hacmin bulunduğu bu düzenekte, tedavinin hipokampusa ulaşmasını sağlamak için şırıngaları değiştirmeden 20 dakika önce tedavi şırıngasını profuse sekiz tedavi çözeltisi ile değiştiririz.

Giriş hattını kontrol perfüzyon sekiz şırıngasından ayırıp hızla tedavi perfüzyon sekiz şırıngasına bağlayın. PERFUSE sekiz akışının kesilmesini önlemek için bu işlem beş saniyeden uzun sürmemelidir. Uygun zaman aralığında etkinliği azaltabilecek hava kabarcıklarının sisteme girmemesine dikkat edin.

Tedavi uygulamasının ardından, sıçanı seçilen davranışsal test düzeneğine nazikçe yerleştirin. Burada, spontane alternasyon, ön kol şeklinde bir artı maze üzerinde ölçülür. Hayvanın maze içerisinde 20 dakika boyunca serbestçe keşif yapmasına izin verin.

Örnekleri toplamak için arm Aries'in sekansını ve zamanlamasını video kaydıyla veya manuel olarak kaydedin. Bu süre zarfında, çıkış borusunu yeni bir toplama tüpüne taşıyın. Her beş dakikada bir, boruyu serbestçe hareket edebilecek şekilde tutun.

Sıçanın hareketini engellememeli, hayvanın önünde hareket etmemeli ve hareketlerinizin sıçanın davranışını etkilememesi için sabit kalarak dikkati dağıtmamalıdır. Testin ardından, sıçanı labirentten nazikçe çıkarın ve kontrol odasına geri götürün. Görev performansından sonraki toparlanma sürecini kapsayacak şekilde, mikrodiyaliz örnek toplamasına en az dört örnek daha boyunca devam edin.

İstenen örnekler toplandıktan sonra, probu hayvanın başından nazikçe çıkarın ve bir saklama tüpüne yerleştirin. Hayvanı kendi kafesine geri koyun ve deney sonrası sağlık veya davranışında herhangi bir değişiklik olup olmadığını yakından gözlemleyin. Son olarak, mikrop üremesini önlemek için catho çözeltisi içeren bir şırıngaya geçerek tüpü yıkayın.

Bu örnek, hipokampal ECF glukozundaki görevle ilişkili düşüşü göstermektedir. Gri kutu, hayvanın labirentte geçirdiği süreyi temsil eder. Mor çizgi, labirent testi yapılmayan hayvanlardaki hipokampal glukozu gösterirken, kırmızı çizgi ön kol spontane alternasyon görevini gerçekleştiren hayvanları temsil eder.

Turuncu çizgi, bu görevin daha kolay olan üç kollu versiyonunu gerçekleştiren hayvanlardaki ölçümleri göstermektedir. İnsülin uygulamasının ardından hipokampal glikoz ve laktattaki değişimler burada görülmektedir. Bu değişimlerin herhangi bir davranışsal test olmaksızın gerçekleştiği ve dolayısıyla yalnızca bazal koşullar altında insülinin etkisini yansıttığı unutulmamalıdır.

Bu prosedürü gerçekleştirirken sakin kalmak oldukça önemlidir. Sıçanlar stres deneyimini fark edebilir ve huzursuzlaşabilirler; bu durum hem işlemi çok daha zorlaştırabilir hem de muhtemelen sonuçlarınızı karıştırabilir. Bu tekniklerin kombinasyonu, davranışsal süreçlerin doğru bir nörokimyasal incelemesine olanak sağlamıştır.

Benzer teknikler günümüzde insan hastalarda da kullanılmaktadır. Örneğin, nöbet odağını lokalize etmek için elektrotları implante edilmiş epilepsi hastalarına, metabolik ölçümlere olanak sağlamak amacıyla mikrodiyaliz kanülleri de implante edilebilir.