Name: Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, fiber optik implantasyon yöntemiyle uyanık ve davranış gösteren farelerde beyin dokusunun kronik optogenetik uyarılmasını. Bu teknik, sinir devrelerinin uzun vadeli işlevlerini hasarsız incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu tekniği aslında Sparta ve ark., 2012 tarafından tanımlanmış ve kolayca laboratuar kullanım için adapte edildiğini kabul etmek istiyorum.

Ilgili üretici ve / veya satıcıları ile birlikte * Bütün malzemeler protokolü aşağıda listelenmiştir. 1. İmplant Meclisi <ol><li> 1 g reçine ile sertleştirici 100 mg eklenmesi ile ısı ile sertleşen fiber optik epoksi oluşan bir karışım hazırlayın. </li><li> Ölçün ve bir kama uçlu karbür kâtip ile puanlama ile 100 mikron çekirdek ile optik 125 mikron fiber yaklaşık 35 mm kesti. Tek, tek yönlü hareket fiber optik ve skoru katip dik yerleştirin. Fiber Kesme tamamen fiber çekirdek zarar verecektir. </li><li> Yardımcısı içine taşıyan bir 127 mikron olan yüksük bir LC seramik yerleştirin, dışbükey tarafı aşağı çekti. </li><li> Halka içine optik lif yerleştirin. Optik lif sorunsuz slayt ve marjinal halka (Şekil 1a) konveks sonunu çıkıntı yapmalıdır. </li><li> Epoksi siyah olana kadar ısı tabancası ile düz ucunu ve ısı ısı kurutmalı fiber optik epoksi bir damla uygulayın. Epoksi gerekirısıtılan ve daha önce kür olarak halka doldurun. Epoksi sabit ısı uygulaması ~ 1 dk içinde tedavi edilmelidir. </li><li> Bu bağlantı elemanı ile arabirim engelleyici olarak, halka yanları boyunca herhangi bir epoksi temizleyin. </li><li> Parlatma pedi üzerine alüminyum oksit parlatma yaprak (Şekil 1b) bir LC fiber optik parlatma diski (FOPD) kullanarak halka ve dışbükey sonuna Lehçe. Dairesel dönme desenleri olun ve aşağıdaki sırayla dört sınıflarda lehçe: 5, 3, 1 0.3 mikron kum. </li><li> İlgilenilen bölge hedef alan bu gibi uygun uzunlukta düz sonunda optik fiber kesin. Uzunluk, stereotaksik atlası kullanılarak tespit edilebilir. </li><li> Aşağıda açıklanan bağlayıcı kablosu üzerinden lazer bağlayarak implant sınayın. İmplantın cilalı ucu manşonun kol takılan ve karşıt halka ile doğrudan temas yapmak gerekir. İmplant inci ucunda ölçülen ışık çıkışı 10 mW korumak gerekire implant lif. Kötü bir implant optik fiber ucuna yakın bir zayıf bir odak noktası olacaktır. </li><li> Kullanıma kadar köpük içinde bitmiş implantlar (Şekil 1c) saklayın. </li></ol> 2. Fiber Optik çoğaltıcı Kordon Meclisi <ol><li> Yukarıdaki gibi ısı ile sertleşen fiber optik epoksi oluşan bir karışım hazırlayın. </li><li> Ölçün ve bir kama uçlu karbür kâtip ile puanlama 200 mikron çekirdek ile optik 220 mikron fiber uygun uzunlukta kesilir. Lif uzunluğu fare gövde etrafında serbestçe hareket etmesine izin verir ama fare elyaf ile çiğnemek izin verilmemelidir. </li><li> Optik lif uzunluğu biraz daha uzun dallanma borusunun bir uzunluk içine optik fiber ekler. Tüp optik fiber biraz daha büyük bir iç çapa sahip olmalıdır. </li><li> Şerit ~ 25mm optik fiber bir ucunda ve Multimode FC MM metal uç takın durana kadar 230 mikron deliği ile Meclis Yüksük. Optik fiber ferru dışarı sopa gerekirle sonu (Şekil 2a). </li><li> Metal sonunda (süper yapıştırıcı) siyanoakrilat ile bağlantıyı sabitleyin. Bağlayıcı Boot ile bağlantı örtün ve FC FOPD ile halka sonuna parlatın. 5, 3, 1, 0.3 mikron grit (Şekil 2b): dairesel dönme desen ve aşağıdaki sırayla dört sınıflarda lehçe olun. </li><li> Distal konveks uç ile bir LC seramik halka (230 um id oyuğu) içine optik fiber diğer ucunu soyun ve yerleştirin. Kürlenmeden düz uç ısı ve epoksi bir damla uygulayın. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi alüminyum oksit parlatma levhalar üzerinde bir YP FOPD kullanarak halka ve dışbükey uç parlatmak. </li><li> Kol orta noktası kadar halka ve dışbükey ucu üzerinde bir LC halkalı kol getirin. </li><li> Sıra ısı shrink furkasyon boru ve bağlantı (Şekil 2c) güvenliğini sağlamak ve korumak için kol ve ateşte tüp. </li><li> Lazer kaynağı bağlayarak ve ışığı outp ölçerek bağlayıcı sınayınbir spektrofotometre ile bağlantı yoluyla ut. Lazer çıkışı ve ölçülen coupler çıkış arasındaki ışık kaybı% 30 geçmemelidir. </li></ol> 3. Cerrahi implantasyon * Bu bir ipucu, yalnızca bir işlemdir. Aletleri steril ama eldiven alet ve ekipmanlar arasında sürekli manipülasyon nedeniyle olması gerekmez. <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyon Ketamin / Ksilazin karışım, 100 ve 30-gauge iğne kullanılarak sırasıyla 10 mg / kg ile fare anestetize. </li><li> Makası ile kafa derisi Tıraş. Betasept kez tekrarlayarak, iki dakika süreyle (% 4 çözelti Klorheksidin) mendil, ardından% 70 izopropil alkol ile kafa derisi temizleyin. </li><li> Sterotaxic teçhizat fare yerleştirin ve kafatası düzeyde olmasını sağlamak, kafa sabitleyin. Kuruluk ve postoperatif ağrıyı önlemek için gözleri oftalmik merhem uygulayın. Oksijen mou fizyolojik durumuna bağlı olarak seyreltildi buharlaşmasına izofluran (% 1-3 ile anestezi koruyunsürekli bir kuyruk tutam yanıt takip edilmelidir se,). </li><li> Lambda göz yörüngede kafatası açığa derisi orta hat boyunca bir kesi olun. Gerektiği gibi bağ dokusu bir kenara itin. </li><li> Cilt geri tutmak için Serafin kelepçeleri kullanın ve kafatası (Şekil 3a) bir erişim sağlamak. </li><li> Bir diş çekme ile kafatası yüzeyi boyunca etch bir damalı deseni. Steril serum fizyolojik ile pislikleri dışarı yıkayın. Iyice kurulayın. </li><li> Mikrogözenekler oluşturmak için ~ 2-3 saniye için bir pamuklu bezle maruz kafatasına hidrojen peroksit (% 3) uygulayın. Birden çok kez yıkayın ve iyice kurulayın. Sparta ve ark tarif edildiği gibi Alternatif olarak, ankraj, kafatası içine vidalanabilir. (2012). </li><li> Yine, etch bir kareli bir diş çekme ile kafatası boyunca desen ve salin ile enkaz yıkayacak. Iyice kurulayın. </li><li> Döner aracını kullanarak, steril bir matkap ucu ile küçük bir burr hole kraniotomi (çapı &lt;1 mm) yapmak(Otoklav) Yukarıdaki bregma ve lambda kalibre stereotaksik atlas tarafından belirlenen faiz bölge. Dura kırmak veya herhangi bir dokuya zarar vermemek için dikkatli olun. Enkaz uzak yıkayın ve iyice kurulayın. </li><li> Prob tutucu içine fiber optik halka (implant) takın ve stereotaksik koluna bağlayın. </li><li> Doğrudan doğruya stereotaksik kol (Şekil 3b) kullanılarak ilgi bölgesi üzerinde yerinde implant yerleştirin. Beyin dokusu içinde optik fiber ekleme, fiber ~ 2 mm / dak &#39;lık bir hızla ağır ağır geliştirilmesi gerekmektedir. Ferrül kalan kafatası dayanması gerektiğini. </li><li> Diş çimento karışımı hazırlayın. Karışım kolayca kafatası boyunca uygulamak için yeterince düşük bir viskoziteye sahip olmalıdır. Karışım 2-4 dakika için kullanılabilecektir. </li><li> Steril bir kürdan kullanarak, kafatası boyunca ve implantın alt kısmı üzerine diş çimentosu, bir ince, düz bir tabaka uygulanır. Olarak diş çimento temel tabakası kafada kadar yüzey alanı kapsamalıdırmümkündür. Fare deri ile temas diş çimento izin vermeyin. Bu artan dikilmesi zorluk hem de fare tahrişe yol açacaktır. Diş çimento deri ile temas etmezse, kısmen çimento Tüm katmanı ayarı önce kapalı soyulmuş olabilir böyle kurutun. </li><li> Tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Her katmanın (Şekil 3c) tamamen kurumasını sağlayan, kafatası üzerinde ve implant çevresindeki küçük bir höyük oluşturmak için diş çimento bile kat kat uygulayın. Pürüzsüz, engelsiz bağlantı sağlamak için çimento temiz halka ve dışbükey sonu ~ 3-5 mm bırakın. </li><li> Diş çimento höyük üzerinde ve C22 iğne ile steril, tek kullanımlık ipek örgülü sütür (6-0) kullanarak implant çevresindeki derisi dikin. 7 gün sonra çıkarın. İsteğe bağlı: sütür sonra ek bağlama için kullanın Vet Bond. Minimal Vet Bond kullandığınızdan emin olun. Aşırı kaşıma nedeniyle ciddi cilt hasarına yol açabilir. </li><li> Immediatelameliyat sonrası y, fare deri altından sonrası ağrıyı azaltmak Ketprophen (5 mg / kg) ile enjekte edilmelidir. Bu 24 saat sonra tekrarlanmalıdır. Implantın tabanı sütüre cilde ve çevresinde topikal analjezikler (bupivakain) ve antibiyotik (Neosporin) uygulayın. </li><li> Derlenme için ısıtma battaniye üzerinde bir kafes içinde fare yerleştirin. Steril, ameliyat sonrası iyileşme kafesteki fare yerleştirin. Kurtarma kafes ısısını korumak ve boğulma önlemek için herhangi bir çarşaf içermemelidir. Fare orijinal kafes veya bir kez uyanık, yeni bir kafes iade edilebilir. </li></ol> Işık kaynağı ve ilgi bölgesi içinde optik fiber uç arasında en az foton kaybı fiber optik implant ve manşon sonuç Uygun montaj. İyi cilalanmış fiber optik bir üniforma, konsantrik dairenin (Şekil 2d) ışık iletimi gerekir. Dikkatli implantasyon ve sütür ile implant gözle görülür hiçbir tahrişe nedenfare ve optik fiber veya iletilen ışık miktarının önemli bir bozulma olmadan uzun vadeli çalışmalar (Şekil 3d,&gt; 1 ay, yayınlanmamış gözlemler) yerinde kalabilir. Uygun olmayan emplantasyon ya da dikişin tahriş olmasına neden olabilir ve nedeniyle sürekli manipülasyon diş çimentosu, çimento veya diş olan halka kırılması ortaya çıkaracak olan kafa derisi ile kazıma fare neden olabilir. Birleştirilen sisteminin şematik bir diyagramı Şekil 4&#39;te görülebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> Şekil 1. Implante fiber optik Meclisi. (A) optik elyaf marjinal ok başı ile gösterilen uç ötesinde çıkıntı yapan dışbükey, yüksük içine yerleştirilir. (B) halka ve dışbükey sonu parlatma yaprak kademeli ince sınıflarda bir FOPD kullanılarak parlatılır. (C) mamul implante lif optic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> Şekil 2. Implanta tether fiber optik döner eklem için kullanılan fiber optik bağlantı elemanı montajı. Halkalı montaj yoluyla (a) Fiber optik yapışıyor. (B) grubunun halkalı yan parlatma kağıdı kullanılarak FOPD ve parlak kademeli ince dereceleri içine yerleştirilir. (C) halka kovanı halka üzeri ve ısı shrink boru ile güvence altına alınır. (D) bitmiş fiber optik bağlantı elemanı minimum foton kaybı ile eşmerkezli bir ışık üretmek olmalıdır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> Şekil 3. Cerrahi implantasyon fiber optik. Craniu (a) tüm yüzeyim maruz kalmakta ve bağ dokusu temizlenir. (B) optik fiber implant steryotaksik bir kol ile bir konumda tutulur. (C) Diş çimento kafatasına fiber optik implant sabitleme uygulanır. (D) implantasyonu sonrası&gt; 1 ay, cilt implant çevresindeki iyileştikten ve irritasyon bulguları vardır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> Şekil 4. Fonksiyonel sisteminin şematik diyagramı

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogenetics spesifik nöronal alt üzerinde benzersiz kontrol sağlayan yeni ve güçlü bir tekniktir. Bir elektrot aracılığıyla hücre tipi gelişigüzel ve elektriksel stimülasyon invaziv etkilerden kaçınarak Bu, anatomik ve zamansal hassas sinir devreleri modüle istismar edilebilir. Fiber optik İmplantasyonu dokuya en az zarar ile farelerin davranmak, uyanık birden fazla seans nöral devrelerin tutarlı, kronik stimülasyon sağlar. Bu sistem, aslında Sparta ark tarafından öncülük etmiştir. 8 ve bizim amaçla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> LC Yüksük Kol </td><td> Hassas Fiber Ürünler (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1.25 mm ID </td></tr><tr><td> FC, MM ön montajlı Konnektör </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 mikron Yüksük </td></tr><tr><td> Miller FOPD-LC Disk </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> LC yüksükler için </td></tr><tr><td> Furkasyon boru </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 mikron od, 250 mikron id </td></tr><tr><td> MM LC Stik 1,25 mm Yüksük </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> 127 mikron ID Çap </td></tr><tr><td> MM LC Stik 1,25 mm Yüksük </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 mikronKimliği Çap </td></tr><tr><td> Isı ile sertleşen epoksi, sertleştirici ve reçine </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16oz </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC ve SC / PC Bağlayıcı Parlatma Diski </td><td> ThorLabs </td><td> D50-YP </td><td> FC yüksükler için </td></tr><tr><td> Dijital optik güç ve Enerji Ölçer </td><td> ThorLabs </td><td> PM100D </td><td> Spektrofotometre </td></tr><tr><td> Parlatma Pad </td><td> ThorLabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 Durometre </td></tr><tr><td> 0.3, 1, 3, 5 mikron irmik: (Parlatma) Levhalar Lepleme Alüminyum oksit </td><td> ThorLabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> Standart Sert Kaplama Multimode Fiber </td><td> ThorLabs </td><td> BFL37-200 </td><td> Düşük OH, 200 mikron Çekirdek, 0.37 NA </td></tr><tr><td> Fiber kablo sıyırma aleti </td><td> ThorLabs </td><td> T10S13 </td><td> Kaplı / Coat: 200 mikron / 300 mikron </td></tr><tr><td> SİLİKA / SİLİKA Fiber Optik </td><td> Polymicro Teknolojileri </td><td> FVP100110125 </td><td> Yüksek-OH, UV Geliştirilmiş, 0.22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 Fiberoptik Rotary Ortak </td><td> Dorik lensler </td><td> FRJ_FC-YP </td><td></td></tr><tr><td> Mono Fiberoptik Patchcord </td><td> Dorik lensler </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Tüp, 1/8 inç küçültmek Isı </td><td> Müttefik Elektronik </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> Isı tabancası </td><td> Müttefik Elektronik </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W; 750-800 ° F </td></tr><tr><td> Pamuk aplikatörler uçlu </td><td> Püriten Tıbbi Ürünler Şirketi </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> VetBond doku yapıştırıcısı </td><td> Fischer Scientific </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> Flaş protez kaide akrilik </td><td> Yates Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN Minyatür Iris Makas </td><td> Integra Miltex </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8.9cm), düz, 15 mm bıçaklar </td></tr><tr><td> Johns Hopkins Bulldog Kelepçe </td><td> Integra Miltex </td><td> 7-290 </td><td> Kavisli 1-1/2 &quot;(3,8 cm), </td></tr><tr><td> MEGA-Tork Elektrik Lab Motoru </td><td> Vektör </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> Panther Frezleri-Ball # 1 </td><td> Clarkson Laboratuvarı </td><td> 77.1006 </td><td></td></tr><tr><td> Mor Mavi Lazer Sistemi </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> Dalga boyu: 473 nm </td></tr><tr><td> Lazer Güç Kaynağı </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 2 Laminektomi Forseps </td><td> Fine Bilim Araçları </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;Düz Hemostat </td><td> EXCELTA </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> Ağırlıklı taban ile Mengene </td><td> Altex Elektronik </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

beyin dokusu kronik optogenetic uyarılması için fiber-optik İmplantasyon

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Sinirsel bağlantıda durulaştırmada desenleri klinik ve temel hem nörobilim için bir meydan okuma olmuştur. Elektrofizyoloji sinaptik bağlantı desenleri analiz etmek için altın standart olmuştur, ama eşleştirilmiş elektrofizyolojik kayıtlar hantal ve deneysel sınırlayıcı hem de olabilir. Optogenetics gelişimi in vitro ve in vivo 1 2,3 hem de nöronlar ve devreler uyarmak için zarif bir yöntem tanıttı. Ayrık nöronal popülasyonlarda opsin ifade sürücü hücre tipi spesifik promotor aktivitesi istismar ederek, tek bir doğrusu farklı devreleri 4-6 tanımlı genetik nöronal alt uyarabilir. Elektrik stimülasyonu ve / veya farmakolojik manipülasyonlar dahil nöronlar, teşvik etmek de anlatılan yöntemlerin sık sık invaziv hücre tipi ayrım vardır ve çevre dokulara zarar verebilir. Bu sınırlamalar, normal sinaptik fonksiyon ve / veya devrenin davranışını değiştirebilir. Bunlara ilave olarak,manipülasyon doğası, mevcut yöntemleri sıklıkla akut ve terminal vardır. Optogenetics nispeten zararsız bir şekilde nöronları uyarır, ve genetik olarak hedeflenen nöronlarda olanağı tanıyor. In vivo olarak optogenetics içeren çalışmaların çoğu şu anda bir kanül implant 6,7 yönlendirilirler bir optik fiber kullanmak, ancak bu yöntem sınırlamalar bir optik fiber tekrarlanan ekleme ile hasarlı beyin dokusu, ve kanül içinde fiberin kırılma potansiyeli vardır. Optogenetics arasında gelişen alanda göz önüne alındığında, kronik stimülasyon daha güvenilir bir yöntemle daha az teminat doku hasarı ile uzun vadeli çalışmalar kolaylaştırmak için gereklidir. Burada, etkili ve şık bir Sparta ve ark anlatılan yönteme tamamlamak için bir video madde olarak modifiye protokol sağlar. 8 anestetize farelerin kafatası üzerine bir fiber optik implant ve kalıcı tespit üretiminde, hem de in tertibatı için lifoptik bağlantı elemanı bir ışık kaynağına implant bağlayan. Bir katı hal lazer fiber optik ile bağlı implant, kronik az doku hasarı 9 küçük, çıkarılabilir, iplerini kullanarak işlevsel nöronal devreler photostimulate için etkili bir yöntem sağlar. Fiber optik implantlar Daimi fiksasyon sağlar tutarlı, minimal doku hasarı olan 10 uyanık, davranmasıyla farelerde nöronal devrelerin vivo optogenetic çalışmalarda uzun vadeli.

Optogenetics gelişimi artık kesin tanımlı genetik nöronlar ve devreler uyarmak için araç, hem de sağlar<em&gt; In vitro</em&gt; Ve<em&gt; In vivo</em&gt;. Burada beyin dokusunun kronik photostimulation için optik fiber montaj ve implantasyon açıklar.

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Aşağıdaki deneyin amacı, uyanık ve davranan farelerde uzun süreli nöronal devreleri aktive etmek ve incelemektir. Bu yöntem, orijinal olarak Sparta ve diğerlerinde açıklanan kavramdan uyarlanmıştır. Bu, önce optik döner eklemi fiber optik implanta bağlayan bir fiber optik çift kordonun monte edilmesiyle elde edilir.Daha sonra, fiber optik, ışığın doğrudan redin eksprese eden nöronlar kanalına gitmesi için bir geçit oluşturmak üzere ilgilenilen beyin dokusunun üzerine implante edilir. Son olarak, ışık kaynağından beyin dokusuna seri olarak bağlı bir yol oluşturmak için ışık kaynağı optik döner mafsala bağlanır. Sonuç olarak, kanal redsin eksprese eden nöronların ışığa bağlı ateşlenmesi, in vivo, elektrofizyoloji ve davranışsal çalışmalara dayalı olarak değerlendirilebilir.Bu tekniğin kılavuz kanüller gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bir optik fiberin tekrar tekrar takılması ve çıkarılmasının neden olduğu beyin dokusuna verilen hasarı en aza indirmesidir. Bu yöntem nöral devre işlevi hakkında bilgi sağlayabilse de, belirli nörolojik bozukluk türlerinin altında yatan sinaps ve devreye bağlı mekanizmaları daha iyi anlamak için diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.İmplantasyon adımlarında ustalaşmak zor olduğundan, görünüşte küçük olan her adım, yöntemin genel stabilitesine ve güvenilirliğine büyük ölçüde katkıda bulunur. 125 mikron çapında bir fiber optiğin 35 milimetresini 100 mikronluk bir çekirdeğe sahip keserek, fiber optiğe dik bir kama ucu karbür çizici yerleştirerek ve fiberi tek bir tek yönlü hareketle çizerek ve ardından düz bir şekilde çekerek başlayın. Şimdi, 127 mikron çapında bir delik dışbükey tarafı bir mengeneye bakacak şekilde bir lc seramik yabani hayvan yerleştirin ve ardından fiber optik parçayı yabani hayvanın içine yerleştirin.Fiber optik, düzgün bir şekilde kaymalı ve yabani hayvanın dışbükey ucunun ötesine marjinal olarak çıkıntı yapmalıdır. Daha sonra, yabani hayvanın düz ucuna bir damla taze hazırlanmış ısıyla sertleştirilebilir fiber optik epoksi uygulayın ve ardından epoksi üzerine bir ısı tabancası uygulayın. Epoksi, ısıtıldığı için yabani hayvanı doldurmalı ve siyaha döndüğünde sertleşmelidir.Sertleştikten sonra, yabani hayvanın kenarlarındaki herhangi bir epoksiyi temizleyin, daha sonra bir lc fiber optik parlatma diski kullanarak, yabani hayvanın dışbükey ucunu alüminyum oksit üzerinde parlatmak için dairesel dönüş desenleri oluşturur Dört azalan sınıfta bir parlatma pedi üzerinde parlatma levhaları. Ardından, fiber optiği düz uçta ilgilenilen bölgeyi hedeflemek için uygun uzunlukta kesin. Cilalı fiber optiği test etmek için, implantın cilalı ucunu kuplörün manşonuna yerleştirin.Karşıt yabani ile doğrudan temas hissedilene kadar, kötü bir implant, fiber optiğin ucuna yakın zayıf bir odak noktasına sahip olurken, iyi bir implant, çıkış olmadan düzgün bir eşmerkezli ışık çemberi iletecektir. 10 miliwatt'a kadar olan güçler, bitmiş implantları kullanıma kadar köpük içinde saklar. Bu adıma, bir farenin serbestçe hareket etmesine izin vermek, ancak farenin lifi çiğnemesine izin vermemek için 220 mikron çapında bir fiber optiği 200 mikron çekirdekli olarak ölçerek ve ardından puanlayarak başlayın.Ardından fiber optiği, iç çapı fiber optiğinkinden biraz daha büyük ve uzunluğu biraz daha kısa olan bir furation tüpü parçasına yerleştirin. Şimdi, fiber optiğin bir ucundan yaklaşık 25 milimetre soyun ve çok modlu bir FC MM vahşi düzeneğin metal ucuna yerleştirin. Durana kadar 230 mikron çapında bir delik ile, fiber optik vahşi uçtan dışarı çıkmalıdır.Ardından, bağlantıyı metal uçta siyanoakrilat ile sabitleyin ve bağlantıyı bir konektörle kapatın Önyükleme, vahşi ucu az önce gösterildiği gibi bir FC parlatma diski ile parlatın. Fiber optiğin diğer ucunu sıyırdıktan sonra, sadece dışbükey ucu distal olacak şekilde bir lc seramik yabani içine yerleştirin. Daha sonra düz uca bir damla epoksi uygulayın ve az önce gösterildiği gibi kürlenene kadar ısıtın.Yabani hayvanın dışbükey ucunu az önce gösterildiği gibi parlattıktan sonra, yabani manşonun orta noktasına ulaşana kadar yabani hayvanın dışbükey ucunun üzerine bir lc yabani manşonu kaydırın. Ardından, makaronun ve manşonun üzerine bir ısıyla daralan makaron yerleştirin ve ısıyla daralan makaronu güvenli hale getirin ve bağlantıyı koruyun. Son olarak, yabani hayvani lazer kaynağına bağlayın ve ardından kuplörden geçen ışık çıkışını bir spektrofotometre ile ölçerek test edin, lazer çıkışı ile ölçülen kuplör çıkışı arasındaki ışık kaybı ameliyata başlamadan önce %30'u geçmemelidir.Cerrahi alanı isop profil alkol ve ardından klorheksidin solüsyonu ile dezenfekte edin. Ardından, fareyi stereotaksik donanıma yerleştirin ve kafatasının düz olduğundan emin olarak kafayı sabitleyin. Kuruluk ve ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün.Şimdi kafatasını göz yörüngelerinden lambda dikişine kadar ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta hattından bir kesi yapın. Cildi geride tutmak ve kafatasına erişimi sürdürmek için serafin kelepçeleri kullanın. Ardından, kafatası yüzeyi boyunca damalı bir desen çizmek için bir diş penası kullanın.Elde edilen kalıntıları steril tuzlu su ile yıkayın. İyice kuruduktan sonra, mikro gözenekler oluşturmak için açıkta kalan kafatasına yaklaşık iki ila üç saniye arasında% 3 hidrojen peroksit uygulamak için pamuklu çubuk kullanın. Daha sonra kafatasını daha steril tuzlu suyla birkaç kez yıkayın ve iyice kurulayın.Dama tahtası desenini kafatasına aşındırdıktan, yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, fiber optik feral implantı tekrar prob tutucusuna yerleştirin ve ardından stereotaksik kola bağlayın. Bgma ve lambda'ya kalibre edilmiş stereotaktik bir atlas ile frez deliği konumunu belirleyin. Ardından, ilgilenilen bölgenin üzerinde çapı bir milimetreden daha az olan küçük bir frez deliği kraniyotomi yapmak için döner bir diş matkabı kullanın, durayı kırmamaya veya herhangi bir dokuya zarar vermemeye dikkat edin.Stereotaksik kolu kullanarak, implantı doğrudan ilgilenilen bölgenin üzerine yerleştirin, yabani çevre kraniyal dokuya dayanmalıdır. Şimdi steril bir kürdan kullanarak kafatası boyunca ve implantın alt kısmına ince, eşit bir şekilde taze hazırlanmış diş çimentosu tabakası uygulayın. Hayvanın derisi ile temas etmemeye dikkat ederek, diş çimentosunun taban tabakası kafatası üzerinde mümkün olduğunca fazla yüzey alanı kaplamalıdır.Bu işlemin en zor yanı, diş çimentosunun kitle derisine temas etmeden uygulanmasıdır. Başarıyı sağlamak için, ince tabakalar halinde bir seferde az miktarda çimento uygulayın ve bir sonrakini eklemeden önce her katın tamamen kurumasını bekleyin. Kafatasının üstünde ve implantın çevresinde küçük bir höyük oluşturmak için diş çimentosunun eşit katmanlarını uygulayın.Düzgün, engelsiz bir bağlantı sağlamak için yabani çimentonun dışbükey ucunun üç ila beş milimetresini temiz bırakın. Daha sonra kafa derisini diş çimentosu höyüğünün üzerine ve implantın etrafına dikin, dikişten sonra ek bağlama için veteriner bağı yapıştırıcısı kullanılabilir. Son olarak, dikiş derisine ve implantın tabanının etrafına topikal analjezikler ve antibiyotikler uygulayın ve ardından fareyi ameliyat sonrası iyileşme için bir kafese yerleştirin.Fiber optik implantın ve kuplörün uygun şekilde monte edilmesi, ışık kaynağı ile ilgilenilen bölgedeki fiber optiğin ucu arasında minimum foton kaybına neden olur. Cilalı fiber optikler, dikkatli bir implantasyon ve dikiş atma ile bu görüntüde görülebileceği gibi, burada gösterilen daireye benzer düzgün bir eşmerkezli daire içinde ışığı iletmelidir, ancak implant, farede gözle görülür bir tahrişe neden olmaz ve fiber optikte veya iletilen ışık miktarında önemli bir bozulma olmadan uzun süreli çalışmalar için yerinde kalabilir Uyanık bir farede fonksiyonel davranışsal tahliller, stimülasyondan doğrudan bir yanıt gösterir Motor korteks üzerine implante edilen bir fiber optik aracılığıyla, bununla kanıtlandığı gibi, in vivo elektrofizyoloji video verileri, implant yoluyla hedeflenen nöronların aktivasyonunu ve beyin stimülasyonu sırasında hayvanın davranışsal tepkisini gösterir. Bu prosedürü takiben, hedef hücrelerle ilişkili devre bağlantı modelleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için hedeflenen beyin bölgelerinin foto stimülasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, fiber optik implantların ve kuplör kordonların nasıl monte edileceğini ve bunların optogenetik taşıyıcıları ifade eden beyin dokusu üzerine nasıl implante edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Koku ampul Yetişkin doğumlu nöronlar optogenetically Channelrhodopsin2-implant minyatür rostral göçmen akışı ve kronik photostimulation lentiviral enjeksiyon ifade LED kullanılarak kontrol edilebilir.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetik, davranışsal sinirbilim deneylerinde kullanım için güçlü bir araç haline geldi. Bu protokol, lazer sistemlerinin tasarımı ve kurulumu için adım adım bir kılavuz sunar ve çoğu kemirgen davranışsal test paradigmasıyla uyumlu çoklu ve eşzamanlı in vivo optogenetik stimülasyonların gerçekleştirilmesi için tam bir protokol sağlar.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

Bu protokol, optogenetik fonksiyonel manyetik rezonans görüntülemeyi (ofMRI) başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için gereken adımları ve veri analizini açıklar. ofMRI, yüksek alanlı fMRI okumasını optogenetik stimülasyonla birleştiren, fonksiyonel nöral devrelerin ve bunların tüm canlı beyindeki dinamiklerinin hücre tipine özgü haritalanmasına izin veren yeni bir tekniktir.

Optogenetic Fonksiyonel MRI

Burada, viral ifade vektörel çizimler ipek fibroin Filmler kullanarak beynine teslim etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem ifade vektörel çizimler ipek/AAV kaplamalı optik lifler, konik optik lifler ve kafatası windows kullanarak hedeflenen teslimini sağlar.

Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir.

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Davranışı Modüle Etmek Için Nöronal Aktivitenin Optogenetik Manipülasyonu

Burada, ışık iletimi için optik fiberlere ve nöral kayıt için bir elektrot dizisine sahip bir optrode sisteminin üretim yöntemini sunuyoruz. Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden transgenik farelerle yapılan in vivo deneyler, eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt için sistemin fizibilitesini göstermektedir.

Eşzamanlı Optogenetik Modülasyon ve Elektriksel Nöral Kayıt için Optrode Dizisi

Bu protokol, omurilik cerrahisi yapmak ve kemirgenlerde omurilik üzerine optik bir şaft implante etmek ve sabitlemek için cerrahi bir prosedürü detaylandırır.

Optoelektronik cihazların kemirgen omuriliğine implantasyonu

Elektrot üretimi için basitleştirilmiş ve uygun maliyetli bir yaklaşım geliştirdik ve serbestçe hareket eden farelerde birden fazla bölgede sinyallerin kayıtlarını gerçekleştirdik. Çok bölgeli elektrofizyoloji ve kalsiyum sinyal kaydının yanı sıra optogenetiğin kullanılması, nöbet tutuşturma modelinde bölgeler arasında nöronal aktivitelerin ortaya çıkarılmasını sağladı.

Çok Bölgeli İn Vivo Kayıt için Esnek ve Kullanışlı Elektrofizyolojik Seçenekler Hazırlamak için Entegre Bir Yöntem

Bu protokol, viral teslimat, optrod implantasyonu, fototrombotik indüksiyon, astrosit ve nöron aktivitesinin eşzamanlı kaydı ve astrositlerin optogenetik uyarılmasını içeren entegre bir yöntem sağlar. Bu entegre yöntem, iskemik incinin akut ve kronik evreleri arasında astrosit-nöron ilişkisinin eşzamanlı incelenmesini sağlamayı amaçlamaktadır.

Fototrombotik İnme Modelleme ve Davranış Eden Farelerde Nöronal ve Astrositik Aktivitenin In Vivo Optrode Kaydı İçin Entegre Bir Yöntem

Öğrenin, fiber optik implantasyon yöntemiyle uyanık ve davranış gösteren farelerde beyin dokusunun kronik optogenetik uyarılmasını. Bu teknik, sinir devrelerinin uzun vadeli işlevlerini hasarsız incelemeyi sağlar.

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Daha fazla video keşfet