Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Aşağıdaki deneyin amacı, uyanık ve davranan farelerde uzun süreli nöronal devreleri aktive etmek ve incelemektir. Bu yöntem, orijinal olarak Sparta ve diğerlerinde açıklanan kavramdan uyarlanmıştır. Bu, önce optik döner eklemi fiber optik implanta bağlayan bir fiber optik çift kordonun monte edilmesiyle elde edilir.

Daha sonra, fiber optik, ışığın doğrudan redin eksprese eden nöronlar kanalına gitmesi için bir geçit oluşturmak üzere ilgilenilen beyin dokusunun üzerine implante edilir. Son olarak, ışık kaynağından beyin dokusuna seri olarak bağlı bir yol oluşturmak için ışık kaynağı optik döner mafsala bağlanır. Sonuç olarak, kanal redsin eksprese eden nöronların ışığa bağlı ateşlenmesi, in vivo, elektrofizyoloji ve davranışsal çalışmalara dayalı olarak değerlendirilebilir.

Bu tekniğin kılavuz kanüller gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bir optik fiberin tekrar tekrar takılması ve çıkarılmasının neden olduğu beyin dokusuna verilen hasarı en aza indirmesidir. Bu yöntem nöral devre işlevi hakkında bilgi sağlayabilse de, belirli nörolojik bozukluk türlerinin altında yatan sinaps ve devreye bağlı mekanizmaları daha iyi anlamak için diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.

İmplantasyon adımlarında ustalaşmak zor olduğundan, görünüşte küçük olan her adım, yöntemin genel stabilitesine ve güvenilirliğine büyük ölçüde katkıda bulunur. 125 mikron çapında bir fiber optiğin 35 milimetresini 100 mikronluk bir çekirdeğe sahip keserek, fiber optiğe dik bir kama ucu karbür çizici yerleştirerek ve fiberi tek bir tek yönlü hareketle çizerek ve ardından düz bir şekilde çekerek başlayın. Şimdi, 127 mikron çapında bir delik dışbükey tarafı bir mengeneye bakacak şekilde bir lc seramik yabani hayvan yerleştirin ve ardından fiber optik parçayı yabani hayvanın içine yerleştirin.

Fiber optik, düzgün bir şekilde kaymalı ve yabani hayvanın dışbükey ucunun ötesine marjinal olarak çıkıntı yapmalıdır. Daha sonra, yabani hayvanın düz ucuna bir damla taze hazırlanmış ısıyla sertleştirilebilir fiber optik epoksi uygulayın ve ardından epoksi üzerine bir ısı tabancası uygulayın. Epoksi, ısıtıldığı için yabani hayvanı doldurmalı ve siyaha döndüğünde sertleşmelidir.

Sertleştikten sonra, yabani hayvanın kenarlarındaki herhangi bir epoksiyi temizleyin, daha sonra bir lc fiber optik parlatma diski kullanarak, yabani hayvanın dışbükey ucunu alüminyum oksit üzerinde parlatmak için dairesel dönüş desenleri oluşturur Dört azalan sınıfta bir parlatma pedi üzerinde parlatma levhaları. Ardından, fiber optiği düz uçta ilgilenilen bölgeyi hedeflemek için uygun uzunlukta kesin. Cilalı fiber optiği test etmek için, implantın cilalı ucunu kuplörün manşonuna yerleştirin.

Karşıt yabani ile doğrudan temas hissedilene kadar, kötü bir implant, fiber optiğin ucuna yakın zayıf bir odak noktasına sahip olurken, iyi bir implant, çıkış olmadan düzgün bir eşmerkezli ışık çemberi iletecektir. 10 miliwatt'a kadar olan güçler, bitmiş implantları kullanıma kadar köpük içinde saklar. Bu adıma, bir farenin serbestçe hareket etmesine izin vermek, ancak farenin lifi çiğnemesine izin vermemek için 220 mikron çapında bir fiber optiği 200 mikron çekirdekli olarak ölçerek ve ardından puanlayarak başlayın.

Ardından fiber optiği, iç çapı fiber optiğinkinden biraz daha büyük ve uzunluğu biraz daha kısa olan bir furation tüpü parçasına yerleştirin. Şimdi, fiber optiğin bir ucundan yaklaşık 25 milimetre soyun ve çok modlu bir FC MM vahşi düzeneğin metal ucuna yerleştirin. Durana kadar 230 mikron çapında bir delik ile, fiber optik vahşi uçtan dışarı çıkmalıdır.

Ardından, bağlantıyı metal uçta siyanoakrilat ile sabitleyin ve bağlantıyı bir konektörle kapatın Önyükleme, vahşi ucu az önce gösterildiği gibi bir FC parlatma diski ile parlatın. Fiber optiğin diğer ucunu sıyırdıktan sonra, sadece dışbükey ucu distal olacak şekilde bir lc seramik yabani içine yerleştirin. Daha sonra düz uca bir damla epoksi uygulayın ve az önce gösterildiği gibi kürlenene kadar ısıtın.

Yabani hayvanın dışbükey ucunu az önce gösterildiği gibi parlattıktan sonra, yabani manşonun orta noktasına ulaşana kadar yabani hayvanın dışbükey ucunun üzerine bir lc yabani manşonu kaydırın. Ardından, makaronun ve manşonun üzerine bir ısıyla daralan makaron yerleştirin ve ısıyla daralan makaronu güvenli hale getirin ve bağlantıyı koruyun. Son olarak, yabani hayvani lazer kaynağına bağlayın ve ardından kuplörden geçen ışık çıkışını bir spektrofotometre ile ölçerek test edin, lazer çıkışı ile ölçülen kuplör çıkışı arasındaki ışık kaybı ameliyata başlamadan önce %30'u geçmemelidir.

Cerrahi alanı isop profil alkol ve ardından klorheksidin solüsyonu ile dezenfekte edin. Ardından, fareyi stereotaksik donanıma yerleştirin ve kafatasının düz olduğundan emin olarak kafayı sabitleyin. Kuruluk ve ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün.

Şimdi kafatasını göz yörüngelerinden lambda dikişine kadar ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta hattından bir kesi yapın. Cildi geride tutmak ve kafatasına erişimi sürdürmek için serafin kelepçeleri kullanın. Ardından, kafatası yüzeyi boyunca damalı bir desen çizmek için bir diş penası kullanın.

Elde edilen kalıntıları steril tuzlu su ile yıkayın. İyice kuruduktan sonra, mikro gözenekler oluşturmak için açıkta kalan kafatasına yaklaşık iki ila üç saniye arasında% 3 hidrojen peroksit uygulamak için pamuklu çubuk kullanın. Daha sonra kafatasını daha steril tuzlu suyla birkaç kez yıkayın ve iyice kurulayın.

Dama tahtası desenini kafatasına aşındırdıktan, yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, fiber optik feral implantı tekrar prob tutucusuna yerleştirin ve ardından stereotaksik kola bağlayın. Bgma ve lambda'ya kalibre edilmiş stereotaktik bir atlas ile frez deliği konumunu belirleyin. Ardından, ilgilenilen bölgenin üzerinde çapı bir milimetreden daha az olan küçük bir frez deliği kraniyotomi yapmak için döner bir diş matkabı kullanın, durayı kırmamaya veya herhangi bir dokuya zarar vermemeye dikkat edin.

Stereotaksik kolu kullanarak, implantı doğrudan ilgilenilen bölgenin üzerine yerleştirin, yabani çevre kraniyal dokuya dayanmalıdır. Şimdi steril bir kürdan kullanarak kafatası boyunca ve implantın alt kısmına ince, eşit bir şekilde taze hazırlanmış diş çimentosu tabakası uygulayın. Hayvanın derisi ile temas etmemeye dikkat ederek, diş çimentosunun taban tabakası kafatası üzerinde mümkün olduğunca fazla yüzey alanı kaplamalıdır.

Bu işlemin en zor yanı, diş çimentosunun kitle derisine temas etmeden uygulanmasıdır. Başarıyı sağlamak için, ince tabakalar halinde bir seferde az miktarda çimento uygulayın ve bir sonrakini eklemeden önce her katın tamamen kurumasını bekleyin. Kafatasının üstünde ve implantın çevresinde küçük bir höyük oluşturmak için diş çimentosunun eşit katmanlarını uygulayın.

Düzgün, engelsiz bir bağlantı sağlamak için yabani çimentonun dışbükey ucunun üç ila beş milimetresini temiz bırakın. Daha sonra kafa derisini diş çimentosu höyüğünün üzerine ve implantın etrafına dikin, dikişten sonra ek bağlama için veteriner bağı yapıştırıcısı kullanılabilir. Son olarak, dikiş derisine ve implantın tabanının etrafına topikal analjezikler ve antibiyotikler uygulayın ve ardından fareyi ameliyat sonrası iyileşme için bir kafese yerleştirin.

Fiber optik implantın ve kuplörün uygun şekilde monte edilmesi, ışık kaynağı ile ilgilenilen bölgedeki fiber optiğin ucu arasında minimum foton kaybına neden olur. Cilalı fiber optikler, dikkatli bir implantasyon ve dikiş atma ile bu görüntüde görülebileceği gibi, burada gösterilen daireye benzer düzgün bir eşmerkezli daire içinde ışığı iletmelidir, ancak implant, farede gözle görülür bir tahrişe neden olmaz ve fiber optikte veya iletilen ışık miktarında önemli bir bozulma olmadan uzun süreli çalışmalar için yerinde kalabilir Uyanık bir farede fonksiyonel davranışsal tahliller, stimülasyondan doğrudan bir yanıt gösterir Motor korteks üzerine implante edilen bir fiber optik aracılığıyla, bununla kanıtlandığı gibi, in vivo elektrofizyoloji video verileri, implant yoluyla hedeflenen nöronların aktivasyonunu ve beyin stimülasyonu sırasında hayvanın davranışsal tepkisini gösterir. Bu prosedürü takiben, hedef hücrelerle ilişkili devre bağlantı modelleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için hedeflenen beyin bölgelerinin foto stimülasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fiber optik implantların ve kuplör kordonların nasıl monte edileceğini ve bunların optogenetik taşıyıcıları ifade eden beyin dokusu üzerine nasıl implante edileceğini iyi anlamış olmalısınız.