Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Bu protokol, meme bezinin epitel kısımlarını ilişkili meme stromal hücrelerinden izole etmeyi amaçlar. Enzimatik sindirim kullanarak epitel yapılarını zenginleştirmek için cerrahi ıskarta materyalinin tahakkuk eden diseksiyonu ile başlayın. Epitelyal organoidleri bazal membranın dışındaki stromal materyalden ayırın.

Daha sonra zenginleştirilmiş fraksiyonlar elde etmek için sindirilmiş organoidleri sabit gözenek boyutlu hücre süzgeçlerinden geçirin. Organoidleri hemen kültür için tohumlayın veya ileride kullanmak üzere stokları dondurun. Sonuç olarak, epitelyal organoidler, normal insan meme epitel hücrelerinin uzun süreli kültürlerini oluşturmak için kullanılır.

Bu yöntemi ilk olarak 1970'lerin sonlarında insan epitel hücre biyolojisi ve karsinogenez alanını ilerletmek için geliştirdim. Normal insan hafıza dokularından bol miktarda cerrahi ıskarta materyali mevcuttu. İhtiyaç duyulan şey, bu yığın heterojen materyali, uzun vadeli büyümeyi desteklemek için saf epitel hücre kültürü ve ortamı için uygun hale getirmek için işlemek için bir yöntemdi.

Bu yöntemin görsel gösterimi, özellikle ham diseksiyonun nasıl yapılacağına dikkat etmek için yararlıdır. Düzgün sindirilmiş organoidler neye benziyor? Organoidlerin filtrelenmesi ve organoidlerin kültür için kaplanması.

Bu tekniğin avantajı, stroma için temiz epitel fraksiyonları sağlaması ve epitel hücrelerinin sağlam kalmasıdır. Bulduğumuz organoidler, en iyi başlangıç büyümesini sağlar ve elde edilebilecek hücre sayısını en üst düzeye çıkarır. Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı'ndan iki bilim adamı, James Garvey ve Mark LeBarge şimdi bu prosedürü gösterecek Cerrahi prosedürlerin atılan materyalinden.

Dört santigrat derecede tampon veya tam besiyeri artı antibiyotik içeren steril kaplarda insan meme dokusu elde edin. Doku parçalarını kesin ve bunları büyük bir cam steril tabağa koyun. Epitel alanlarını yağ dokusu, bağ dokusu ve kan damarlarının stromal matrisinden ayırın.

Daha sarı stromal matrise gömülü epitel alanlarının beyaz tellerini nazikçe inceleyin. Malzemeyi forseps ile tutun ve aşırı yağlı malzemeyi bir neşter ile kazıyın. Daha sonra karşıt neşterlerle, sindirimi kolaylaştırmak için epitel dokusunu yaklaşık dört milimetrelik parçalara bölün.

Diseke epitel dokusunu 50 veya 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın Ağır fibröz dokuda. Daha fazla katı beyaz epitel olmayan materyal olacaktır. Epitel hücrelerini bu tür fibröz matrislerden çıkarmak zorsa.

Doku bir ila üç milimetre kare alana sahip parçalar halinde kesilebilir ve ayrı ayrı sindirilebilir. Tüpü ham kollajenaz ve yüksek alur günleri içeren sindirim ortamı ile doldurun ve rotasyon sırasında karıştırmaya izin vermek için küçük bir hava boşluğu bırakın. Sindirimden sonra numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede 360 derecelik bir döndürücüde sekiz RPM'de inkübe edin.

Numuneleri beş dakika boyunca 600 G santrifüjleme ile peletleyin. İnsan dokusunun atılması için kurumsal yönergeleri izleyerek süpernatan yağ ve ortamı atın. Doku sindirimini izlemek için, peletin küçük bir Eloqua'sını ortamda seyreltin ve tamamen sindirilmiş organoidlerde mikroskobik olarak inceleyin, bağlı stroma gösterecektir.

Doku tamamen saf organoidlere sindirilene kadar enzimatik sindirimi tekrarlayın. Gece boyunca ikinci bir sindirime ihtiyaç duyulursa, aşırı sindirimi önlemek için enzim konsantrasyonunun azaltılması gerekebilir. Düzgün sindirilmiş organoidler, bağlı stromadan arınmış, pürüzsüz görünümlü duktal alveolar veya duktal alveolar yapılar gösterecektir.

Sindirim tamamlandığında, tekrar son peleti orta yer antibiyotiklerde askıya alır. Sindirilmiş numuneyi kuatlar halinde steril 100 mikronluk bir süzgeçten steril 50 mililitrelik bir tüp üzerinden geçirin. Ortam tüpe boşaltıldıktan sonra, organoidleri üç mililitre ortamla yıkayın.

Yeniden askıya alınan peletin tamamı aktarılana kadar tekrarlayın. Daha sonra filtreyi steril bir tüp üzerinde dikkatlice çevirin ve organoidleri daha fazla ortamla tüpe yıkayın. Burası 100 mikronluk organoid havuzu.

Şimdi, orijinal 50 mililitrelik tüpe boşaltılan materyali 40 mikronluk bir süzgeçten geçirin ve alveolar yapıları tek hücrelerin süzüntü havuzundan ve küçük mezenkimal ve epitel hücre kümelerinden ve küçük vasküler doku parçalarından ayırın. 100 mikron, 40 mikron ve süzüntü havuzlarını 600 G'de beş dakika santrifüjleyin. Her numuneyi bir mililitre ccpm kullanarak sulandırın.

0.1 mililitre paketlenmiş damak başına iki dondurma çözeltisi. Dört santigrat derecede tutun. İki organoid havuzunun her birinden 0.1 mililitreyi dikkatlice yerleştirin.

Bir veya 2 adet 35 milimetrelik tabak üzerinde eşit bir dağılımla damla damla. Organoidlerin yapışmasına izin verdikten birkaç dakika sonra bulaşık yüzeyini çizmekten kaçının. Organoidlerin yerinden çıkmasını önlemek için büyüme ortamlarını yavaşça ekleyin.

Daha sonra birincil kültürleri nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ayrıca süzüntü havuzunun 0.1 mililitresini doğrudan fibroblast ortamı ile doku kültürü plastiğine tohumlayın. Birincil kültürleri nemlendirilmiş CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.

24 ila 48 saat sonra, organoidlerden hücre göçünü kontrol edin ve iki ila üç gün sonra mitotik büyüme kültürünü izleyin. Hücreler birleşmeye yakındır, ortamı her iki ila üç günde bir yeniler. Damar sisteminin küçük parçaları yapışabilir ve fibroblast hücre büyümesine neden olabilir.

Önemli fibroblast büyümesi durumlarında. Fibroblastları büyük epitel yamalarından çıkarmak için diferansiyel trippin izasyonu gerçekleştirin. Hücreleri STE tamponunda bir kez yıkayın.

Ardından, sürekli mikroskobik gözlem ve tabağın sert bir yüzeye yumuşak ama keskin darbeleri ile tabağı kaplamak için taze 0,5 mililitre STE ekleyin. Epitel hücreleri hala yapışık geçiş halindeyken fibroblast dekolmanı olup olmadığına bakın. Epitelyal büyüme yamaları birleşmeye yaklaştığında birincil kültürler.

Birincil kültürü korumak ve birden fazla ikincil kültür oluşturmak için kısmi tripsin kullanın. Hücreleri STE tamponunda bir kez yıkayın, ardından sadece tabağı kaplamak için taze STE ekleyin. Hücrelerin yaklaşık% 50'sinin ayrıldığını izleyin.

Daha sonra büyüme ortamı içeren iki mililitre serum ekleyin ve hücreleri hasat edin. Daha sonra hücreleri iki yıkamadan sonra steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hasat edilen hücreleri ve kültürü bir araya getirin: Kısmi izasyon, birincil yemeklerden iyi hücre büyümesi ve alt kültürden veya donmuş ikincillerden eşdeğer uzun süreli büyüme ile yaklaşık dört ila sekiz kez tekrarlanabilir.

Hücrelerin saklanması için ilk kısmi tripsin izasyonundan dondurulmasını ve alt kültür için ikinci PT'den hücrelerin kullanılmasını öneririz. Doku uygun şekilde sindirildiğinde ve filtrelendiğinde, organoidleri görüntüleyen, duktal ve alveolar yapılar, yapışık stromadan arınmış pürüzsüz kenarlarla görülebilir. Az sindirilirse, materyal bağlanacak ve daha fazla fibroblast kontaminasyonu olacaktır, eğer aşırı sindirilirse, kenarlar pürüzlü olacak ve organoid bağlandıktan sonra bağlantı daha az verimli olacaktır.

Epitel büyümesi 48 ila 72 saat içinde 48 saatte başlar. 72 saate kadar gözle görülür mitoz ile henüz aktif hücre bölünmesi yoktur. Mitoz daha görünür hale gelmelidir.

Küçük damar sistemi parçaları, dört gün sonra mezenkimal hücre büyümesinin bir kaynağı olabilir. Epitelyal büyümeler morfolojik olarak heterojen popülasyonlar gösterir, burada keratin 14 ve keratin 19'a karşı antikorlarla boyanır, yeşil K 19 pozitif luminal ve kırmızı K 14 pozitif miyoepitel soylarını ve ayrıca sarı K 14 pozitif K 19 pozitif progenitör hücreleri işaretler. HMEC, farklı ortam formülasyonlarında kültürlenebilir.

Kolera toksini ve oksitosin ile takviye edilmiş M 87 a gibi düşük stresli ortamlar, normal pre staz HMEC'in üstün uzun vadeli büyümesinin yanı sıra çoklu HMEC soylarının büyümesini destekleyecektir. Olgu analizi sonuçları, kültürlenmemiş organoidlerdeki soy çeşitliliğini ve dördüncü pasajda, M 87, A ortamında kültürlenen HMEC'yi göstermektedir. Burada, luminal ve miyoepitelyal popülasyonlar, luminal belirteçlerin, EPCA ve CD 2 27'nin ve miyoepitelyal belirteçlerin CD 49 F ve CD 10'un yeniden kaplanması ile tanımlanır.

Dördüncü pasaj, HMEC. Önceki luminal ve miyoepitelyal belirteçler için zenginleştirilmiş gerçekler, keratin K 14 ve K 19 HMEC için immünofloresan analizleri kullanılarak soylarını doğrulamıştır. Dördüncü pasaja kadar plastik üzerinde kültürlenmiş, uygun CD 2 27 içine yerleştirildiğinde luminal ve miyoepitelyal hücrelerin in vivo benzeri soy ilişkileri ile organize yapılar oluşturma yeteneğine sahiptir ve CD 10 bu iki soy için zenginleştirmek için kullanılır.

HMC'ler, miyoepitelyal hücrelerin içindeki luminal hücrelere sahip mikro desenli 3B mikro kuyularda uygun 3B hücre organizasyonu oluşturma yeteneklerini korurlar. Gerçekler: Zenginleştirilmiş progenitör hücreler, matrigel ile kaplandığında duktular ve alveolar yapıları taklit eden sağlam 3D yapılar da oluşturabilir. Matrigel'deki 3B yapılar aynı zamanda uygun 3B kendi kendine organizasyon sergiler.

Bu videoyu izledikten sonra, meme bezinin epitel kısımlarını ilişkili meme stromasından nasıl arındıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki ila üç gün boyunca yapılabilir. Doku işleme tekniği genellikle basittir.

Sindirimi doğru noktada durdurmayı unutmamak önemlidir.