Name: Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Öğrenin, meme bezinden epitel hücrelerini izole etmek için cerrahi atık materyalden organoid üretme yöntemini. Bu teknik, insan epitel hücre biyolojisi ve karsinojenizma araştırmalarını ilerletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MAL, JCG ve MRS NIA (R00AG033176 ve R01AG040081) tarafından ve Laboratuvar Yönlendirilmiş Araştırma ve Geliştirme, # DE-AC02-05CH11231 Enerji sözleşme ABD tarafından desteklenmektedir.

1. Doku İşleme ve Sindirim <ol><li> Cerrahi girişimlerden ıskarta malzeme olarak insan meme dokusu elde edilir. Azaltma mammoplasties normal veya iyi huylu hücreleri sağlayabilir; fibroadenom ve gynecomastias huylu hücreleri sağlamak; tümör olmayan mastektomi dokuları (periferik ya da tümöre kontralateral veya subkutan) normalden içeren microtumors benign kadar değişebilir hücreleri verin. Uygun IRB onayı öncesinde ıskarta malzeme elde bulunduğundan emin olun. Tüm malzeme kan ile taşınan patojen düzenlemeler altında tedavi edilmelidir. </li><li> Ya da tampon ortamı içeren steril kaplar (örneğin 1:01 Dulbecco Modified Eagle Medium ve Ham&#39;ın F-12) içinde yer malzeme 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 5 ug / ml Fungizone, 50U/ml polimiksin B, ile desteklenmiş 4, laboratuar ve% 10 fetal bovin serumu, ve nakil ° C. Azaltma mammoplasty dokusu belirgin pa etkilemeden 72 saat süreyle 4 ° C&#39;de saklanan ya da sevk edilebilirbsequent hücre canlılığı. Olmayan azalma mammoplasty küçük doku parçaları daha hızlı işleme gerektirebilir. </li><li> Steril neşter, forseps ve makas bir arada kullanarak yağ dokusu, bağ dokusu ve kan damarlarının stromal matriks gelen epitelyal alanlarda ayırın. Büyük bir cam steril çanak makas ve yer ile doku parçaları (örneğin, 150 mm) kesin. Yavaşça fena halde yağ malzeme uzakta kazımak için malzeme ve neşteri tutmak için forseps kullanarak, sarımsı stromal matriks içinde gömülü beyaz iplikçikler olarak görünür epitel alanlar üzerinden teşrih. Hazmı kolaylaştırmak için, 50 ml&#39;lik bir deney tüpüne karşıt neşter ve yer kullanarak ~ 3-4 mm küçük parçalar halinde epitel doku kesti. Doku büyük miktarlarda işleniyor ise, taze neşter bıçakları gerekli olabilir. Kurumsal düzenlemelere göre imha için çanak yağlı malzemeyi çıkarın. <ol class="lalpha"><li> Yoğun fibröz doku (örneğin, subkutan masŞiddetli fibrokistik hastalığı olan tectomies), daha katı beyaz, non-epitelyal malzeme olacaktır. Böyle fibröz matrislerinden epitel hücreleri incelemek için zor olabilir. Lifli malzemeden Büyük parçalar alanında ~ 1-3 mm kare ve ayrı sindirilir küçük parçalar halinde kesilebilir. </li></ol></li><li> Tüpün hacmi büyük olmayan bir daha üçüncü ihtiva eden doku ile bir konik santrifüj tüpü (50 ml veya 15 mL) içine parçalanmış, epitel doku yerleştirin. Doku sindirimi bir karışım (DME/F-12 ya da eşdeğer, 10 ug / ml insulin, yukarıdaki gibi antibiyotikler, ve 10, nihai konsantrasyonu kullanılarak, rotasyon esnasında karıştırma için izin vermek için sadece küçük bir hava boşluk bırakarak, dolu hacme tüp getirin % FCS, 200 U / ml ham kolajenaz ve 100 U / ml hiyaluronidaz. </li><li> Place HulaMixer tüp döndürücü üzerindeki tüpler ve 37 geceleme 8 rpm&#39;de 360 ​​° döndürmek ° C. </li><li> 5 dakika boyunca 600 x g tüpler santrifüjleyin. Bertaraf anlaşmasının süpernatant yağ ve orta atınkurumsal düzenlemelere ing. </li><li> Ortam içinde pelet bir küçük kısım seyreltilmesi ile sindirim tamamlanması için kontrol edin. Sindirim mikroskobik inceleme ekli stromada (Şekil 1A) arınmış pürüzsüz görünümlü, duktal alveoler veya duktal-Alveoler yapıların sahip hücreleri kümeleri (organoids) gösterdiğinde tamamlandı. Azaltma mammoplasty dokular genellikle hala bir gecede sindirim sonra ekteki stromada gösterecek ve ek sindirim zaman gerektirecektir. <ol class="lalpha"><li> Başka bir 4-12 saat boyunca 37 ° C &#39;de dönme ile taze doku sindirim ve karışım yeniden inkübe tam olarak sindirilmiş pelet yeniden süspanse edin. Adımları 1.6 ve 1.7 tekrarlayın. Sindirim hala tamamlanmamış ise, yine 37 ° C&#39;da rotasyonu ile pelet ve yeniden inkübe sindirim karışımı ekleyin. Enzim konsantrasyonu üzerinde bir gecede-sindirim önlemek için düşürülebilir. </li></ol></li><li> Sindirim tamamlandığında, 5 dakika boyunca 600 x g santrifüj tüpleri, özet aspireyaklaşık 15 ml/50 ml tüp, 5 ml/15 ml tüp yerinde orta artı antibiyotik iyon karışımı, tekrar süspansiyon pelet. </li></ol> 2. Filtrasyon ve Sindirilmiş Malzeme Donma <ol><li> Steril bir 50 ml tüp üzerinde steril bir 100 mikron süzgeçli üzerine yeniden süspanse pelet alikotları aktarın. Tüp içine orta tahliye edelim, sonra orta 2-3 ml üst 1-2x kez organoids rewash. Yeniden süspanse pelet tüm devredilmiştir kadar tekrarlayın. Çok sayıda filtre üzerinde organoids ve orta artık kolayca drene var ise, kalan madde yeni bir filtre (ler) kullanılır. Dikkatlice bir steril tüp üstüne filtre (ler) çevirin ve daha orta tüpüne organoids yıkayın. Bu 100 mikron organoid havuzudur. </li><li> Orijinal 50 ml tüp içine drene materyal atın ve çoğunlukla Alveoler yapıların bulunduğu 40 mikron organoid havuzu, elde etmek, 40 mikron süzgeçli kullanarak 2.1 işlemi tekrarlayın. Inci drene malzemesiE tüpü mezenkimal ve epitel hücrelerin damar küçük parçalar tek / küçük öbekler içeren süzüntü havuzu oluşturmaktadır. </li><li> 5 dakika boyunca 600 xg&#39;de Pelet 100 um, 40 um, ve süzüntü havuzlar. </li><li> Süpernatant, sulandırmak paketlenmiş pelet, 0.1 ml başına CPMII yaklaşık 1 ml kullanılarak CPM II (DME/F-12 ya da% 44 FCS ve% 6 DMSO ile eşdeğer) olarak her bir tüp aspire. 4 ° C&#39;de tutun </li><li> Aşağıda 3.2 gibi damla 35 mm doku kültürü plastik tabak damla içine yeniden süspanse malzeme 0.1 ml koyarak Tohum 2 organoid havuzları için bir test çanak. Süzülen madde havuzu doğrudan fibroblast ortam (10 ug / ml insulin,% 10 FBS ile DME/F-12 ya da eşdeğeri) ile doku kültür plastik üzerine ekildi edilebilir. </li><li> Nunc tip dondurma ampul (1 ml / 2 ml ampul) içine tablet kalan malzeme yeniden süspanse. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca dondurmak ve daha sonra sıvı azot içinde saklama için derhal aktarın. Biz canlılığı herhangi önemli bir kayıp gözlenmiştir değilbizim orijinal ampul saklanan geç 1970 yılından bu yana dondurulmuş. </li></ol> 3. Dondurulmuş Organoids ve İlköğretim Kültürlerin Altkültür Tohum <ol><li> Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde organoids içeren dondurulmuş ampul eritin. Ampul içinde organoids sayısı görsel tahmini bağlı olarak 2-10 (genelde ~ 6) 60 mm tabaklar, ya da 1-3 100 mm tabaklar içine Tohum organoids. 60 mm tabak başına ekilmiş yaklaşık 20-40 organoids uygunudur. </li><li> Çözülmüş organoids özenle yerleştirilir, organoids eşit bir şekilde dağıtımı için 1 ml pipet veya Pasteur pipeti ile çanak yüzeye, damla damla. Organoids birbirine yakın altkültür ya da dondurma için daha az hücre sebebiyet veren, akıbet için sınırlı alana sahip olacaktır yerleştirilir. (Hücreler geçmişte çizilmiş yüzeylere büyümek değil eğilimindedir) çanak yüzeyi çizilmeye kaçının. Organoids takın ve daha sonra yavaşça organoids (örneğin 2-3 ml/60 mm çanak) yerini değiştirmemek önlemek için üreme ortamı eklemek için izin vermek için 1-2 dakika bekleyin. Ben37 ° C nemlendirilmiş CO 2 inkübatör ncubate. Bunlar, primer kültürlerden vardır. Şu anda en sağlam HMEC büyüme (Şekil 2) için M87A + oksitosin (X) orta kullanın. </li><li> 1 gün sonra, organoids takılı olup olmadığını kontrol. Ek orta (ör. 2-3 ml/60 mm çanak) ekleyin. Organoids gelen Hücre göçü tohumlama sonrası 48-72 saat (Şekil 1B, C) ​​24-48 saat ve mitotik akıbet tarafından görünür olmalıdır. Bazen eki özellikle yaşlı kadınlar overdigested organoids veya organoids kaplama varsa, 24 saat sonra kötü, ama en hazırlıklar 72 saat içinde eklenecektir. Damar küçük parçalar eklemek ve fibroblast hücre akıbet (Şekil 1D) yol açabilir. </li><li> Kültürler en az haftada 3 kez besleyin. M87A-tipi medya yetiştirilen hücreler ekim yoğunluğu bağlı olarak 5-8 gün içinde yakınındaki izdiham büyür. </li><li> Esas önemli fibroblast büyüme, Diferansiyel trypsinization (DT), varsayüzey plastik fibroblastlann hızlı ayrılma, fibroblastlar kaldırmak için gereklidir. Epitel yamalar STE (salin,% 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA), aspirat büyük, aspirat medya, yıkama çanak (örneğin, 1-2 ml/60 mm çanak) hale geldiğinde, oda sıcaklığında taze 0,5 ml STE ekleyin ve bırakın Sürekli mikroskobik gözlem ile yaklaşık 1 dk. Fibroblastlar ayırmak ancak epitel hücreleri nazikçe, hala yapışık ancak keskin fibroblastlar çıkarmak için sert bir yüzeye karşı çanak yan vurmak ve daha sonra hızlı bir şekilde aspire zaman. PBS ile bir kez yıkayın ve tekrar aspire. Ağır fibroblastlar ile kirlenmiş Kültürler, ilave DT gerekebilir. </li><li> Büyük epitel yamalar mevcut primer kültürlerinde altkültür, ama izdiham önce. Organoid tohumlama ve bağlanma yoğunluğu gereken süre de etkiler. Primer kültür korumak için ve zamanla aralıklı birden fazla ikincil kültürlere, üretmek için, biz Kısmi Trypsinizations (PT) gerçekleştirin. </li><li> Aspire medya, çanak 0.5 ml taze STE ekleyin, 1-2 ml STE ile 60 mm çanak yıkayın. Hücre ayırma desteklemek için çanak yumuşak vurma ile, 1-5 dakika için oda sıcaklığında mikroskop altında hücre ayırma dikkate alınmalıdır. Tripsinizasyonla hücrelerinin ~% 50 ayrılmış olduğunda kesilmelidir. Erken PT genellikle hızlı hücre dekolmanı var. Bütün hücrelerin hızla yerinden çıkabilir şekilde daha sonra puan için, hücreler, dikkatli kontrolü ile, daha hızlı ayrılması için 37 ° C &#39;de yerleştirilebilir. </li><li> Çanak serum içeren medya 2 ml ekleyin, repipette yıkayın ve steril bir 15 ml tüp aktarmak. Tüp yıkama ekleyerek, bir başka ~ 1-2 ml medya ile 2x tekrarlayın. Birincil çanağı tekrar çember yükleme ve inkübatör dönmek. Haemocytometer ile tüp hücreleri sayın. Kez pasaj, hücreler no lo vardır; ÖLÇÜMÜ pasaj veya dondurulmuş sekonder (ikinci pasaj hücreler sekonder denir gelen birincil yemekleri ve eşit uzun-vadeli büyüme iyi hücre büyümesi ile 8 yaklaşık 4 kez tekrar edilebilirnger primerler). Bir kez organoid malzeme primer kültürlerinde mevcut artık, pasaj ikinciller uzun vadeli nüfus katlama potansiyeli bir düşüş göstermektedir. </li><li><ol class="lalpha"><li> Ikincilleri altkültür için, tohum hücreleri doğrudan yemekleri içine tüp. Böyle M87A + X gibi bir sağlam orta 1-2 x 10 5 cells/100 mm çanak Tohum 4-7 gün izdiham yol açacaktır. Biz proliferatif potansiyelini artırmak için ikinci pasaj da orta kolera toksin ekleyin; bunu organoids gelen çok katmanlı hücre akıbet yol açar, çünkü kolera toksininin primer kültür çıkarılmıştır. </li><li> Dondurulması için ikincil olarak, pelet, tüp 10 6 hücre / ml &#39;lik bir nihai yoğunluğa sahip CPMII de 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 600 x g&#39;da. Tablet, Nunc tipi dondurucu ampul içine hücreleri yeniden süspanse -80 gecede dondurmak ° C ve daha sonra sıvı azot depolama derhal aktarın. </li></ol></li><li> Bu koruma için ilk PT hücreleri dondurmak tavsiye edilir vealtkültür için ikinci PT hücreleri kullanır. Ek ÖLÇÜMÜ ileride kullanılmak üzere dondurulabilir saklanabilir. </li></ol>

<ol><li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li>
<li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus%3A+all+for+one+or+one+for+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li>
<li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li>
<li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li>
<li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo%28a%29pyrene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li>
<li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li>
<li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li>
<li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li>
<li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -L., Ljung, B. -M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Gene%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li>
<li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -L., Lee, J. -H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li>
<li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li>
<li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li>
<li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li>
<li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan insan meme dokusu işleme yöntemi insan meme hücre tiplerinin heterojen karışımı saf meme epitel hücreleri elde sağlar. Sabit büyüklükte gözenekler aracılığıyla Filtrasyon sindirilmiş stromal matriks gelen meme bezinin çeşitli fraksiyonları (örneğin, duktal ve duktal-alveoler vs alveol) ayrılması sağlar. İzogenik meme fibroblastlar epitel hücreleri maç için elde edilebilir. Dondurulmuş sindirilen malzemenin 30 yıl boyunca iyi bir canlılık korudu. Bu yöntem, tüm ama çok fibröz meme dokuları üzerinde başarıyla çalışmış ve gerçekleştirmek için basit gelmiştir. Meme dokusu işleme Diğer varyasyonları olarak uygulanabilir, temiz veya ayrılmış olan epitelyal kesirler vermeyin var. Böyle M87A gibi düşük stres yaratıcı medya kültürü işlenmiş organoids Yerleştirme birden soy belirteçleri ile HMEC uzun vadeli büyüme sağlar. Plastik kültüre oylandı HMEC hala cins yeteneğini korumakvivo benzeri soy ilişkileri normal te 3D yapılar. Bu HMEC kültürler Normal HMEC davranış ve yaşlanması ve dönüşüm itmek veya inhibe edebilir faktörlerinin yüksek verimlilik dahil olmak üzere kapsamlı deneysel incelenmesi, için uygundur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Cam Petri kabı 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Makas 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Forseps 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Atılabilir Neşterler </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidaz </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / Streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polimiksin B sülfat </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Yaşam Teknolojileri</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin 100 ml </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Hücre süzgeç 100 mikron </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Hücre süzgeç 40 mikron </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tüpler 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tüpler 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC yemekler 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC yemekleri 6 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Kriyojenik şişeleri </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Bilimsel </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf modeli </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

hücre kültürü İnsan azaltma meme cerrahisi ve mastektomi doku İşleme

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Deneysel normal insan meme epitel hücresi (HMEC) davranış incelenmesi ve nasıl normal hücrelerin anormal mülk edinme, in vitro kültür sistemleri ile sağlanabilir in vivo, biyoloji daha doğru modeli. Hücre farklılaşması incelemek için insan kaynaklı malzemenin kullanımı, yaşlanma, yaşlanma, ve ölümsüzleşme 1-2 insan ve yaygın olarak kullanılan, kemirgen hücreler arasındaki bu özellikler de çok önemli moleküler farklılıklar nedeniyle özellikle avantajlıdır. Normal ve anormal dokular büyük miktarda azalma mammoplasty ve mastektomi ameliyatları frekansa bağlı bulunması nedeniyle meme hücreleri uygun bir model sistem sunuyoruz. Meme bezi çok sayıda farklı hücre türleri, örneğin, epitel, yağ, mezenkimal, endotelyal karmaşık bir karışım oluşur. Epitel hücreleri, laktasyon farklılaşmış meme fonksiyonu sorumludurve aynı zamanda insan meme kanserlerinin büyük çoğunluğunun kökeni vardır. Biz saf epitel bileşenleri içine yanı sıra mezenkimal hücreler 3 meme bezinin cerrahi ıskarta dokuları işlemek için yöntemler geliştirmişlerdir. Işlenmiş materyal süresiz dondurularak veya primer kültürü içine başlatılabilir. Cerrahi ıskarta malzeme laboratuara getirilerek elle epitel içeren dokuların için zenginleştirmek için disseke edilir. Disseke doku sonraki sindirim bazal membran epithelia gelen kollajenaz ve hyaluronidaz şeritler stromal malzeme kullanarak. Epitelyal ağacının çıkan küçük parçalar (organoids) sabit gözenek boyutu membranları üzerinde ardışık süzme ile sindirilmiş stroma ayrılabilir. Gözenek büyüklüğüne bağlı olarak, daha büyük bir fraksiyonu alveolar / duktal parçaları, daha küçük boşluklu kümeleri ya da stromal hücrelerin oluşan elde edilebilir. Kültürler dis gibi yerine organoids olarak başlatılan zaman biz üstün bir büyüme gözlemlediksociated tek hücre. Düşük stres indükleyici medya kullanarak kültür organoids Yerleştirme birden soy türleri (myoepitelyal luminal, progenitör) 4-5 belirteçleri normal HMEC uzun vadeli büyüme destekler. Hücrelerin yeterli sayıda yüksek üretim yöntemleri kullanılarak standart hücre gruplar, hem de sorgulama kullanılarak geniş deneysel inceleme izin verecek şekilde bir bireyin dokusundan elde edilebilir. Kültürlü HMEC büyüme, farklılaşma, yaşlanma ve yaşlanma, ve nasıl bu normal süreçler ölümsüz ve malign transformasyon 4-15,16 sırasında değişmiş yöneten normal süreçleri araştıran çalışmaların geniş bir yelpazede istihdam edilmiştir. Ekstrasellüler matris malzemesi, diğer hücre tipleri ve / veya 3D kültür varlığında büyüme etkileri plastik 5,15 üzerinde büyüme ile mukayese edilebilir. Kültürlü HMEC, normal hücreler ile başlayarak, bu faktörleri incelemek için bir deneysel olarak çözülebilir bir sistem sağlamakinsan yaşlanması ve karsinogenez itmek veya önleyebilir.

Uygun organoids ile sindirilir ve kültür içinde yerleştirilmiş doku için Örnek Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Eksik sindirilmiş doku malzemesi yine bu yapıların dışında bağlı, ve büyük olasılıkla DT kaldırmak gerektiren, primer kültür bazı fibroblastik hücre büyümesi olacak gösterecektir. Overdigested dokusu daha az düzgün dış sınırlar gösterecek, ve primer kültür takmak için uzun sürebilir. Epitel akıbet 48-72 saat (1B, C) ​​içerisinde başlamalıdır. Damar (1D) küçük parçaları mezenkimal hücre akıbet bir kaynak olabilir. Epitel çıkıntılar myoepitelyal, progenitör ve lümen soylar (1E, 3C-E) ile ilişkili marker ile hücrelerin karışımlar içerir proliferatif nüfusa sahip, morfolojik heterojen popülasyonlarının göstermektedir. Kolera toksini ve oksitosin ile desteklenmiş gibi M87A gibi düşük stres ortamında büyüme nitelikli uzun vadeli destek verecekNormal ön durağanlığı HMEC büyüme önceki ortam formülasyonu (Şekil 2) ile karşılaştırıldı. Bundan sonra, çoğu hücreler sadece myoepitelyal soy işaretleri göstermek; M87A-tipi medya da 4-8 (Şekil 3C-E, 4) pasajlar aracılığıyla luminal ve progenitör hücrelerin büyümeyi destekleyecek. Plastik kültüre HMEC myoepithelial hücreleri (Şekil 4A, B) iç lümen hücreleri ile, micropatterned 3D mikro öz-örgütlenme uygun 3D oluşturmak için yeteneklerini koruyabilir ve Matrigel (4C, D) kaplama yaparken organize yapılar oluştururlar. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. HMEC organoids ve birincil kültür. (A) organoid sindirim ve filtrasyondan sonra duktal-alveolar yapısını göstermektedir. (B, C) 2 gün primer kültür yerleştirme sonrası duktal ve alveolar yapısını gösteren Organoids; başlangıç ​​hücresi outgr unutmayınowth (beyaz oklar). (D) Küçük damar ve B, C gibi aynı kültürden fibroblast akıbet başlangıç ​​ile ekli 4 gün sonra primer kültür organoid (E) Epitelyal hücre sonucudur. Soy K14 (kırmızı) ve K19 (yeşil) karşı antikorlar ile boyanarak tanımlanır; çekirdeklerin DAPI (mavi) ile boyandı. Luminal (K14-/K19 +, yeşil), myoepitelyal (K14 + / K19-, kırmızı), ve progenitör (K14 + / K19 + sarı) hücreleri görülebilir. Boyanmamış hücrelerinin eksik antikor nüfuz dolayı organoid çekirdek görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Tek bir kişi, örnek 184, elde edilen farklı medya formülasyonlarda HMEC kültürlerin Büyüme. Organoids farklı medya formülasyonları kullanılarak primer kültür başlanmıştır. En iyi uzun vadeli büyüme bizim en son formülasyon, M87A + oksitosin (X) 4 kullanılarak elde edilmektedir. Bu besiyeri de desteklerBirden HMEC soy büyüme (Şekil. 1E bakın). Bir önceki medya formülasyon, 3 MM az güçlü büyüme sağlanan sırasında serum serbest medya MCDB170 (ticari MEGM) hızlı siklin kinaz inhibitörü p16 INK4A indüksiyonu ve 7,11,13 anormal hücrelerin seçimi için 17 ipucu. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. (A) ve EpCAM CD49f/alpha 6 integrin ifadesi, ve (B) CD227/Muc1 için bir kültürsüz, enzimatik olarak ayrışmış organoid 4 inci geçiş. (A, B) FACS analizi de kültürsüz organoids ve kültürlü HMEC içinde soy çeşitlilik karşılaştırılması ve CD10/CALLA. (C, D) FACS (C) EpCAM ve CD49f/alpha 6 integrin ekspresyonu için 4 inci geçiş öncesi durağanlığı HMEC analizi, ve (D) CD227/Muc1 ve CD10/CALLA. Tanımlanabilir populations LEP (lümen belirteçleri EPCAM veya CD227 eksprese), MEP (myoepitelyal belirteçleri CD49f veya CD10 eksprese eden), veya PROG (CD49f + / EPCAM + nüfus zenginleştirilmiş) olarak etiketlenir. EpCAM ve CD49f değişiklikler kültürü yönetmeliğe uyum sürecinde kültürsüz organoids kıyasla unutmayın. (E) Unsorted HMEC ve 4. paragraflarını FACS zenginleştirilmiş LEP ve MEP soy kimlik doğrulamak için keratin K14 (MEP belirteci) ve K19 (LEP belirteci) immünofloresan analiz için boyandı. DAPI ile Çekirdekler lekeli mavi görünür. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Kültürlü HMEC uygun mikro yerleştirilir vivo gibi soy ilişkileri ile organize yapılar oluşturma yeteneğine sahiptirler. (A) Pre-durağanlığı 4. pasaj HMEC FACS-zenginleştirilmiş i olmuşturnto lümen LEP ve myoepitelyal MEP soyları (şekilde gösterilmemiştir) ve K14 K19 ekspresyonu tarafından doğrulanması, bu soyların birlikte, CD10 ve CD227 için belirteçleri kullanarak. (B) micropatterned mikro birlikte karıştırıldığında, kültür hücreleri dışında ve LEP iç üzerine MEP ile Bilayerlar içine öz-örgütlenme yeteneğine sahip idi [Chanson ark uyarlanmıştır. 5]. Floresan etiketli LEP (yeşil) ve MEP (kırmızı) mikro (üst) ek sonra bir konfokal 0 saatte mikroskop, 24 saat ve 48 saat ile görüntülendi. Kontrol HMEC keyfi kırmızı veya yeşil floresan etiket (alt) ile işaretlendi. (C) FACS zenginleştirilmiş progenitör hücrelerin Aydınlık alan görüntüsü (cKit +) 3D (Matrigel) kültür kaplama ve 18 gün boyunca büyüdü. Ortaya çıkan yapılar alveoler morfolojilerinden sergileyebilmektedir. (D) Yapıları Matrigel çıkarılan ve K14 ve K19 tespit etmek boyandı; çekirdeklerin DAPI ile zıt edildi. Immünofloresan analiz doğru lümen ve bazal pola ile organize yapılar gösterirLineerite.

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Bu protokol, meme bezinin epitel kısımlarını ilişkili meme stromal hücrelerinden izole etmeyi amaçlar. Enzimatik sindirim kullanarak epitel yapılarını zenginleştirmek için cerrahi ıskarta materyalinin tahakkuk eden diseksiyonu ile başlayın. Epitelyal organoidleri bazal membranın dışındaki stromal materyalden ayırın.Daha sonra zenginleştirilmiş fraksiyonlar elde etmek için sindirilmiş organoidleri sabit gözenek boyutlu hücre süzgeçlerinden geçirin. Organoidleri hemen kültür için tohumlayın veya ileride kullanmak üzere stokları dondurun. Sonuç olarak, epitelyal organoidler, normal insan meme epitel hücrelerinin uzun süreli kültürlerini oluşturmak için kullanılır.Bu yöntemi ilk olarak 1970'lerin sonlarında insan epitel hücre biyolojisi ve karsinogenez alanını ilerletmek için geliştirdim. Normal insan hafıza dokularından bol miktarda cerrahi ıskarta materyali mevcuttu. İhtiyaç duyulan şey, bu yığın heterojen materyali, uzun vadeli büyümeyi desteklemek için saf epitel hücre kültürü ve ortamı için uygun hale getirmek için işlemek için bir yöntemdi.Bu yöntemin görsel gösterimi, özellikle ham diseksiyonun nasıl yapılacağına dikkat etmek için yararlıdır. Düzgün sindirilmiş organoidler neye benziyor? Organoidlerin filtrelenmesi ve organoidlerin kültür için kaplanması.Bu tekniğin avantajı, stroma için temiz epitel fraksiyonları sağlaması ve epitel hücrelerinin sağlam kalmasıdır. Bulduğumuz organoidler, en iyi başlangıç büyümesini sağlar ve elde edilebilecek hücre sayısını en üst düzeye çıkarır. Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı'ndan iki bilim adamı, James Garvey ve Mark LeBarge şimdi bu prosedürü gösterecek Cerrahi prosedürlerin atılan materyalinden.Dört santigrat derecede tampon veya tam besiyeri artı antibiyotik içeren steril kaplarda insan meme dokusu elde edin. Doku parçalarını kesin ve bunları büyük bir cam steril tabağa koyun. Epitel alanlarını yağ dokusu, bağ dokusu ve kan damarlarının stromal matrisinden ayırın.Daha sarı stromal matrise gömülü epitel alanlarının beyaz tellerini nazikçe inceleyin. Malzemeyi forseps ile tutun ve aşırı yağlı malzemeyi bir neşter ile kazıyın. Daha sonra karşıt neşterlerle, sindirimi kolaylaştırmak için epitel dokusunu yaklaşık dört milimetrelik parçalara bölün.Diseke epitel dokusunu 50 veya 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın Ağır fibröz dokuda. Daha fazla katı beyaz epitel olmayan materyal olacaktır. Epitel hücrelerini bu tür fibröz matrislerden çıkarmak zorsa.Doku bir ila üç milimetre kare alana sahip parçalar halinde kesilebilir ve ayrı ayrı sindirilebilir. Tüpü ham kollajenaz ve yüksek alur günleri içeren sindirim ortamı ile doldurun ve rotasyon sırasında karıştırmaya izin vermek için küçük bir hava boşluğu bırakın. Sindirimden sonra numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede 360 derecelik bir döndürücüde sekiz RPM'de inkübe edin.Numuneleri beş dakika boyunca 600 G santrifüjleme ile peletleyin. İnsan dokusunun atılması için kurumsal yönergeleri izleyerek süpernatan yağ ve ortamı atın. Doku sindirimini izlemek için, peletin küçük bir Eloqua'sını ortamda seyreltin ve tamamen sindirilmiş organoidlerde mikroskobik olarak inceleyin, bağlı stroma gösterecektir.Doku tamamen saf organoidlere sindirilene kadar enzimatik sindirimi tekrarlayın. Gece boyunca ikinci bir sindirime ihtiyaç duyulursa, aşırı sindirimi önlemek için enzim konsantrasyonunun azaltılması gerekebilir. Düzgün sindirilmiş organoidler, bağlı stromadan arınmış, pürüzsüz görünümlü duktal alveolar veya duktal alveolar yapılar gösterecektir.Sindirim tamamlandığında, tekrar son peleti orta yer antibiyotiklerde askıya alır. Sindirilmiş numuneyi kuatlar halinde steril 100 mikronluk bir süzgeçten steril 50 mililitrelik bir tüp üzerinden geçirin. Ortam tüpe boşaltıldıktan sonra, organoidleri üç mililitre ortamla yıkayın.Yeniden askıya alınan peletin tamamı aktarılana kadar tekrarlayın. Daha sonra filtreyi steril bir tüp üzerinde dikkatlice çevirin ve organoidleri daha fazla ortamla tüpe yıkayın. Burası 100 mikronluk organoid havuzu.Şimdi, orijinal 50 mililitrelik tüpe boşaltılan materyali 40 mikronluk bir süzgeçten geçirin ve alveolar yapıları tek hücrelerin süzüntü havuzundan ve küçük mezenkimal ve epitel hücre kümelerinden ve küçük vasküler doku parçalarından ayırın. 100 mikron, 40 mikron ve süzüntü havuzlarını 600 G'de beş dakika santrifüjleyin. Her numuneyi bir mililitre ccpm kullanarak sulandırın.0.1 mililitre paketlenmiş damak başına iki dondurma çözeltisi. Dört santigrat derecede tutun. İki organoid havuzunun her birinden 0.1 mililitreyi dikkatlice yerleştirin.Bir veya 2 adet 35 milimetrelik tabak üzerinde eşit bir dağılımla damla damla. Organoidlerin yapışmasına izin verdikten birkaç dakika sonra bulaşık yüzeyini çizmekten kaçının. Organoidlerin yerinden çıkmasını önlemek için büyüme ortamlarını yavaşça ekleyin.Daha sonra birincil kültürleri nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ayrıca süzüntü havuzunun 0.1 mililitresini doğrudan fibroblast ortamı ile doku kültürü plastiğine tohumlayın. Birincil kültürleri nemlendirilmiş CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.24 ila 48 saat sonra, organoidlerden hücre göçünü kontrol edin ve iki ila üç gün sonra mitotik büyüme kültürünü izleyin. Hücreler birleşmeye yakındır, ortamı her iki ila üç günde bir yeniler. Damar sisteminin küçük parçaları yapışabilir ve fibroblast hücre büyümesine neden olabilir.Önemli fibroblast büyümesi durumlarında. Fibroblastları büyük epitel yamalarından çıkarmak için diferansiyel trippin izasyonu gerçekleştirin. Hücreleri STE tamponunda bir kez yıkayın.Ardından, sürekli mikroskobik gözlem ve tabağın sert bir yüzeye yumuşak ama keskin darbeleri ile tabağı kaplamak için taze 0,5 mililitre STE ekleyin. Epitel hücreleri hala yapışık geçiş halindeyken fibroblast dekolmanı olup olmadığına bakın. Epitelyal büyüme yamaları birleşmeye yaklaştığında birincil kültürler.Birincil kültürü korumak ve birden fazla ikincil kültür oluşturmak için kısmi tripsin kullanın. Hücreleri STE tamponunda bir kez yıkayın, ardından sadece tabağı kaplamak için taze STE ekleyin. Hücrelerin yaklaşık% 50'sinin ayrıldığını izleyin.Daha sonra büyüme ortamı içeren iki mililitre serum ekleyin ve hücreleri hasat edin. Daha sonra hücreleri iki yıkamadan sonra steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hasat edilen hücreleri ve kültürü bir araya getirin: Kısmi izasyon, birincil yemeklerden iyi hücre büyümesi ve alt kültürden veya donmuş ikincillerden eşdeğer uzun süreli büyüme ile yaklaşık dört ila sekiz kez tekrarlanabilir.Hücrelerin saklanması için ilk kısmi tripsin izasyonundan dondurulmasını ve alt kültür için ikinci PT'den hücrelerin kullanılmasını öneririz. Doku uygun şekilde sindirildiğinde ve filtrelendiğinde, organoidleri görüntüleyen, duktal ve alveolar yapılar, yapışık stromadan arınmış pürüzsüz kenarlarla görülebilir. Az sindirilirse, materyal bağlanacak ve daha fazla fibroblast kontaminasyonu olacaktır, eğer aşırı sindirilirse, kenarlar pürüzlü olacak ve organoid bağlandıktan sonra bağlantı daha az verimli olacaktır.Epitel büyümesi 48 ila 72 saat içinde 48 saatte başlar. 72 saate kadar gözle görülür mitoz ile henüz aktif hücre bölünmesi yoktur. Mitoz daha görünür hale gelmelidir.Küçük damar sistemi parçaları, dört gün sonra mezenkimal hücre büyümesinin bir kaynağı olabilir. Epitelyal büyümeler morfolojik olarak heterojen popülasyonlar gösterir, burada keratin 14 ve keratin 19'a karşı antikorlarla boyanır, yeşil K 19 pozitif luminal ve kırmızı K 14 pozitif miyoepitel soylarını ve ayrıca sarı K 14 pozitif K 19 pozitif progenitör hücreleri işaretler. HMEC, farklı ortam formülasyonlarında kültürlenebilir.Kolera toksini ve oksitosin ile takviye edilmiş M 87 a gibi düşük stresli ortamlar, normal pre staz HMEC'in üstün uzun vadeli büyümesinin yanı sıra çoklu HMEC soylarının büyümesini destekleyecektir. Olgu analizi sonuçları, kültürlenmemiş organoidlerdeki soy çeşitliliğini ve dördüncü pasajda, M 87, A ortamında kültürlenen HMEC'yi göstermektedir. Burada, luminal ve miyoepitelyal popülasyonlar, luminal belirteçlerin, EPCA ve CD 2 27'nin ve miyoepitelyal belirteçlerin CD 49 F ve CD 10'un yeniden kaplanması ile tanımlanır.Dördüncü pasaj, HMEC. Önceki luminal ve miyoepitelyal belirteçler için zenginleştirilmiş gerçekler, keratin K 14 ve K 19 HMEC için immünofloresan analizleri kullanılarak soylarını doğrulamıştır. Dördüncü pasaja kadar plastik üzerinde kültürlenmiş, uygun CD 2 27 içine yerleştirildiğinde luminal ve miyoepitelyal hücrelerin in vivo benzeri soy ilişkileri ile organize yapılar oluşturma yeteneğine sahiptir ve CD 10 bu iki soy için zenginleştirmek için kullanılır.HMC'ler, miyoepitelyal hücrelerin içindeki luminal hücrelere sahip mikro desenli 3B mikro kuyularda uygun 3B hücre organizasyonu oluşturma yeteneklerini korurlar. Gerçekler: Zenginleştirilmiş progenitör hücreler, matrigel ile kaplandığında duktular ve alveolar yapıları taklit eden sağlam 3D yapılar da oluşturabilir. Matrigel'deki 3B yapılar aynı zamanda uygun 3B kendi kendine organizasyon sergiler.Bu videoyu izledikten sonra, meme bezinin epitel kısımlarını ilişkili meme stromasından nasıl arındıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki ila üç gün boyunca yapılabilir. Doku işleme tekniği genellikle basittir.Sindirimi doğru noktada durdurmayı unutmamak önemlidir.

processing-human-reduction-mammoplasty-mastectomy-tissues-for-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu raporda, izole etmek için bir sistem ve fare meme bezi kültür donör hücreleri göstermek ve bu hücrelerin orthotopically nakli stromal analiz etmek için alıcı farelerde meme tümör gelişimi sırasında epitelyal etkileşimler.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Biz insan meme hormon eylem incelemek için yeni bir ex vivo modeli geliştirdik. Bu doku mimarisi, hücreler arası etkileşimleri ve parakrin sinyal korumak cerrahi göğüs doku numunesinin izole doku mikro dayanmaktadır.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir.  Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu protokol, raf malzemeleri ile birincil insan meme dokusu kullanılarak meme kanserini incelemek için bir in vitro mikrofizyolojik sistemin inşasını açıklar.

Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi

Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

Öğrenin, meme bezinden epitel hücrelerini izole etmek için cerrahi atık materyalden organoid üretme yöntemini. Bu teknik, insan epitel hücre biyolojisi ve karsinojenizma araştırmalarını ilerletir.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Daha fazla video keşfet