Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Aşağıdaki deneyin amacı, doğal yaşam alanları olan büyüyen aksonlar boyunca schwan hücresi gelişimini analiz etmektir. Bu, ikinci bir adım olarak ilk ex explan superior servikal gangliyonlar veya fare embriyolarının kollajen matrisleri üzerine S cgs ile elde edilir. S cgs, SCG nöronlarından koronal bir şekilde aksonal büyümeyi kolaylaştıran sinir büyüme faktörü veya NGF ile tedavi edilir.

X explan'dan aksonal büyümeye ek olarak, endojen schwan hücrelerinin genişletilmiş aksonlar boyunca perifere doğru göç ettiği gözlemlenebilir. Schwan hücre gelişimi, hızlandırılmış görüntüleme ve ayrıca mesafe ölçümlerini mümkün kılan sabit dokunun uç nokta analizi ile analiz edilebilir. Bu tekniğin, çizik göçü tahlili gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kuğu hücrelerinin doğal yaşam alanlarının bu tahlillere dahil edilmesidir.

Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Kollajen metriklerinin doğru montajı ve sgs'nin doğru diseksiyonu başarının anahtarıdır. Bu adımları öğrenmek özellikle zor değildir.

Sadece önce pratik yapmaları gerekiyor. Bir doku kültürü davlumbazında çalışırken, buz üzerindeki tüm solüsyonlarla koşullarımızı anladık. Stok kültürü ortamını ve sıçan kuyruğu kollajenini yazılı protokoldeki talimatlara göre hazırlayın.

800 mikrolitre sıçan kuyruğu kollajenini 210 mikrolitre stok ortamı ile karıştırın. Kabarcıklar oluşturmadan, çözelti kırmızı renkte kalmalıdır. Çözelti sararırsa, Ratal kollajen çözeltisi çok asidiktir ve daha büyük bir konsantrasyonda sodyum hidroksit pipeti ile yeniden yapılması gerekir 100 mikro çözeltinin çok kuyulu bir slaydın her bir oyuğuna salınması ve her bir kuyucuğun tabanının tamamen kaplandığından emin olun.

Bulaşıkları iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hasattan sonra, E 16 ila E 18 embriyolarımız PBS içeren bir Petri kabına yerleştirilir, daha sonra amnyondan diseke edilir ve C klaviküler seviyesinde bir kordiyal dekapite edilir. Baş ve boyun bölgeleri daha sonra silikon bir alt tabağa aktarılır ve diseksiyon mikroskobu ile bakarken, submandibular ve klavikulüler bölgelerdeki dokuyu iğnelemek için böcek iğneleri kullanılır.

Şimdi submandibular bölgenin cildini ve deri altı dokusunu çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra supra hyoid, infra hial ve sternokleidomastoid kasları ortaya çıkarmak için submandibular tükürük bezlerini çıkarın. Daha sonra, gırtlak ve trakeayı ortaya çıkarmak için infra hial ve sternokleidomastoid kasları dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.

Trakeayı forseps ile kavrayın ve trakea ve gırtlağı kaldırın. Gırtlak ve trakea çıkarıldıktan sonra, karotis arterler görülebilir, prevertebral kasların her iki tarafıdır. Superior servikal gangliyonlar, karotis arterlerin çatallanmasında bulunur ve oval bir şekil olarak tanımlanabilir.

Üst servikal gangliyonları çıkarmak için forseps ve böcek iğnesi ile monte edilmiş bir iğne tutucu kullanın ve PBS içeren taze bir tabağa yerleştirin, ardından gangliyonlardan herhangi bir kan damarını veya bağlı dokuyu inceleyin. Şırınga iğneleri yardımıyla, jelatinleştirilmiş kollajen jelleri inkübatörden çıkarın ve gangliyonları jellere aktarmak için şırıngalara monte edilmiş şırınga iğnelerini kullanın. Eksplantları,% 5 karbondioksit ve nemli koşullarda% 5 santigrat dereceye ayarlanmış doku kültürü inkübatörüne bir ila iki saat boyunca yerleştirin.

Bir ila iki saatlik inkübasyondan sonra, superior servikal ganglion eksplantları doku kültürü inkübatöründen alınır ve her x explan'a B 27 takviyesi glutamin ve antibiyotik içeren 100 mikrolitre nöro bazal ortam eklenir. Daha sonra, mililitre başına 60 nanogram içeren 200 mikrolitre nöro bazal ortam. Aksonal büyümeyi kolaylaştırmak için kuyucuklara NGF de eklenir.

Halihazırda göç etmeye başlamış olan kuğu hücreleri üzerindeki etkiyi incelemek için in vitro sıfır gün olarak tanımlanan bu zamanda test maddeleri de eklenebilir. Akson maddeleri, mevcut ortamın 180 mikrolitresinin çıkarılması ve ilgilenilen maddenin ve NGF'nin son konsantrasyonun iki katı şekilde 200 mikrolitre ortamla değiştirilmesiyle in vitro olarak üç günde uygulanabilir, hızlandırılmış görüntüleme, farklı test maddelerini karşılaştırmak için paralel hücre kültürü inkübasyonunu ve hızlandırılmış görüntülemeyi mümkün kılacak ters çevrilmiş bir mikroskop kurulumu kullanılarak gerçekleştirilir. Bir deneyde, deneyin bitiş noktasında çok konumlu bir ayar önerilir.

Kültür slaytları içindeki eksplantları üç ila dört saat boyunca %4 PFA ile sabitledikten ve PBS ile yıkadıktan sonra, SCG dokuyu bloke ederken X eksplantını doğrulamak için immünohistokimya yapın, iki saat boyunca% 10 normal eşek serumu% 2% tritton X 100% içeren PBS ile. Daha sonra gece boyunca bloke edici çözeltide birincil antikor inkübasyonu ile devam edin. Primer antikor inkübasyonundan sonraki ertesi gün, X explan içeren jelleri PBS ile yıkadıktan sonra 24 oyuklu bir plakaya aktarın, ışıktan korunurken floresan etiketli ikincil antikorlarla iki saat inkübe edin, ardından PBS ile yıkayın ve 10 dakika boyunca dappy solüsyonu ile inkübe edin.

Birkaç kez yıkadıktan sonra, X explan içeren kollajen jelleri bir mikroskoba yerleştirin, kaydırın, slaytları kurutun ve ardından dana eti ile monte edin. Daha sonra kantitatif analiz için görüntüler elde etmek için standart bir floresan mikroskobu kullanın. Mikroskop yazılımının meta verileri kaydedebilmesi yararlıdır.

Elde edilen görüntülerin kantitatif analizleri, bilimsel uygulamalar için ücretsiz olarak kullanılabilen Fiji veya ImageJ yazılımı ile gerçekleştirilebilir. Bu filmde in vitro olarak dört gün boyunca şematik bir SCGX EXPLAN'dan elde edilen aksonal büyüme gösterilmektedir. İmmünohistokimya, eksplante edilen ganglionu net bir şekilde tanımlamak için in vitro dördüncü günde yapılabilir.

Sempatik bir ganglion olarak, schwan hücrelerinin akson boyunca göç ettiği, üst servikal gangliondan çevreye doğru hareket ettiği gözlemlenebilir. Bu video, daha yüksek bir büyütmede görülenle aynı geçiş modelini gösterir. Migrasyon mesafeleri, önde gelen schwan hücrelerinin çekirdeklerinden şematikte gösterildiği gibi birden fazla yerde ekilen SCG'nin sınırına olan mesafeyi ve dört günde DPI etiketli NGF ile muamele edilmiş bir numunenin görüntüsünü ölçerek, DPI'lı çekirdekler için karşı boyama numuneleri üzerinde kolayca ölçülebilir.

Parlak alan ve floresan kombinasyonu, S 100 GFP pozitif kuğu hücrelerinin ve aksonların görselleştirilmesini sağlar. Son olarak, bu film üstün bir servikal ganglionun sınırında schwan hücre göçünü ex exlan gösterir. Burada sadece floresan kanalı gösterilmiş olup, S 100 GFP pozitif schwan hücrelerinin daha kolay yorumlanmasını sağlar.

Bu prosedürü takiben, bir hücre proliferasyonunun nicelikçiliği veya bir hücre apoptozunun niceliğinin belirlenmesi gibi ek kantitatif analizler yapılabilir. Tabii ki, son nokta analizi için yeterli immünohistokimya yapılmalı veya canlı bağlamdaki etkileri göstermek için spesifik transgenik hayvanlar kullanılmalıdır.