İskelet Kası İzometrik ve Eksantrik Kuvvet Oluşturma Değerlendirme İzole Müsküler Distrofisi arasında murin Models

Bu prosedürün genel amacı, farelerden izole edilen iskelet kaslarının mekanik özelliklerini ölçmektir. Bu, önce ekstansör digitorum longus veya EDL kasının yanı sıra hayvandan diyafram kasının diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir diyafram şeridi hazırladıktan sonra, EDL'yi ve diyafram şeridini oksijenli zil çözeltisi dolu bir tabağa sabitleyin ve ardından kasların her iki ucuna dikiş halkaları bağlayın.

Daha sonra, EDL veya diyafram şeridi, bir ucunda bir kuvvet dönüştürücüsüne veya koluna bağlı iki elektrot arasındaki bir organ banyosuna sabitlenir ve seğirme kuvvetine bağlı olarak optimum uzunluğuna ayarlanır. Son adım, bir dizi mekanik protokol kullanarak kası uyarmak ve kuvvet üretimini ölçmektir. Sonuç olarak, kuvvet üretiminin, hasara karşı direncin, kuvvet frekans ilişkisinin ve diğer özelliklerin hesaplanması, kasın gücünü ve bütünlüğünü ve diğer özelliklerini ve varsa bir tedavinin veya genetik modifikasyonun etkilerini göstermek için kullanılır.

Bu teknik, kas distrofileri için potansiyel tedavileri test etmek için kullanılabilir, çünkü bu tedavilerin çoğu kas gücünü yeniden kazanmayı ve kas kırılganlığını azaltmayı amaçlar. Bu tekniği ilk kullanan biz olmasak da, bunu bir dizi farklı fare modelini incelemek ve kas fonksiyonlarını değerlendirmek ve ayrıca kas distrofileri için çoklu tedavileri karakterize etmek ve değerlendirmek için rutin olarak kullanıyoruz. Dr.Catherine Morewood'a ek olarak, bu prosedürü fizyolojik değerlendirme çekirdeğimizin iki üyesini, bir araştırma görevlisi olan Dr.Min Liu ve bir araştırma uzmanı olan Mr.Ian'ı kullanarak göstereceğiz.

Bu prosedürde kullanılan fareler, ağrı veya sıkıntı yaşamadıklarından emin olmak için ketamin ve ksilazin kullanılarak uyuşturulur, ancak kaslar dolaşım tarafından iyi oksijenlenir. Hayvanın yeterince uyuşturulduğunu bir ayak parmağı tutamıyla onayladıktan sonra, yüksek uzuvlarını tıbbi bant kullanarak hareketsiz hale getirin ve bu bölgenin kaslarını açığa çıkarmak için alt ön arka uzuvun derisini çıkarın, düzenli aralıklarla PBS uygulamasıyla kasları nemli tutun. Diseksiyon kapsamı altında, ekstansör digitorum longus veya EDL kasının proksimal tendonunu ortaya çıkarmak için diz lateralinde küçük bir kesi yapın.

Bu bölgede iki tendon vardır ve medial ayak bileğindeki EDL'nin çıkarılmasını sağlamak için her ikisi de kesilmelidir. Metatarsallar boyunca uzanan EDL'nin distal tendonlarını ortaya çıkarmak için tibiallerin ön veya TA kasının tendonunu kesin. TA kasını yoldan kaldırın.

Altındaki EDL'yi kesmemeye veya dokunmamaya dikkat edin. EDL'nin distal tendonlarına dönün ve her birini kesin. Ardından, tendonları kavrayın ve EDL'yi uzvun geri kalanından yavaşça çekin.

Proksimal uçtan serbestçe serbest bırakılmalıdır. EDL kasını çıkarın ve soğutulmuş oksijenli sıkıcılarla dolu bir diseksiyon kabına yerleştirin. Kası, in vivo olarak bulunan uzunluk olan yaklaşık dinlenme uzunluğunda tendonların arasından geçirin.

Kas tabakta pul pul döküldüğünde uzunluk çok kısadır ve kas diseksiyon pimlerini çekiyorsa çok uzundur. Dikişleri tendonlara mümkün olduğunca kaslara yakın tutun, ancak kasa dokunmayın. Dikişleri kullanarak kası yaklaşık dinlenme uzunluğunda sabitleyin.

Bu prosedüre başlamak için. Ötenazi yapılan hayvanın derisinde bir kesi yapın. Karın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için.

Karın boşluğunu açın ve kemik makası kullanarak ve diyafram girişinin üstünden başlayarak kaburgaların hemen altından vücut duvarını kesin. Kaburga çizgisini takip ederek tüm göğüs kafesini kesin ve omurgayı kesin. Diyaframın ortasından geçen kan damarlarını kesin, böylece diyafram kolayca çıkarılabilir.

Diyaframı fareden çıkarın ve oksijenli zillerle dolu bir diseksiyon kabına yerleştirin. Kanı yıkamak için diyaframı tabakta hafifçe çalkalayın. Zil sesi çözümünü gerektiği gibi yenileyin.

Daha sonra, lateral hemi diyaframların orta kısmındaki liflerin oryantasyonu boyunca merkezi tendondan kaburgalara kadar küçük bir diyafram şeridi kesin. Şerit iki ila dört milimetre genişliğinde olmalıdır. Dikişleri merkezi tendona bağlayın, yanal olarak çıkıntı yapan kaburga uçlarının her birine dikişler bağlayın ve ardından kemik makası kullanarak büyük bir halka oluşturmak için bunları birbirine bağlayın.

Şeridin her iki tarafındaki kaburgayı kesin, diyaframın her iki tarafında yaklaşık bir ila iki milimetre kaburga çıkıntısı bırakın. İzole edilmiş iskelet kaslarının şerit kuvveti oluşturma değerlendirmesi, kasları mekanik banyoya monte etmek, dikişleri kavramak ve bunları kasları bir uçta sert bir direğe ve diğer uçta bir kuvvet dönüştürücüsüne bağlamak için kullanmak için bir in vitro kas test sistemi tarafından gerçekleştirilir. İyi bir yaklaşım, dinlenme kasının uzunluğudur.

Daha önce gösterildiği gibi, banyo 22 santigrat derecede tutulan oksijenli zil çözeltisi ile doldurulur. Kasları test etmek için kas stabilitesini uzatmak için, fonksiyonel testten önce bu banyoda beş dakika dinlenmelisiniz, böylece supra maksimal stimülasyon koşulları oluşturmak için kas sıcaklığı 22 santigrat dereceye eşit olur. Banyoya bir kas yerleştirildikten sonra, bir seğirme oluşturmak ve kuvvet çıkışını izlemek için tek 0,5 milisaniyelik stimülasyon darbeleri kullanın.

Kuvvet maksimum ama sabit bir seviyeye ulaşana kadar akımı kademeli olarak artırın, kalan deneylerin optimum uzunluk oluşturması için akımı bu seviyeden %10 daha fazla artırın, önce kasın gevşek olmadığından emin olun, ancak öğretilmediğinden de emin olun. İyi bir yaklaşım, daha önce gösterildiği gibi dinlenme kası uzunluğudur. İzometrik seğirme stimülasyonlarını kullanarak, maksimum bir kuvvet elde edilene kadar kasın uzunluğunu kademeli olarak ayarlayın.

Her kasılma arasında kası yaklaşık 10 saniye dinlendirin. Optimal kas uzunluğu, seğirme kuvveti sürmeli kaliperler kullanılarak maksimum rekor kas uzunluğu olduğunda elde edilir. EDL için, miyo tendonöz bağlantılar arasındaki uzunluktur.

Diyafram için, merkezi tendon myo tendonöz bileşke ile kasın kaburgaya eklenmesi arasındaki uzunluktur. Maksimum izometrik Titanik kuvveti belirlemek için, süper maksimal stimülasyonda ve füzyon frekansında bir dizi 0.5 milisaniyelik darbelerle 500 milisaniyelik bir süre boyunca optimal kas uzunluğuna ayarlanan kası uyarın. EDL kasları için plato tipik olarak 120 hertz ile elde edilir ve 100 hertz'lik diyafram kasları için, beş dakikalık bir dinlenmeyi takiben her kas için stimülasyon nöbetleri arasında beş dakikalık dinlenme süreleri ile ilgili frekansta üç kez uyarılır.

İzometrik kasılmaları gerçekleştirdikten sonra, eksantrik kasılmalar için prosedüre başlayın. İlk 500 milisaniye boyunca izometrik olarak 80 hertz'de kası uyarın, ardından son 200 milisaniye stimülasyonunda% 10'luk optimal kas uzunluğu esnemesi yapın. Aralarında beş dakikalık dinlenmelerle stimülasyon modelini tekrarlayın.

İstenen eksantrik kasılma sayısı için, gerilmeden önceki zaman dilimindeki her kasılma için kuvveti ölçün. Fonksiyonel testin tamamlanmasında ilk ve son kasılma arasındaki kuvvet düşüşünü hesaplayın. Kas uzunluğunu kısaltın ve kası dönüştürücüden ve direkten nazikçe çıkarın.

Kası, zil sesleri olan bir diseksiyon kabına geri koyun. EDL kası için kaslardan dikişleri çıkarın. Kası iki kez bloke edin ve sonraki işlemlerden önce tartın.

Bu, diyafram kası için kesit alanını ve özgül kuvveti hesaplamak için önemli olacaktır.% 0.1 pros ve portakal, bir zar ve 15 ila 20 dakika boyunca kalıcı boya. Bu, bir diseksiyon hasarı indeksi sağlayacak, diyafram kasını kemik girişinden ve merkezi tendondan uzaklaştıracaktır. Bu, tartılmadan ve sonraki hazırlıktan önce kas lekesinin doğru bir ağırlığını sağlamak için gereklidir.

Kesit alanı veya CSA, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır, burada L üzeri LO lif / kas uzunluk oranıdır ve 1.06, vahşi tip C 57'deki izometrik kuvvetler için beklenen kas yoğunluğu değerleri ve kas distrofisi veya M-D-X-E-D-L 12 haftalık hayvanlardan alınan kaslar bu şekilde gösterilmektedir. MDX kasları kompansatuar hipertrofi sergilediğinden, titanik kuvvetin toplamı, yaşa uygun vahşi tip kontrollere kıyasla MDX kasında daha yüksek olabilir. İşlevsel çıktının daha uygun bir ölçüsü, kuvvetin kesit alanı için normalleştirildiği özgül kuvvettir.

Bu değeri hesaplamak için özgül kuvvet, kasın doğal fonksiyonel kapasitesine bağlıdır, burada distrofik kaslardaki zayıflık, hem mutlak kuvvet hem de kesit alanı hesaba katıldığında daha belirgindir. Bu çalışmada, MDX farelerinden elde edilen EDL kaslarının, 10 ila 26 haftalık yaş arasındaki yaşa uygun vahşi tip farelere göre yaklaşık% 20 ila 25 daha düşük spesifik kuvvet ürettiği gözlenmiştir. Diyafram için, karşılaştırmalar için sadece spesifik kuvvet önemlidir, çünkü hazırlık, diseksiyona bağlı olan kasın bir parçasıdır.

Mavi çizgi ile gösterilen C 57 vahşi tip kas ile kırmızı çubuklarla gösterilen MDX diyafram kası arasındaki özgül kuvvetin karşılaştırılması, bu dokudaki ilerleyici patolojiyi yansıtır. İzometrik kuvvet çıkışı yaşla birlikte azalır, böylece altı aylık olana kadar MDX farelerinden gelen diyafram kasları, yaşa uygun vahşi tip kontrollerden elde edilen diyafram şeritlerinin işlevsel çıktısının yarısından fazlasını üretmez. Diyafram testinden elde edilen eksantrik kasılmaların bir örneği bu şekilde gösterilmiştir.

Sonraki her eksantrik kasılma kuvveti ile, hem mavi ile gösterilen vahşi tip C 57 hem de kırmızı ile gösterilen MDX farelerden diyafram şeritlerinde çıkış azalır. Bununla birlikte, MDX faresinden alınan kas örneklerinde, muhtemelen distrofin ve bununla ilişkili proteinlerin yokluğundan kaynaklanan kuvvet kaybı daha dramatiktir. Bu teknik, bu tekniği takiben uygun şekilde yapılırsa, tek bir kas için yaklaşık bir saat içinde gerçekleştirilebilir.

Western blotlama veya diğer biyokimyasal ölçümler gibi diğer yöntemler, tedavinin protein seviyelerini değiştirip değiştirmediği veya kas bütünlüğünü normalleştirip değiştirmediği gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, EDL ve diyaframı fareden nasıl ayıracağınızı ve eksantrik kasılmalardan önce ve sonra kuvvet üretimini nasıl ölçeceğinizi ve analiz edeceğinizi iyi anlamalısınız.