Demir Kaynağı Olarak İnsan Hemoglobin kullanarak Staphylococcus aureus Büyüme

Bu deney, staphylococcus aureus'un insan hemoglobinini tek demir kaynağı olarak kullanma yeteneğini test eder. İlk olarak, kırmızı kan hücrelerini taze insan kanından izole edin. Hemoglobinin bütünlüğünü sağlamak için hemoglobini yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile saflaştırın.

Şimdi demiri hemoglobin Next kültürü şeklinde sağlamak için demir tükenmiş ortama hemoglobin ekleyin. S reus. Hemoglobin varlığında ve hemoglobini demir kaynağı olarak kullanma yeteneğini ölçün.

Sonuçlar, reusun tek bir demir kaynağı olarak hemoglobin varlığında çoğaldığını göstermektedir. Bu yöntem, bir patojenin demir kaynağı olarak konakçı proteinleri kullanıp kullanamayacağı ve bu işlemi kullanarak demiri kullanmak için hangi mekanizmaların gerekli olduğu gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu yöntem, hemoglobinden staph reus'un demir edinimi hakkında fikir verebilir.

Ayrıca diğer bakterilerin çalışmalarına ve konakçıdan demir içeren proteinleri nasıl kullandıklarına da uygulanabilir. Bu tekniği göstermek için laboratuvarımdan GLA Ani ve Catherine Haley olacak. İlk olarak, bir antikoagülan ile takviye edilmiş yeni izole edilmiş insan kanı elde edin ve saflaştırma boyunca dört santigrat derecede tutun Kırmızı kan hücrelerini 15.000 Gs'de 20 dakika santrifüjleme ile pelet yapın. HCL, RBC'leri ozmotik basınçla yalanlamak için.

Daha sonra% 20 nihai hacme toluen ekleyin ve gece boyunca bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Sonraki santrifüj. Bir saatte 20.000 Gs'de lizat.

Orta hemolizat fraksiyonunu toplayın, üst toluen tabakasını ve peleti rahatsız etmeden bırakın. Hemolizatı 0.44 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin. Çözelti partikül madde içeriyorsa ve filtreden geçirilemiyorsa, yüksek hızlı santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Şimdi hemoglobini yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi anyon değişim sütunu ile saflaştırın. 10 milimolar tris, HCL'lik bir mobil faz A ve 10 milimolar tris, HCL artı 0.5 molar sodyum klorür içeren bir mobil faz B kullanın. Dakikada iki mililitre akış hızında iki dakika boyunca %0 ila %100 arasında bir çözücü B gradyanı çalıştırın.

410 nanometre ve 280 nanometrede absorpsiyona dayalı olarak elüsyonu izleyin. Parlak kırmızı bir renk ve belirgin bir absorpsiyon zirvesi ile karakterize edilen fraksiyonu toplayın. Fosfat tamponlu saline karşı elüsyonu yaklaşık 16 saat diyaliz edin.

Numuneyi sterilize etmek için, hemoglobin konsantrasyonunu belirlemek için 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin. PBS'de HP standart çözümlerini hazırlayın. Şimdi standart çözeltileri veya numune çözeltilerini, 540 nanometrede 15 dakikalık bir inkübasyon ölçümü absorbansından sonra 96 oyuklu plakada bire bir oranında iki xra kins reaktifi ile karıştırın.

Standart bir eğri çizin ve numunelerin HP konsantrasyonunu mililitre başına beş ila 15 miligram olarak belirleyin. Verimler, iki adet %15'lik STS sayfa jeli üzerinde 15 ila 20 mikrogram saflaştırılmış hemoglobin örneğinin tipik olarak çalıştırılmasıdır. Jellerden birini boyayın ve proteinleri başka bir jelden hemoglobin dondurması için immünoblo lekeye bir nitroselüloz membran üzerine aktarın ve izole edilmiş hemoglobinin bir mililitrelik alikotunu triptik, soya agar üzerinde donmuş bir stok çizgisi S aureus'tan sıvı nitrojen içinde saklayın ve 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Tek kolonileri E-D-D-H-A içeren beş mililitre RPM'ye aşılayın ve gece boyunca 180 RP M'de çalkalayarak 37 santigrat derecede kültürleyin. Bakterileri 7.500 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleme ile peletleyin, ardından Resus, bakterileri 0.5 milimolar EDHDH A içeren RPMI'de askıya alın ve yaklaşık üç OD 600'e normalleştirin. Daha sonra, serbest demiri şelatlamak için mililitre başına 2.5 mikrogram, HB ve 0.1 ila bir milimolar E-D-D-H-A içeren N-R-P-M-I hazırlayın.

Şimdi, 10 mikrolitre bakteri süspansiyonunu bir mililitre N-R-P-M-I artı E-D-D-H-A artı HP'ye alt kültürleyin, kültürleri 37 santigrat derecede 48 saate kadar inkübe edin ve her altı ila 12 saatte bir 180 RRP M'de çalkalayın. 50 mikrolitre kültür karışımını 150 mikrolitre PBS ile 96 oyuklu plakada çıkarın ve OD 600 okumaları yapın. İnsan hemoglobininin hemolizattan bu HPLC saflaştırılmasında, 280 ve 410 nanometre dalga boylarında elüatın emilimi, hemoglobini içeren beşinci fraksiyon ile ölçülür.

Tipik olarak, preparat başına mililitre başına beş ila 15 miligram hemoglobin verimi elde edilir. Saflaştırılmış hemoglobin, SDS sayfası tarafından iki kopya halinde analiz edildi ve jeller ya proteinler için standın içine alındı ya da nitroselüloz üzerine aktarıldı ve immünoblotlandı. Daha sonra, saflaştırılmış insan hemoglobini, hemoglobin türevi demir alımı için gerekli olan hemoglobin reseptöründen yoksun olan vahşi tip asus ve ASUS'un büyümesini destekleme yeteneği açısından test edildi.

Kültürlerin zaman içinde optik yoğunluğundaki artış, N-R-P-M-I artı E-D-D-H-A artı hb'de vahşi tip ASUS'un çoğaldığını, ancak mutantın çoğalmadığını gösterir. Buna karşılık, takviye edilmiş serbest demir kullanma yeteneği hem vahşi tip hem de mutant suşlarda aynıdır, ikisi de bir kaynağın yokluğunda çoğalmaz. Taze kandan saflaştırılmış hemoglobin veya liyofilize hemoglobin ile takviye edilmiş ortamların bu karşılaştırmasında, kandan saflaştırılan hemoglobinin büyümesi için ISDB'ye ihtiyacı vardır.

Liyofilize hemoglobin, ISDB mutantının çoğalmasını sağlarken, bir kez ustalaştıktan sonra, uygun bir hemoglobin saflaştırması birkaç saat içinde tamamlanabilir. Unutmayın, bağışçılar kan yoluyla bulaşan patojenlerin potansiyel taşıyıcılarıdır, bu nedenle insan kanını biyolojik olarak tehlikeli bir malzeme olarak ele alın.