Name: Demir Kaynağı Olarak İnsan Hemoglobin kullanarak Staphylococcus aureus Büyüme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Keşfedin, Staphylococcus aureus'un insan hemoglobininden demir elde etme yeteneğini. Bu büyüme analizi, bakteriyel demir metabolizmasını ve patojen biyolojisini anlamak için kritik faktörleri ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü ABD Kamu Sağlığı Servisi hibe AI69233 ve AI073843 tarafından desteklenmiştir. EPS Bulaşıcı Hastalıklar Patogenez bir Burroughs Wellcome Üyesidir. KPH Hücresel ve Moleküler Mikrobiyoloji Eğitimi Hibe Programı 5 T32 A107611-10 tarafından finanse edildi.

1. Taze Kan gelen Hemoglobin saflaştırılması <ol><li> Bir antikoagülan ile desteklenmiş taze insan kanı edinin. Saflaştırma boyunca buz üzerinde veya 4 de kan ° C tutun. </li><li> 1,500 x g&#39;de 20 dakika boyunca kan santrifüjleyin. Kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler), tüpün altında olacaktır. Dikkatlice süpernatan aspire ve yavaşça buz gibi soğuk% 0.9 (ağırlık / hacim) NaCl solüsyonu içinde pelet tekrar süspansiyon. Santrifüj tekrarlayın ve 3 kez yıkayın. </li><li> Buz gibi soğuk 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 hacim içinde pellet yeniden süspanse edin. Bu ozmotik basınç nedeniyle eritrositlerde parçalanma neden olacaktır. ~% 20 son hacim toluen ekleyin. </li><li> Gecede bir et lokantası 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 saat boyunca 20.000 xg&#39;de lizat santrifüjleyin. Toluen (üstünde yüzen) ve pelet dokunulmazken ortasında hemolizat fraksiyonu toplayın. Orta kısmı toplamak için bir uzun saplı pipet kullanın. </li><li> 0.44 mikron şırınga filtresi Pass through. Çözelti partikül içeriyorsamadde ve adım 1.5 tekrarlayın, filtreden geçtikten edilemez. </li><li> Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile hemoglobin (Hb) Purify (HPLC) anyon değişim kolonuna (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 mikron, 150 mm × 4,6 mm). A, mobil faz mM Tris-HCl (pH 8.0) ve mobil faz B, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 0.5 M NaCl, 10. Çözücü B A% 0 -100% eğim 2.0 ml / dk akış oranında 2 dakika boyunca çalışır. (: 410 ve 280 nm λ) elüsyon emilimi esas izlenir. Parlak kırmızı renkli ve önemli bir emme zirve (Şekil 1) ile karakterize sadece fraksiyonu toplayın. </li><li> Karşı elüsyon Dialyze fosfat-tamponlu tekrar salin (PBS) bir karışımı, ve daha sonra birkaç saat karıştırıldı. 0.22 um bir şırınga filtresinden geçirerek sterilize edilir. </li><li> Hb konsantrasyonu ölçmek için, PBS içinde konsantrasyonu bilinen standart Hb çözümler hazırlamak. (Tr reaktifleri ile tabloya bakınız standart çözeltilerin karışımı ile örnek olarak Hb konsantrasyonunun tespit edilmesied) veya bir 1:1 oranında 2x Drabkin reaktifi (tozundan hazırlanan) ile numune çözeltisi. Örneğin, 96 oyuklu plakalar 100 ul 2x Drabkin reaktifi ile 100 ul Hb çözelti ilave edilir. 540 nm&#39;de 15 dk ve önlem absorbans inkübe. Bir standart eğrisi çizilir ve örnek olarak Hb konsantrasyonu belirlenir. Beş ila on beş mg / ml verimleri tipiktir. </li><li> Çoğaltmak% 15 SDS-PAGE üzerine hemoglobin saflaştırılmış 15-20 mikrogram çalıştırın. Jellerin bir Leke; hemoglobin için bir nitroselüloz zar ve immunoblot (Şekil 2) üzerine başka bir jel proteinleri aktarın. </li><li> Freeze ve sıvı azot içinde hemoglobin 1 ml alikotları saklayın. </li></ol> 2. Hazırlanması Demir deplete Büyüme Medya <ol><li> Üreticiler ve% 1 cassamino asit (CA) (w / v) tarafından tavsiye edildiği gibi sodyum bikarbonat eklemek, su içinde eritilerek toz RPMI Roswell Park Memorial Institute (RPMI) et suyu hazırlayın. 0.2 um bir filtreden ve mağaza refrig geçirilerek sterilizeçalıştırılamaz. </li><li> % 7 (ağırlık / hacim) Chelex-100 ekleme ve bir karıştırma plakası üzerinde gece boyunca karıştırma ile metal-azalmış RPMI (NRPMI) hazırlayın. 0.2 um bir filtreden ve buzdolabında depo üzerinden geçerek Chelex-100 çıkarın. 25 uM ZnCl 2, 25 uM MnCl 2, 100 mM CaCl2 ve 1 mM steril 1.000 x çözüm olarak önceden hazırlanmış MgCl2: esansiyel demir dışı metaller ile medya tamamlayın. Yeniden kullanılabilir malzemeler demir kontaminasyonu önlemek için bu adımı için tek kullanımlık plastik kaplar kullanın. </li></ol> Bir Sole Demir Kaynağı Olarak Hemoglobin kullanarak 3. Staphylococcus aureus Büyüme <ol><li> Streak S. Donmuş bir stoktan triptik soya agar (TSA) üzerinde yalıtım aureus. 20-24 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yeniden süspanse etilendiamin-N, 100 mM e kadar susuz etanol içinde N&#39;-bis (2-hidroksifenilasetik asit) (EDDHA). EDDHA çözüm içine gitmez ama etanol ile steril edilmiştir. </li><li> 0.5 mM nihai konsantrasyon RPMI için EDDHA ekleyin. Izin vermekEDDHA sonraki adıma geçmeden önce, en az 30 dakika eritin. Partiden partiye varyasyon nedeniyle, nihai konsantrasyon EDDHA bakteri oluşumuna izin vermek için 0.25 mM e indirilmesi gerekir. </li><li> S. tek koloniler inoküle RPMI 15 ml&#39;lik vida kapaklı konik bir tüp içinde EDDHA ihtiva eden 5 ml içine aureus. 16-20 saat boyunca dakika (rpm) başına 180 devir az sallama ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 7.500 x g&#39;de 5 dakika boyunca gecede kültürleri santrifüjleyin ve NRPMI 0.5 mM EDDHA içeren yılında pelet tekrar süspansiyon haline getirin. ~ 3 OD 600 Normalize. </li><li> NRPMI ml Hb başına 2.5 mikrogram ve 0.1-1.0 mM EDDHA içeren hazırlayın. Gruplar arası varyasyon nedeniyle, NRPMI serbest demir şelatların döküntülerini büyütmek için gerekli olan konsantrasyon EDDHA değişebilir. </li><li> 15 ml vidalı kapaklı konik tüp içinde 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb içine adım 3,5 bakteriyel süspansiyonun Altkültür 10 ul. </li><li> 180 rpm&#39;de veya haddeleme davul sallayarak ile 48 saat için 37 ° C&#39;de kültür inkübe edin. </li><li&gt; Her 6-12 saat 96-kuyucuğu içinde kültür 50 ul kaldırma ve PBS 150 ul ile karıştırılarak OD 600 okuma alabilir. </li></ol>

<ol><li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li>
<li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+for+blood%3A+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).</li>
<li>Haley, K. P., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+battle+for+iron%3A+host+sequestration+and+Staphylococcus+aureus+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection.+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition.</a> Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).</li>
<li>Krishna Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+hemoglobin+capture+by+Staphylococcus+aureus+cell-surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22IsdH.+The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein.</a> IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).</li>
<li>Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-coordinating+tyrosine+is+a+key+determinant+of+NEAT+domain+heme+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer.</a> Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).</li>
<li>Villareal, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li>
<li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li>
<li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li>
<li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li>
<li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li>
<li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+IsdB+is+a+hemoglobin+receptor+required+for+heme+iron+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization.</a> J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsdA+and+IsdB+antibodies+protect+mice+against+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+lethal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge.</a> Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).</li>
<li>Cheng, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Weinberg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Iron availability and infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).</li>
<li>Drabkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+Hemin+Chromoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the Hemin Chromoproteins.</a> Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).</li>
<li>Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+a+signal+receptor+scavenging+haptoglobin-hemoglobin+complexes+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).</li>
<li>Torres, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Fur+regulates+the+expression+of+virulence+factors+that+contribute+to+the+pathogenesis+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia.</a> Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).</li>
<li>Hammer, N. D., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Staphylococcus+aureus+Iron+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition.</a> Annu. Rev. Microbiol. , (2011).</li>
<li>Hurd, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron-regulated+surface+proteins+IsdA%2C+IsdB%2C+and+IsdH+are+not+required+for+heme+iron+utilization+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Fems.+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus.</a> Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).</li>
<li>Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+behavior+of+hemoglobin+alpha-+and+beta-+subunits+during+acid-induced+denaturation+observed+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry.</a> Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).</li>
<li>Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+chromatographic+method+for+the+preparation+of+human+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin.</a> Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).</li>
<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
<li>Manjula, B. N., Acharya, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+molecular+analysis+of+hemoglobin+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography.</a> Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).</li>
<li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+envelope+proteins+related+to+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li>
<li>Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulated+outer+membrane+proteins+of+Escherichia+coli%3A+variations+in+expression+due+to+the+chelator+used+to+restrict+the+availability+of+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron.</a> Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).</li>
<li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Demir yaşamın 15 tüm krallıklardan organizmalar tarafından gerekli olan temel bir besindir. Omurgalılar, demir bu öğe tarafından kaynaklanan zehirlenme önlemek için tecrit edilir. Bu haciz de beslenme bağışıklık 16 olarak bilinen bir süreçte mikroplar istila demir gizler. Buna karşılık, patojenler beslenme bağışıklık engelleyecek stratejiler geliştirmişlerdir. Böyle bir mekanizma hemoglobin dayanır, hangi ana 17 içindeki demirin en bol kaynağıdır. Hemoglobin kırmızı kan hücrelerinin için...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> HPLC anyon değişim kolonuna </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Drabkin reaktifi </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobin standart </td><td> Pointe Scientific </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100 sodyum formu </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC Standartları GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobin bir antikor </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Triptik Soy Agar </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

demir kaynağı olarak İnsan hemoglobin kullanarak staphylococcus aureus büyüme

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus hayati metabolik fonksiyonları ve hastalık yapan yürütmek için demir gerektiren bir patojen bakteridir. Insan konak içindeki demirin en bol rezervuar hemoglobin kofaktörüdür heme vardır. Hemoglobin demir elde etmek için, S. aureus demir-regüle yüzey belirleyicisi (Isd) sistemi 1 olarak bilinen karmaşık bir sistem kullanır. Isd sistem ilk bind konak hemoglobin Bileşenleri, daha sonra ayıklamak ve heme ithalat ve nihayet bakteriyel sitoplazma 2,3 heme demir kurtarmak. Bu yol vitro çalışmalar 4-9 sayısız aracılığıyla diseke edilmiştir. Ayrıca, enfeksiyon için Isd sistemin katkısı art arda 8,10-14 fare modellerinde ortaya konmuştur. Hemoglobin kaynaklı demir edinimi Isd sistemin katkısı kurulması ve büyüme daha zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Bir tek demir kaynağı olarak hemoglobin kullanarak Büyüme deneyleri b karmaşıktıry büyüme ortamında serbest demir kirletici ticari olarak temin hemoglobin kararsızlık, ve demir şelatlar ile ilişkili toksisite. İşte biz bu sınırlamalarının üstesinden bir yöntem sunuyoruz. Yüksek kaliteli hemoglobin taze kandan hazırlanmıştır ve sıvı azot içinde saklanır. Arıtılmış hemoglobin içine ilave edilir, orta omurgalı konukçu içerisindeki patojenlerin karşılaştığı demir-fakir ortamda taklit demir tüketmek. S. açlıktan tarafından serbest demir aureus ve biz, hemoglobin bağlamak heme ayıklamak, bakteri hücre zarfı ile heme geçmek ve sitoplazmada heme aşağılamak yeteneğini tamamen bağımlı bir şekilde büyümesine neden hemoglobin minimal manipüle formu ile ilave. Bu tahlil S. hemoglobin-/heme-derived demir iktisap mekanizmaları aydınlatmak isteyen araştırmacılar için yararlı olacaktır aureus ve muhtemelen diğer bakteriyel patojenler.

Biz HPLC (Protokol adım 1.7) ile hemolizat insan hemoglobin Temizlendikleri. Şekil 1 gösterir 280 ve 410 nm dalga boylarında eluat absorbans kaydedildi. Fraksiyon 5 toplandı ve diğer fraksiyonlar atıldı. Eluat mililitrede hemoglobin beş ile on beş miligram Verimleri genellikle elde edilir. Saflaştırılmış hemoglobin kopya halinde SDS-PAGE ile analiz edildi ve jeller ya da proteinler için boyandı ya da nitroselüloz üzerine transfer edildi ve (Protokol adım 1.10, Şekil 2) immunoblotted. </...

Burada bir büyüme tahlil tarif<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mevcut besin demir tek kaynak olarak hemoglobin kullanarak. Bu testte elde edilen hemoglobin demir elde etme ile ilgili bakteri faktörlerin rolü kurar.

Demir Kaynağı Olarak İnsan Hemoglobin kullanarak Staphylococcus aureus Büyüme

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Bu deney, staphylococcus aureus'un insan hemoglobinini tek demir kaynağı olarak kullanma yeteneğini test eder. İlk olarak, kırmızı kan hücrelerini taze insan kanından izole edin. Hemoglobinin bütünlüğünü sağlamak için hemoglobini yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile saflaştırın.Şimdi demiri hemoglobin Next kültürü şeklinde sağlamak için demir tükenmiş ortama hemoglobin ekleyin. S reus. Hemoglobin varlığında ve hemoglobini demir kaynağı olarak kullanma yeteneğini ölçün.Sonuçlar, reusun tek bir demir kaynağı olarak hemoglobin varlığında çoğaldığını göstermektedir. Bu yöntem, bir patojenin demir kaynağı olarak konakçı proteinleri kullanıp kullanamayacağı ve bu işlemi kullanarak demiri kullanmak için hangi mekanizmaların gerekli olduğu gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu yöntem, hemoglobinden staph reus'un demir edinimi hakkında fikir verebilir.Ayrıca diğer bakterilerin çalışmalarına ve konakçıdan demir içeren proteinleri nasıl kullandıklarına da uygulanabilir. Bu tekniği göstermek için laboratuvarımdan GLA Ani ve Catherine Haley olacak. İlk olarak, bir antikoagülan ile takviye edilmiş yeni izole edilmiş insan kanı elde edin ve saflaştırma boyunca dört santigrat derecede tutun Kırmızı kan hücrelerini 15.000 Gs'de 20 dakika santrifüjleme ile pelet yapın. HCL, RBC'leri ozmotik basınçla yalanlamak için.Daha sonra% 20 nihai hacme toluen ekleyin ve gece boyunca bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Sonraki santrifüj. Bir saatte 20.000 Gs'de lizat.Orta hemolizat fraksiyonunu toplayın, üst toluen tabakasını ve peleti rahatsız etmeden bırakın. Hemolizatı 0.44 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin. Çözelti partikül madde içeriyorsa ve filtreden geçirilemiyorsa, yüksek hızlı santrifüjlemeyi tekrarlayın.Şimdi hemoglobini yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi anyon değişim sütunu ile saflaştırın. 10 milimolar tris, HCL'lik bir mobil faz A ve 10 milimolar tris, HCL artı 0.5 molar sodyum klorür içeren bir mobil faz B kullanın. Dakikada iki mililitre akış hızında iki dakika boyunca %0 ila %100 arasında bir çözücü B gradyanı çalıştırın.410 nanometre ve 280 nanometrede absorpsiyona dayalı olarak elüsyonu izleyin. Parlak kırmızı bir renk ve belirgin bir absorpsiyon zirvesi ile karakterize edilen fraksiyonu toplayın. Fosfat tamponlu saline karşı elüsyonu yaklaşık 16 saat diyaliz edin.Numuneyi sterilize etmek için, hemoglobin konsantrasyonunu belirlemek için 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin. PBS'de HP standart çözümlerini hazırlayın. Şimdi standart çözeltileri veya numune çözeltilerini, 540 nanometrede 15 dakikalık bir inkübasyon ölçümü absorbansından sonra 96 oyuklu plakada bire bir oranında iki xra kins reaktifi ile karıştırın.Standart bir eğri çizin ve numunelerin HP konsantrasyonunu mililitre başına beş ila 15 miligram olarak belirleyin. Verimler, iki adet %15'lik STS sayfa jeli üzerinde 15 ila 20 mikrogram saflaştırılmış hemoglobin örneğinin tipik olarak çalıştırılmasıdır. Jellerden birini boyayın ve proteinleri başka bir jelden hemoglobin dondurması için immünoblo lekeye bir nitroselüloz membran üzerine aktarın ve izole edilmiş hemoglobinin bir mililitrelik alikotunu triptik, soya agar üzerinde donmuş bir stok çizgisi S aureus'tan sıvı nitrojen içinde saklayın ve 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Tek kolonileri E-D-D-H-A içeren beş mililitre RPM'ye aşılayın ve gece boyunca 180 RP M'de çalkalayarak 37 santigrat derecede kültürleyin. Bakterileri 7.500 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleme ile peletleyin, ardından Resus, bakterileri 0.5 milimolar EDHDH A içeren RPMI'de askıya alın ve yaklaşık üç OD 600'e normalleştirin. Daha sonra, serbest demiri şelatlamak için mililitre başına 2.5 mikrogram, HB ve 0.1 ila bir milimolar E-D-D-H-A içeren N-R-P-M-I hazırlayın.Şimdi, 10 mikrolitre bakteri süspansiyonunu bir mililitre N-R-P-M-I artı E-D-D-H-A artı HP'ye alt kültürleyin, kültürleri 37 santigrat derecede 48 saate kadar inkübe edin ve her altı ila 12 saatte bir 180 RRP M'de çalkalayın. 50 mikrolitre kültür karışımını 150 mikrolitre PBS ile 96 oyuklu plakada çıkarın ve OD 600 okumaları yapın. İnsan hemoglobininin hemolizattan bu HPLC saflaştırılmasında, 280 ve 410 nanometre dalga boylarında elüatın emilimi, hemoglobini içeren beşinci fraksiyon ile ölçülür.Tipik olarak, preparat başına mililitre başına beş ila 15 miligram hemoglobin verimi elde edilir. Saflaştırılmış hemoglobin, SDS sayfası tarafından iki kopya halinde analiz edildi ve jeller ya proteinler için standın içine alındı ya da nitroselüloz üzerine aktarıldı ve immünoblotlandı. Daha sonra, saflaştırılmış insan hemoglobini, hemoglobin türevi demir alımı için gerekli olan hemoglobin reseptöründen yoksun olan vahşi tip asus ve ASUS'un büyümesini destekleme yeteneği açısından test edildi.Kültürlerin zaman içinde optik yoğunluğundaki artış, N-R-P-M-I artı E-D-D-H-A artı hb'de vahşi tip ASUS'un çoğaldığını, ancak mutantın çoğalmadığını gösterir. Buna karşılık, takviye edilmiş serbest demir kullanma yeteneği hem vahşi tip hem de mutant suşlarda aynıdır, ikisi de bir kaynağın yokluğunda çoğalmaz. Taze kandan saflaştırılmış hemoglobin veya liyofilize hemoglobin ile takviye edilmiş ortamların bu karşılaştırmasında, kandan saflaştırılan hemoglobinin büyümesi için ISDB'ye ihtiyacı vardır.Liyofilize hemoglobin, ISDB mutantının çoğalmasını sağlarken, bir kez ustalaştıktan sonra, uygun bir hemoglobin saflaştırması birkaç saat içinde tamamlanabilir. Unutmayın, bağışçılar kan yoluyla bulaşan patojenlerin potansiyel taşıyıcılarıdır, bu nedenle insan kanını biyolojik olarak tehlikeli bir malzeme olarak ele alın.

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Odaklanan bir bakteriyel patojen tarafından işgalinin ana hücrelerinin çalışma için genel bir...

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Kaynak: Gupta, S., ve diğerleri. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, demir stresini indüklemek ve bakterilerin hayatta kalmasını destekleyen sideroforların salgılanmasını teşvik etmek için Mycobacterium tuberculosis'in demir sınırlı koşullar altında kültürlenmesi prosedürünü göstermektedir.

Mycobacterium tuberculosis'in Demir Sınırlı Koşullar Altında Kültürlenmesi

Kaynak: Maurakis, S., ve diğerleri. Metale Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Konakçı Ligandlardan Metal Edinimi için Neisseria gonorrhoeae'nin Metal Sınırlı Büyümesi. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, metale duyarlı genlerin rolünü incelemek için metal sınırlı bir bakteri büyüme testini göstermektedir. Metalden yoksun ortamda yetiştirilen vahşi tip ve mutant bakteriler, metal ligandı ile inkübe edilir ve büyümeleri bir plaka okuyucu kullanılarak izlenir. Metalin tükendiği koşullar altında, vahşi...

Metale Duyarlı Genlerin Rolünü İncelemek için Metal Sınırlı Bakteri Büyüme Testi

Kaynak: Behera, R.K. ve diğerleri, Enfekte Dokularda Bakteriyel Gen Düzenlemesini İnceleme Için Floresans Tabanlı Bir Yöntem. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, bakteri büyümesini standartlaştırmak ve konak-patojen etkileşim çalışmaları için metabolik senkronizasyonu sağlamak amacıyla hemolitik Staphylococcus aureus kültürlerinin hazırlanmasını göstermektedir.

Konak-Patojen Etkileşim Çalışmaları için Hemolitik Staphylococcus aureus Kültürü Hazırlanıyor

Bu videoda, akış sitometrisi kullanarak fagositozu takiben insan nötrofillerine karşı virülan ve daha az virülan Staphylococcus aureus suşlarının sitotoksisitesini tespit etmek için bir test gösteriyoruz.

Fagositozu Takiben Nötrofiller Üzerinde Staphylococcus aureus Suşlarının Sitotoksisite Testi

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Burada metal alımı için genlerin ekspresyonunu kolaylaştırmak için metal sınırlı sıvı ortamda Neisseria gonorrhoeae büyüme için bir yöntem açıklar. Ayrıca bu koşullarda yetiştirilen gonokokların fenotipini karakterize etmek için aşağı akım deneylerini ana hatlar. Bu yöntemler, diğer bakterilerde metal duyarlı genlerin karakterizasyonu için uygun olarak uyarlanabilir.

Neisseria gonorrhoeae'nin Metal-Sınırlı Büyümesi, Ev Sahibi Ligandlardan Metal Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Metal Edinimi için

Bu protokol, Staphylococcus aureus içselleştirmesinin kapsamının ve insan konak hücre içinde hayatta kalma yeteneğinin yanı sıra antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğinin nasıl incelenerek incelenebilmesini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Antimikrobiyal Bileşiklerin Staphylococcus aureus Internalization ve Hücre İçi Etkinliğini İncelemek için Geliştirilmiş Enzim Koruma Tahlilleri

Bu yazıda, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus için antibiyotik sağkalımını değerlendirmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz, plazmitleri P. aeruginosa ve S. aureus'a dönüştürerek raportör suşlar oluşturmak ve persistanlar gibi fenotipik varyantları hızlandırılmış epifloresan mikroskobu ile görselleştirmek için.

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Keşfedin, Staphylococcus aureus'un insan hemoglobininden demir elde etme yeteneğini. Bu büyüme analizi, bakteriyel demir metabolizmasını ve patojen biyolojisini anlamak için kritik faktörleri ortaya koyar.

Demir Kaynağı Olarak İnsan Hemoglobin kullanarak Staphylococcus aureus Büyüme

Daha fazla video keşfet