Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Bu deneysel sistem, protein katlanma kalite kontrolünün uzay-zamansal dinamiklerini izlemek ve analiz etmek için canlı hücrelerde yüksek çözünürlüklü 3D floresan görüntüleri elde eder. İlk olarak, hücreleri hızla hareket eden protein komplekslerini incelemek için hazırlayın. Yüksek Z çözünürlükte bir Z yığını görüntü elde edin.

Ardından, daha sonra Zacks'ten oluşan bir zaman serisi elde edin, elde edilen görüntüleri bir 3D filmde oluşturun ve ortaya çıkan görüntüleri analiz edin. Sonuç olarak, dört boyutlu görüntüleme, farklı koşullarda hücrelerdeki dinamik ve geçici olayların izlenmesini sağlar. Dört boyutlu görüntülemenin geniş alan mikroskobu ve hızlandırılmış çekim gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücredeki tüm protein popülasyonunun dinamiklerini ve mekansal zamansal dağılımını aynı anda yüksek çözünürlükte görselleştirmemize izin vermesidir.

Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki protein agregasyonu, kalite kontrolü ve protein katlanması ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar son derece dinamik ve geçici süreçlerdir. Bu nedenle, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük olmadan, birçoğunu gözlemlemek imkansız olurdu.

Bu yöntem, toplama kalite kontrolü hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca protein etkileşimi ve dinamiği çalışmalarında devrim yaratabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü endojen olarak etiketlenmiş veya düşük eksprese eden proteinlerin 3D filmlerini çekmek sistemin stabilitesini gerektirir.

Yüksek hassasiyet ve düşük foto ağartma Maya suşlarını, UBC dokuzunun sıcaklığa duyarlı mutantı gibi, bir sitozolik katlama sensör proteinine bağlı bir Fluor füzyon proteini için bir ekspresyon plazmidi ile dönüştürün. Mayayı 24 saat boyunca% 2 rafinoz içeren sentetik ortamda büyütün, daha sonra gece boyunca% 2 Galaktoz içeren ortama% 2 oranında seyreltin, sorgu suşunu yaklaşık 0.2'lik bir OD 600'e seyreltin ve kültür, görüntülemeden 30 dakika önce 0.8 ile 1.0 arasında bir OD 600'e ulaşana kadar dört ila altı saat boyunca kültürleyin. Ekspresyonu% 2 glikoz ile desteklenmiş sentetik ortam ile bastırın.

Bu adım, eksprese proteinin yalnızca önceden çevrilmiş ve katlanmış havuzunun izlenmesine izin verir. Şimdi hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca ısıtın. Yanlış katlamayı önlemek için, dört D.Imaging alımı sırasında odağı korumak için uygun bir plaka seçin.

Plakanın altını 10 dakika boyunca mililitre con A başına 0.25 miligram ile örtün. Con A, hücreleri slayta yapıştırmak için kullanılır, bu da zaman içinde tek bir hücrenin takip edilmesini sağlar. Con A ve oku aspire edin, plakayı kimyasal bir kaputta kurutun.

Ardından 200 mikrolitre maya örneği ekleyin. Hücrelerin plakaya yapışmasını sağlamak için 15 dakika inkübe edin. Maya görüntülemesi için tek bir hücre tabakası elde etmek için ortamla üç yıkama gerçekleştirin.

Ekteki metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi birkaç standart olmayan modifikasyon içeren bir konfokal mikroskop kullanın. Bu maya görüntüleme sistemi, dört adede kadar lazer ve filtrelerle donatılmış dört adede kadar foto çarpan tüpü kullanır. Görüntülemelerimizin çoğu EGFP için yeşil filtre seti ve m kiraz ve TD domates için kırmızı filtre seti ile yapılmaktadır.

Ayrıca konfokali bir pi nano pizo aşamalı mükemmel odak sistemi ile donatın ve hem galvan O hem de rezonans tarayıcılar, istenen sıcaklığa ulaşılana kadar mikroskop sistemini dengeler. Görüntüleme ortamının kırılma indisine karşı numunenin ortamına dayalı görüntülemeden önce, uygun objektif su, yağ veya havayı seçin. Düzeltme bileziğini plakanın kalınlığına göre ayarlayın.

Objektifi lens mendilleri ve etanol kullanarak temizleyin. Ayrıca numuneyi taşıyan slaytı da temizleyin. Plakayı sahne tutucuya güvenli bir şekilde yerleştirin ve her numune için doğru ayarların yapıldığından emin olmak için numune tutucunun stabilitesini doğrulayın.

Göz portu ile nokta yayma işlevini görselleştirmek için floresan boncuklar kullanırken düzeltme bileziğini ayarlayın. Mayanın yerini ve yönünü belirleyin. Ardından, gerekli epi floresan ışığını açın ve ilgili fenotipi gösteren hücrelere odaklanın.

Daha sonra brightfield kullanarak, hücre canlılığı değerlendirmeleri için şekil ve dokuya göre hücre sağlığını ve canlılığını değerlendirin. Çekirdeği, bir SV 40 ve LS sinyaline kaynaşmış bir TD domates florası Fluor ile görselleştirin. TFP, GFP'nin iki katı büyüklüğündedir.

Çekirdeğin difüzyon sınırının üzerinde olduğu için nükleer bir belirteç olarak çok iyi çalışır. TFP'yi GFP ile aynı anda yeşil bir 4 88 nanometre lazerle uyarın, ancak spektral çözünürlük için yeşil ve kırmızı emisyonları iki ayrı PMT'de toplayın. Gürültüyü ve doygunluğu en aza indirmek için, lazer gücünü ve iğne deliği çapını ekteki el yazmasında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın.

Farklı flora kuvveti uyumlu dalga boyu yayarsa, deneysel tasarıma göre hızlandırılmış görüntüler elde etmek için sanal filtrelerin seçimine devam eden spektral dedektör özelliğini kullanın, Yanlış Katlanmış Protein U BBC dokuz T, zaman ve mekan üzerinde toplama kalite kontrolünü takip etmek için bir model sistem sağlar. İzin verilen sıcaklıktaki sitozolde, UBC dokuz T katlanır ve ısıya bağlı yanlış katlanma üzerine çekirdek ve sitozol içinde yayılır. Başlangıçta proteazomal bozunma için işlenen hızla yayılan küçük sitozolik agregat punkta oluşturur.

Proteazom kısmen inhibe edildiğinde, bu punkta yaklaşık iki saat boyunca önemsiz ve iPod kapanımlarına dönüştürülür. Normal koşullar altında, GFP UBC dokuz T doğal olarak katlanır ve burada yeşil renkte görüldüğü gibi çekirdek sitozolünde yaygın olarak lokalizedir. Sıcaklık 37 santigrat dereceye kaydığında, füzyon proteini yanlış katlanır ve 23 santigrat derecede ısı şokundan geri kazanıldıktan sonra sitozolik punkta agregatları oluşturur.

Termal olarak denatüre edilmiş G-F-P-U-B-C dokuz T, azalmış floresan seviyesi ile gösterildiği gibi bozunur. Çekirdek N-L-S-T-F-P ile kırmızı olarak etiketlenir. Sıcaklığın 37 santigrat dereceye kayması proteazom inhibisyonu ile birleştiğinde, G-F-P-U-B-C dokuz T yanlış katlanır ve önemsiz ve iPod kapanımlarına işlenir.

Burada, ubikitin proteaz dörtlüsü, sıcaklık kayması ile birlikte ubikitinasyonun ubikitinasyon inhibisyonunu bloke etmek için aşırı eksprese edilmiştir, bu da G-F-P-U-B-C dokuz T'nin iPod Dahil Edilmesine işlenmesine neden olur. Dört dakikalık aralıklarla elde edilen bu hızlandırılmış görüntüler, hurda ve iPod oluşumunun dinamiklerini net bir şekilde tasvir ediyor. Bu teknik, UBC dokuz T'yi bir katlama sensörü olarak kullanarak zaman içinde hücresel proteostazı izlemek için kullanılabilir.

Dört boyutlu görüntüleme, memeli hücreleri ve C elegance gibi diğer model sistemlerde de yapılabilir. Dört boyutlu görüntüleme ayrıca, çözünebilir agrega stres odaklarının oluşumu ve dinamikleri ve agregaların çöp ve iPod bölmelerine iletilmesi gibi agregasyon kalite kontrolündeki diğer ince olaylar hakkında da bilgi sağlar.