Name: Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde protein katlanma kalite kontrolünün 4D mikroskopi ile dinamiklerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik, hücresel proteostaz ve protein birikimi hastalıklarının anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Maya Hazırlıklar <ol><li> Bir gal1-GFP-Y68L (UBC9 ts) kaseti taşıyan plazmid ile maya suşları Transform. </li><li> 16 saat veya O / N için 24 saat süreyle% 2 rafinoz içeren sentetik medya maya büyümek ve geri% 2 galaktoz içeren ortam seyreltilir 200 rpm&#39;de sallama sırasında 30 ° C &#39;de hücreler inkübe edin. </li><li> Ertesi sabah, OD 600 = 0.2 için sorgu zorlanma sulandırmak. Kültürü = 0.8-1.0 OD 600 ulaşıncaya kadar 30 ° C (200 rpm) 4-6 saat boyunca çalkalayınız. </li><li> Ifade (yani GFP-Ubc9 ts sadece zaten tercüme ve katlanmış havuzu izlemek için),% 2 glukoz (SD) öncesi görüntüleme için 30 dk ile takviye sentetik ortam değişikliği medya bastırmak için. </li><li> Tedavi - Isı şoku 37, 20 dakika için hücreler ° C misfolding indüklemek için, ya da sürekli olarak ısı-şok protein birleştirme koşulları izlemek için mikroskop kuluçka makinesi içinde. Not - RT, ön ısıtma fo üzerinde herhangi bir sıcaklıkta mikroskop kullanıyorsanızmikroskop ve hedeflerinin gövdesi (bkz. aşağıda) boyunca sıcaklık denge sağlaması için 2 saat yaklaşık r. </li></ol> 2. Tabak \ Slayt Hazırlıklar <ol><li> Uygun plaka seçin. Ana dikkate görüntüleme edinimi sırasında odak korumak için yeteneğidir. Aşağıdaki noktaları 2B zaman geçerse veya 3D görüntüleme için 4D görüntüleme için kritik ve değildir. <ol><li> Çoklu kuyular plaka farklı kuyunun altındaki (yani kuyu amaç göre farklı yüksekliklerde yer alacaktır) homojen olmayabilir. Bu zor olursa olsun otomatik odaklama tekniği kullanılmış olma, xy noktaları ve zaman noktaları arasında odak sağlamak için yapacaktır. </li><li> Slayt malzeme: cam vs plastik. Cam dipli slaytlar daha z-homojen kuyuları arasındaki, ancak daha pahalıdır. </li><li> Plakanın alt kalınlığı: biz genellikle lamel-alt plakalar indeksi 1.5 kullanabilirsiniz, ancak endeks 1 amaca bağlı olarak da kabul edilebilir. </li></ol></li><li> Cov10 dakika için ConA (0.25 mg / ml) ile plaka arasında er alt \ kayar. ConA zaman içinde bir tek hücre ardından sağlayan slayt, hücre yapışma kullanılır. </li><li> ConA çıkarın ve böylece aşırı ConA buharlaşıp gidecek bir kimyasal kaputu slayt inkübe. </li><li> Iyi ConAed içine maya örnek Plate 200 ul (OD 600 = 0.5). </li><li> Hücreler plaka yüzeyine tutunur sağlamak için olduğu gibi, 15 dakika için inkübe edin. </li><li> Orta ayıklayın ve hücrelerin bir tabaka elde etmek için yeni bir orta ile üç kez yıkayın. Not: Uzun bir zaman atlamalı planlanmış ise, tohum hücreleri seyrek böylece yeni tomurcuklar doldurmak ve ilgi bölgenin engel olmayacağından emin. </li></ol> 3. Mikroskop Hazırlıklar <ol><li> Biz birkaç standart olmayan değişiklikler ile Nikon A1Rsi konfokal mikroskop kullanmak. Kadar, maya ve görüntüleme için biz 4 lazerler (ve 640 nm, 40 mW KÜP lazer; 457-514 nm, 65 mW Argon iyon lazer;; 561 nm, 50 mW Safir lazer 405 nm, 50 mW CUBE lazer) kadar kullanabilirsiniz ile donatılmış 4 Proje Yönetim Ekiplerifiltreler. Bizim görüntüleme çoğu EGFP için yeşil filtre seti ve mCherry ve tdTomato için kırmızı bir filtre seti ile yapılır. GFP ve mCherry ile orada neredeyse hiç bleedthrough, bu nedenle sık sık Eşzamanlı tarama kullanın. Bununla birlikte, çizgi tarama da o zaman meydana gelir bleedthrough önlemek için de kullanılabilir. Bizim konfokal da 2-3 saniyede z yığınlarının (30-50 bölümleri) etkinleştirerek, z 3 msn adımları yapabilirsiniz PInano Piezo aşaması (MCL) ile donatılmıştır. Bir galvano tarayıcı ve bir rezonans tarayıcı - sistemleri de bir spektral dedektörü, Perfect Odak (lazer ofset), ve iki tarayıcılar vardır. </li><li> Uygun hedefi seçin. Ana konuları: <ol><li> Su / Yağ / Hava hedefi: ana dikkate numunenin orta vs görüntüleme ortamın kırılma indeksi olduğunu. <ol><li> Yağ hedefi avantajları: <ol><li> Yağ hedefleri yüksek sayısal diyafram (yağ sonları su daha hafif, ve bu nedenle daha fotonlar objektif geri dönmek) olabilir. Petrol hedefleri kadar olabilirNA 1.49, su için 1,27 karşılaştırılan. (Ancak, bu aslında çözünürlükte büyük bir fark değildir). </li><li> Yağ kırılma indisi camın kırılma indisi eşleşir, dolayısıyla herhangi bir foton amaç için, camdan, örnek gidiş kaybolur. (Not - Hedefiniz ve lamel için uygun bir refraktif indekse sahip bir immersiyon yağı seçti). </li><li> Buharlaşması olmadığından Petrol sorunsuz uzun zaman geçerse sağlar. </li></ol> Yağ Amaç dezavantajları: <ol><li> Hafif sulu bir ortamda (örneğin, bir hücre gibi) aracılığıyla seyahat etmek varsa yağ hedeflerinin yüksek NA tarafından etkinleştirilmiş yüksek çözünürlük hızla düşürür. </li><li> Görüntüler genellikle daha küresel sapmaları var ve bir 3D efekti &quot;uzattı&quot;. </li><li> Petrol, yapışkan dağınık ve hedefleri için bir tehlike olduğunu. </li></ol></li><li> Su objektif avantajları <ol><li> Hücrenin kendini sulu, bu nedenle z daha az çarpıklıklara, bir vardırnd çözünürlük sulu bir numune içine yüksek derin kalır. </li><li> Temiz ve kullanıcı dostu. Su hedefi dezavantajları: buharlaşır hızlı, hedefe devamlı su pompalamak için yapılan özel düzenlemeler olmadan uzun filmler için bu nedenle uygun değildir. </li></ol></li><li> Hava amacı avantajları: 1. Hiç bir malzeme çoklu nokta edinimi veya uzun bir film sırasında / buharlaşır kaybolur. 2. Temiz ve kullanıcı dostu. Dezavantajı: düşük çözünürlükte ve düşük sinyal hassasiyeti. </li></ol></li><li> Oda ve inkübatör sıcaklığı: değişen sıcaklık maddenin özelliklerini etkilemektedir ve narin sistemlerinde odak değiştirir. Sıcaklık edinimi için puan seçmeden önce ayarlanmalıdır. Edinimi sırasında sıcaklık değiştirme görüntüleme bozacak ve odak kaybına neden olacaktır. Biz mikroskop sistemi görüntülemesi önce istenilen sıcaklıkta 2 saat dengeye izin. </li><li> Düzeltme yaka: Birçok amaçları sağlayan bir düzeltme halkası ile birlikte gelirAmaç belirli bir kapak kayma kalınlığı için ayarlanır. Biz nokta dağılım fonksiyonu görselleştirmek için floresan boncuk kullanarak düzeltme yaka ayarlamanızı öneririz. Bu, her örnek için doğru ayarları sağlayacaktır. </li><li> Kararlı örnek tutucular: biz çoğu piyasada bulunan numune tutucuları mikroskop zayıf parçası olduğunu bulmak. Bunlar genellikle titrek ve düz değildir. Bu, yüksek çözünürlüklü, çoklu-nokta 4D görüntüleme için bir felaket olur. Biz düz olan kendi örnek tutucuları tasarım ve sahneye sıkıca kapanmış. Bunlar gerektiğinde aşağı cıvatalı olabilir. </li><li> Çok noktalı edinimi: Bizim görüntüleme sistemi temelde bir lazer tabanlı otomatik odaklama mekanizması Nikon &quot;Mükemmel odak&quot; sistemi ile donatılmıştır. Sistem bir çok sürüklenme etmez, özellikle, ancak, otofokus, 4D görüntüleme ile mutlaka gerekli değildir. </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Sistemi açın: lazerler, sahne, kontrolör, kamera ve computer yazılımı. </li><li> Sahnede tutucu plakayı, düzgün güvenli ve stabilize. </li><li> Maya konumu ve yönünü belirlemek için göz noktası kullanın. </li><li> Aydınlık kullanarak, şekil ve doku göre hücre sağlığı ve canlılığı değerlendirmek. </li><li> İlgili fluorofor (GFP örn. FITC filtresi) göre epifluorescent ışık açın ve araştırma tabidir fenotipi gösteren hücreleri üzerinde durulacak. Birden fazla dalga boyunda floresan yüksek olan hücreler ve bu yüzden ölü autofluorescent olabilir. Biz bir SV40 NLS sinyali (NLS-TFP) erimiş bir tdTomato florofor ile nükleus görselleştirmek. TFP iki defa GFP boyutu ve çekirdeğin difüzyon sınırın üzerinde bu nedenle, bu nedenle de bir nükleer işaretleyici olarak çok iyi çalışır. Biz de GFP gibi aynı anda bir yeşil (488 nm) lazer ile TFP heyecanlandırmak, ama spektral çözünürlüğü için iki ayrı Proje Yönetim Ekipleri içine yeşil ve kırmızı emisyon toplayabilir. </li><li> Gürültüyü en aza indirmek için aşağıdaki ayarları yapınve doygunluk: <ol><li> Lazer güç - photobleaching ve görüntünün fototoksisite vs parlaklığını düşünülmelidir. </li><li> Kazanç: kamera hassasiyetini etkiler, böylece Sinyal Gürültü Oranı. </li><li> İğne deliği çapı - kısa dalga boylu lazer göre ayarlanmalıdır. İğne deliği çapı optik bölümün kalınlığı (yüksekliği) görüntülenmiş belirler. Böylece, iğne deliği açarak daha fazla ışık (daha fotonlar izin) toplamak, ancak z (daha az confocality) çözünürlüğü düşecektir. </li></ol></li><li> Faydalı ipuçları: <ol><li> Farklı floroforlar uyuşan dalgaboyu yayarsak, sanal filtrelerin seçimi sağlayan Spectral Dedektör özelliğini kullanın. Spektral dedektörleri düzenli Proje Yönetim Ekipleri daha az duyarlı olduğunu unutmayın. </li><li> Farklı floroforlar aynı lazer tarafından heyecanlıyız, satır tarama özelliğini kullanın. </li><li> Bir Galvano tarayıcı daha fazla hassasiyet sağlar, ancak photobleaching için daha yüksek bir risk vardır. Bir Rezonans tarayıcı daha hızlı bir olanakcquisition, böylece photobleaching için riskini azaltarak, ama daha az duyarlıdır. </li><li> İmajlar 2 ile 16 arasında değişen, ortalama gürültü oranı sinyal artırır, ama tabii ki, edinim yavaş ve yapar, lazer için numune daha fazla maruz kalma içerir. </li><li> Süresi biyolojik soru (örn. JUNQ ve IPOD oluşumu ~ 2 saat sürer) edinim ile bağlıdır. Biz time-lapse 3D kadar 30 saat için rezonans tarayıcı ile maya imaged var. </li><li> Zaman atlamalı aralıklarla-küçük aralıklarla daha tutarlı bir film yaratacak ancak beyazlatma ve dolayısıyla sinyal kaybı fotoğrafı neden olabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+in+the+cell%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li>
<li>Aguzzi, A., Calella, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%3A+protein+aggregation+and+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Prions: protein aggregation and infectious diseases.</a> Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteotoxic+stress+and+inducible+chaperone+networks+in+neurodegenerative+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging.</a> Genes & development. 22, 1427-14 (2008).</li>
<li>Cohen, E., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+paradox%3A+aging%2C+proteotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. , (2008).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, (1998).</li>
<li>Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+for+controlling+protein+aggregation.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).</li>
<li>Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposits%3A+Protection+against+toxic+protein+species%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex.%29%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?</a> Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).</li>
<li>Spokoini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+to+Organelle-Associated+Inclusion+Structures+Mediates+Asymmetric+Inheritance+of+Aggregated+Protein+in+Budding+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast.</a> Cell Rep. , (2012).</li>
<li>Weisberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+superoxide+dismutase+1+%28SOD1G93A%29+aggregates+determines+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).</li>
<li>Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteins+partition+between+two+distinct+quality+control+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments.</a> Nature. 454, 1088(2008).</li>
<li>Betting, J., Seufert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+Ubc9+mutant+protein+with+temperature-sensitive+in+vivo+function+is+subject+to+conditional+proteolysis+by+a+ubiquitin-+and+proteasome-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 25790(1996).</li>
<li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263(1999).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biyokimyasal süreçler hakkında sezgilerimiz tepken ve ürünlerinin iyi karma çözüm bir behere dengeye ulaşmak için izin verilen masa üstü deneyler türetmek. Böyle bir ortamda, verilen bir kimyasal türlerin konsantrasyonunun bir makroskopik hacim moleküllerin bir molar miktar oranı olan bir tek sayı olarak ifade edilebilir. Hücrelerin bütün nüfusun homojenatlarında özler yürütülen batı blot, centrifugations ve spektrofotometrik ölçümler: Much biz protein yapısı ve işlevi hakkında bildiklerimizin klasik, toplu reaksiyon resmi yansıtacak yöntemler kullanılarak türetilmiştir. Biz büyütme altında hücrelerde bakmak için kullanabilirsiniz teknolojisi çarçabuk geliştirir, çoğu biyokimyasal reaksiyonları in vivo yer aldığı koşullarda klasik masa üstü senaryo bu sadece ufak bir benzerlik olmadığı kadar açık hale gelir. Sadece cel iç kısmıdırla yoğun kalabalık etkileri büyük ölçüde çeşitli reaktifler faaliyetlerini değiştirmek hangi, aynı zamanda iyi karıştırılmış oldukça tersidir, çevre dolu. In vitro olarak ve kompleks makromoleküler reaksiyon geniş bir aralık içinde in vivo etkinlikleri arasında sık eşitsizlik için hesaplar. Nowhere in vivo katlama, misfolding ve proteinlerin agregasyonu ile ilgili sorular gibi yanıltmak için daha eğilimli vitro biyokimyasal deneyler klasik kaynaklanan sezgileri vardır. Toplu reaksiyonlarda protein kimyası çalışmaları basit bir evet ya da hayır sorusu olarak verilen bir proteinin katlanma sorunu davranabilirsiniz Oysa bir canlı hücresinde makromoleküllerin bütün nüfus dinamiklerini izlemek için herhangi bir girişimde olası bütün dağıtım duyarlı olmalıdır bir polipeptid zincirini için müsait konformasyonel sonuçlarını ve misfolding ve toplama riski, özellikle de. Örneğin, bir toplu hücre ly incelemek olabilirWestern blotting ile bir araya protein doyurmak ve çoğunlukla protein çözünmeyen ve Ubikitine olmadığını belirler. Bununla birlikte, canlı hücre içinde birçok hücre üzerinde ortalama zaman tespit etmek zordur, protein alt-nüfusu bir ayrık, çözünür ve türlerin lokal konsantrasyonu çok yüksek ise, belirli bir bölme içinde Ubikitine olabilir. İkinci senaryoda büyük toplu alt-nüfusa oranla hücre canlılığı için önemli sonuçlar doğurabilir. Şaperonlar pleiotropik davranışları ve in vitro çeşitli fonksiyonları görüntüler ise Dahası, o hücreye kendi kesikli fonksiyonların mekansal ve zamansal olarak sınırlı olduğu açık hale geliyor. Biyokimya anlamak için yeni ortaya çıkan paradigma, konsantrasyon hücre nano-çevre her belirli bir değişken özelliği olur ve biyolojik süreçlerin altında yatan moleküler olaylar değil sadece zaman test edilmelidir, ama aynı zamanda spac içindee. Burada sunulan 4D görüntüleme yaklaşımı, diğer biyolojik süreçlerin herhangi bir sayı incelemek için kullanılabilir ve nasıl zaman, mekan düzenlenmiştir olsa, canlı hücrelerde protein misfolding hassas modelleme sağlayan ve çevre koşullarında değişiklikler sonrasında. Bu yazıda etkili sitoplazmada protein agregasyonunu başlangıcı ile başa çıkmak için aşamaları ve seçenekleri gösterir Ubc9 ts katlama sensörü kullanın. Toplama kalite kontrol hücre biyolojisi gösteren ek olarak, bu yaklaşım, proteostasis (örneğin Ubc9 ts oksidasyon cevap olarak protein katlanması stres ölçmek için kullanılabilir üzerinde belirli düzensizliklerin veya genetik mutasyonların etki şifresini çözmek için bir güçlü bir araç olarak hizmet edebilir kalite kontrol yolu üzerinde toksik bir agrega veya mutasyonlar) ifadesi. 4D görüntüleme doğru iki farklı protein arasındaki protein yerelleştirme veya kolokalizasyon belirlemek için de önemlidirs, ve belki geçici ama önemli olması olayları algılamak için. Örneğin, özellikle bira mayası gibi küçük bir küresel organizmada, o 4D görüntüleme bu sadece muayene açısı bir dışlayıcı olduğunu ortaya çıkarabilir, oysa bir yapı veya agrega, juxtanuclear lokalizasyonu olduğu durumda görünebilir. Burada mevcut örnekte deneyde, bir modelin kullanımı sitoplazmada zaman ve mekan içindeki agregasyonu kalite kontrol takip etmek için protein, Ubc9 ts, katlanan göstermektedir. Müsamahakâr sıcaklıkta, Ubc9 ts katlandığında ve çekirdek ve sitoplazmada dağınık. Isı kaynaklı misfolding üzerine, başlangıçta hızla proteozomal bozulması için işlenir difüzyon küçük agrega Stres Foci oluşturur. Proteazom kısmen inhibe edildiğinde, bu Stres Foci yaklaşık 2 saat boyunca JUNQ ve IPOD kapanımları dönüştürülür. Ubikuitin-aracılı yıkımı bir kalite kontrol seçeneği, Ub olarak mevcut değilsec9 ts hemen koruyucu toplama için IPOD dahil yeniden yönlendirilir. Bu araçlar agregasyon kalite kontrol dahil yeni genetik faktörler keşfetmek ve hücre kendi zamansal ve mekansal düzenleme keşfetmek için inanılmaz fırsatlar sunuyor.

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>con A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt plakalar</td><td>ibidi</td><td>ibd81158</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4D Protein Agregasyonunun Floresan Görüntülemesi Konfokal 3D filmler, 60x su objektifi NA 1.27, 0.3 mikronluk dilimler kullanılarak PInano Piezo aşaması (MCL) ile donatılmış bir Nikon A1R-si mikroskobu kullanılarak elde edildi, %0,5 lazer gücü (65 mW 488 lazer ve 50 mW 561 lazerden). z yığınları 90 dakika boyunca her 5 dakikada bir elde edildi. Her z serisi, 0.5 mikron adım boyutu ve toplam 30 adım ile elde edildi. Görüntü işleme, NIS-Elements yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.</td></tr></tbody></table>

canlı hücrelerde protein aggregation 4d görüntüleme

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Herhangi bir canlı hücrenin önemli görevlerinden biri sürekli değişen çevre koşulları ve intraselüler ortamda sıkışık olduğunu, yapışkan ve protein stabilitesinin 1 için tehlikeli karşısında yeni sentezlenen proteinlerin doğru katlanır sürdürmektedir. Dinamik protein üretimi, katlama ve yıkımı denge yeteneği olan mutlak bir zorunluluk zaman arızalar iyi görülmektedir yüksek uzman kalite kontrol amaçlı, ister. Böyle ALS, Alzheimer, Parkinson ve Kistik Fibrozis bazı şekilleri gibi hastalıklar protein katlanması kalite kontrol bileşenleri 2 doğrudan bir bağlantı vardır ve bu nedenle gelecekteki terapötik gelişme temel süreçlerin temel bir anlayış gerektirir. Bizim deneysel meydan hücreleri hasara sinyalleri entegre ve farklı koşullara uyarlanmış tepkileri monte nasıl anlamaktır. Protein misfolding varoluşsal thre temsil neden birincil sebebihücreye de agrega için yanlış katlanmış proteinlerin eğilimi böylece kalabalık ve hassas intraselüler Katlama ortamının 1 küresel bir pertürbasyon neden olduğunu. Katlama sağlık veya hücresel proteomun &quot;proteostasis,&quot; ayrıntılı bir kalite kontrol sistemi 3,4 farklı mekanistik birimlerin koordineli eylemi tarafından, hatta yaşlanma, stres ve oksidatif hasarın baskı altında tutulur. Moleküler chaperones bir uzman makine yerli olmayan polipeptitler bağlamak ve yerel devlet 1 içine katlanabilir teşvik edebilir, ubikuitin-proteazom sistemi 5 tarafından bozulması için onları hedef, ya da koruyucu toplama kapanımlar 6-9 yönlendirmek. Juxtanuclear kalite kontrol bölmesi (JUNQ) ve çözünmeyen protein yatağı (IPOD) (- modeli Şekil 1): Ökaryotlarda sitosolik toplama kalite kontrol yük iki bölme 8-10 arasında bölüştürüldü.Protein katlanması kalite kontrol makine tarafından Ubikitine proteinler onlar proteozom tarafından yıkımı için işlenir JUNQ, teslim edilir. Ubikitine değildir katlanan proteinleri, aktif bir koruyucu bölmeye toplanır IPOD, yönlendirilir. Bu noktaya kadar, canlı hücre floresan mikroskop metodolojik paradigması büyük ölçüde etiket proteinlere olmuştur ve iki boyutta zaman noktalarında ve genellikle belirli bir noktadaki hücre içindeki konumları izlemek. Yeni teknolojiler canlı hücrelerde deneyciler Mikronaltı ölçeğine görülmemiş erişim izni başladı gibi, sitoplazmada dinamik mimarisi deneysel karakterizasyonu için zorlu bir yeni sınır olarak görünümü haline gelmiştir. Hızla saat boyunca maya sitozol içinde birden fazla fluoresan etiketli proteinlerin 3D mekansal dağılımları izlenmesi için bir yöntem sunmaktır. 3D timelapse (4D görüntüleme) değil, sadece teknik bir sorundur; sıçanOnu, o da hücresel yapısının incelenmesinde kullanılan kavramsal çerçeve içinde dramatik bir değişim kolaylaştırır. Biz hızlı 4D floresan görüntüleme kullanarak, hücresel agregasyon kalite kontrol katlanan proteinleri için ayrı kaderi görselleştirmek için canlı maya sitozolik bir katlama sensörü proteini kullanır. Ubc9 protein 10-12 (Ubc9 TS) ısı duyarlı mutant hücresel proteostasis bir sensörü, ve izleme toplama kalite kontrolü için bir fizyolojik örnek olarak her ikisi son derece etkilidir. Çoğu ts proteinlerde olduğu gibi, Ubc9 ts aktif hücresel şaperonlar nedeniyle ılımlı sıcaklıklarda tamamen katlanmış ve işlevseldir. 30 ° C üzerinde ya da hücre misfolding stres, Ubc9 ts misfolds yüzler ve mutasyon, ısı denatürasyon, ya da oksidatif hasara bağlı olarak katlanan olan bir yerli proteinin küresel kader izlediğinde. O Stres Foci oluşturur, ya da olduğu gibi fırınlarında bu GFP veya diğer floroforlar için, 3D izlenebilir diJUNQ veya IPOD için düzeltilmelidir.

<html><img alt="Şekil 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> Şekil 1. . Kalite kontrol amaçlı farklı fonksiyonları ile farklı bölmelere katlanan proteinleri yönlendirir katlanan proteinleri Alt hücresel bölümlendirme: Model Çözünür proteinlerin yıkımı için hedeflenen, poli-ubikuitinasyon geçmesi ve Ju XTA-N uclear Q uality kontrol bölmesi (JUNQ gönderilir ). Ancak bunlar aktif toplama tabi burada Ubikitine edilemez çözünmeyen proteinler vakuol bitişik bir nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), karşı koruyucu haciz için gönderilir. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. GFP-Ubc9 ts Modelleme proteinin hatalı katlanması. Normal şartlar altında, GFP-Ubc9 ts (yeşil) yerel katlanır ve nükleus ve sitoplazmada diffüz lokalizedir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Ubc9 ts İfade Tüm deneylerde görüntüleme öncesinde% 2 glukoz ilave edilerek kapatmak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol><li> 37 ile ısı değişimi üzerine ° C, GFP-Ubc9 ts (yeşil) katlanan ve sitosolik gerilme Foci oluşturur. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. </li><li> 23 ° C, ısı şok kurtarma üzerine termal denatüre GFP-Ubc9 ts düşer, azaldıkça floresans düzeyi ile gösterilir. </li><li> 80 Mm MG132, GFP-U ile 37 ° C ve proteazom inhibisyonu sıcaklık kayması üzerine<html> bc9 ts JUNQ ve IPOD kapanımlar halinde katlanan ve işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. </li><li> 37 Sıcaklık kayması üzerine ° C ve ubikuitinasyon inhibisyonu, GFP-Ubc9 ts IPOD dahil içine katlanan ve işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Ubikitin Proteaz 4 (Ubp4) Ubc9 ts ubikuitinasyon engellemek için aşırı eksprese edilmektedir. </li></ol><img alt="Şekil 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> Şekil 3,. JUNQ ve IPOD oluşumu Zaman atlamalı. 37&#39;ye sıcaklık kayması üzerine ° C ve 80 Mm MG132 ile proteazom inhibisyonu, GFP-Ubc9 ts Stres Foci JUNQ ve IPOD kapanımlar halinde işlenir. Nukleus NLS-TFP (kırmızı) ile etiketlenmiştir. 3D görüntüler 4 dk aralıklarla elde edildi. (Ayrıca Film 1&#39;e bakınız).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını göstermek<sup&gt; Ts</sup&gt;, Izleme proteostasis ve 4D mikroskopi kullanılarak canlı hücrelerde toplama kalite kontrol için.

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Bu deneysel sistem, protein katlanma kalite kontrolünün uzay-zamansal dinamiklerini izlemek ve analiz etmek için canlı hücrelerde yüksek çözünürlüklü 3D floresan görüntüleri elde eder. İlk olarak, hücreleri hızla hareket eden protein komplekslerini incelemek için hazırlayın. Yüksek Z çözünürlükte bir Z yığını görüntü elde edin.Ardından, daha sonra Zacks'ten oluşan bir zaman serisi elde edin, elde edilen görüntüleri bir 3D filmde oluşturun ve ortaya çıkan görüntüleri analiz edin. Sonuç olarak, dört boyutlu görüntüleme, farklı koşullarda hücrelerdeki dinamik ve geçici olayların izlenmesini sağlar. Dört boyutlu görüntülemenin geniş alan mikroskobu ve hızlandırılmış çekim gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücredeki tüm protein popülasyonunun dinamiklerini ve mekansal zamansal dağılımını aynı anda yüksek çözünürlükte görselleştirmemize izin vermesidir.Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki protein agregasyonu, kalite kontrolü ve protein katlanması ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar son derece dinamik ve geçici süreçlerdir. Bu nedenle, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük olmadan, birçoğunu gözlemlemek imkansız olurdu.Bu yöntem, toplama kalite kontrolü hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca protein etkileşimi ve dinamiği çalışmalarında devrim yaratabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü endojen olarak etiketlenmiş veya düşük eksprese eden proteinlerin 3D filmlerini çekmek sistemin stabilitesini gerektirir.Yüksek hassasiyet ve düşük foto ağartma Maya suşlarını, UBC dokuzunun sıcaklığa duyarlı mutantı gibi, bir sitozolik katlama sensör proteinine bağlı bir Fluor füzyon proteini için bir ekspresyon plazmidi ile dönüştürün. Mayayı 24 saat boyunca% 2 rafinoz içeren sentetik ortamda büyütün, daha sonra gece boyunca% 2 Galaktoz içeren ortama% 2 oranında seyreltin, sorgu suşunu yaklaşık 0.2'lik bir OD 600'e seyreltin ve kültür, görüntülemeden 30 dakika önce 0.8 ile 1.0 arasında bir OD 600'e ulaşana kadar dört ila altı saat boyunca kültürleyin. Ekspresyonu% 2 glikoz ile desteklenmiş sentetik ortam ile bastırın.Bu adım, eksprese proteinin yalnızca önceden çevrilmiş ve katlanmış havuzunun izlenmesine izin verir. Şimdi hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca ısıtın. Yanlış katlamayı önlemek için, dört D.Imaging alımı sırasında odağı korumak için uygun bir plaka seçin.Plakanın altını 10 dakika boyunca mililitre con A başına 0.25 miligram ile örtün. Con A, hücreleri slayta yapıştırmak için kullanılır, bu da zaman içinde tek bir hücrenin takip edilmesini sağlar. Con A ve oku aspire edin, plakayı kimyasal bir kaputta kurutun.Ardından 200 mikrolitre maya örneği ekleyin. Hücrelerin plakaya yapışmasını sağlamak için 15 dakika inkübe edin. Maya görüntülemesi için tek bir hücre tabakası elde etmek için ortamla üç yıkama gerçekleştirin.Ekteki metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi birkaç standart olmayan modifikasyon içeren bir konfokal mikroskop kullanın. Bu maya görüntüleme sistemi, dört adede kadar lazer ve filtrelerle donatılmış dört adede kadar foto çarpan tüpü kullanır. Görüntülemelerimizin çoğu EGFP için yeşil filtre seti ve m kiraz ve TD domates için kırmızı filtre seti ile yapılmaktadır.Ayrıca konfokali bir pi nano pizo aşamalı mükemmel odak sistemi ile donatın ve hem galvan O hem de rezonans tarayıcılar, istenen sıcaklığa ulaşılana kadar mikroskop sistemini dengeler. Görüntüleme ortamının kırılma indisine karşı numunenin ortamına dayalı görüntülemeden önce, uygun objektif su, yağ veya havayı seçin. Düzeltme bileziğini plakanın kalınlığına göre ayarlayın.Objektifi lens mendilleri ve etanol kullanarak temizleyin. Ayrıca numuneyi taşıyan slaytı da temizleyin. Plakayı sahne tutucuya güvenli bir şekilde yerleştirin ve her numune için doğru ayarların yapıldığından emin olmak için numune tutucunun stabilitesini doğrulayın.Göz portu ile nokta yayma işlevini görselleştirmek için floresan boncuklar kullanırken düzeltme bileziğini ayarlayın. Mayanın yerini ve yönünü belirleyin. Ardından, gerekli epi floresan ışığını açın ve ilgili fenotipi gösteren hücrelere odaklanın.Daha sonra brightfield kullanarak, hücre canlılığı değerlendirmeleri için şekil ve dokuya göre hücre sağlığını ve canlılığını değerlendirin. Çekirdeği, bir SV 40 ve LS sinyaline kaynaşmış bir TD domates florası Fluor ile görselleştirin. TFP, GFP'nin iki katı büyüklüğündedir.Çekirdeğin difüzyon sınırının üzerinde olduğu için nükleer bir belirteç olarak çok iyi çalışır. TFP'yi GFP ile aynı anda yeşil bir 4 88 nanometre lazerle uyarın, ancak spektral çözünürlük için yeşil ve kırmızı emisyonları iki ayrı PMT'de toplayın. Gürültüyü ve doygunluğu en aza indirmek için, lazer gücünü ve iğne deliği çapını ekteki el yazmasında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın.Farklı flora kuvveti uyumlu dalga boyu yayarsa, deneysel tasarıma göre hızlandırılmış görüntüler elde etmek için sanal filtrelerin seçimine devam eden spektral dedektör özelliğini kullanın, Yanlış Katlanmış Protein U BBC dokuz T, zaman ve mekan üzerinde toplama kalite kontrolünü takip etmek için bir model sistem sağlar. İzin verilen sıcaklıktaki sitozolde, UBC dokuz T katlanır ve ısıya bağlı yanlış katlanma üzerine çekirdek ve sitozol içinde yayılır. Başlangıçta proteazomal bozunma için işlenen hızla yayılan küçük sitozolik agregat punkta oluşturur.Proteazom kısmen inhibe edildiğinde, bu punkta yaklaşık iki saat boyunca önemsiz ve iPod kapanımlarına dönüştürülür. Normal koşullar altında, GFP UBC dokuz T doğal olarak katlanır ve burada yeşil renkte görüldüğü gibi çekirdek sitozolünde yaygın olarak lokalizedir. Sıcaklık 37 santigrat dereceye kaydığında, füzyon proteini yanlış katlanır ve 23 santigrat derecede ısı şokundan geri kazanıldıktan sonra sitozolik punkta agregatları oluşturur.Termal olarak denatüre edilmiş G-F-P-U-B-C dokuz T, azalmış floresan seviyesi ile gösterildiği gibi bozunur. Çekirdek N-L-S-T-F-P ile kırmızı olarak etiketlenir. Sıcaklığın 37 santigrat dereceye kayması proteazom inhibisyonu ile birleştiğinde, G-F-P-U-B-C dokuz T yanlış katlanır ve önemsiz ve iPod kapanımlarına işlenir.Burada, ubikitin proteaz dörtlüsü, sıcaklık kayması ile birlikte ubikitinasyonun ubikitinasyon inhibisyonunu bloke etmek için aşırı eksprese edilmiştir, bu da G-F-P-U-B-C dokuz T'nin iPod Dahil Edilmesine işlenmesine neden olur. Dört dakikalık aralıklarla elde edilen bu hızlandırılmış görüntüler, hurda ve iPod oluşumunun dinamiklerini net bir şekilde tasvir ediyor. Bu teknik, UBC dokuz T'yi bir katlama sensörü olarak kullanarak zaman içinde hücresel proteostazı izlemek için kullanılabilir.Dört boyutlu görüntüleme, memeli hücreleri ve C elegance gibi diğer model sistemlerde de yapılabilir. Dört boyutlu görüntüleme ayrıca, çözünebilir agrega stres odaklarının oluşumu ve dinamikleri ve agregaların çöp ve iPod bölmelerine iletilmesi gibi agregasyon kalite kontrolündeki diğer ince olaylar hakkında da bilgi sağlar.

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, proteazom aktivitesini bloke eden, yanlış katlanmış, mutant proteinlerin, bir floresan etikete kaynaşmış, ubikitine bağımlı proteazomal bozunmaya uğramasını önleyen proteazom inhibitörleri kullanılarak hücre bazlı bir protein agregasyon testini gösteriyoruz, bu da hücre sitoplazması içinde birikmelerine yol açar. Protein agregatları daha sonra floresan mikroskobu ile görselleştirilir ve ölçülür.

Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, genetiği değiştirilmiş Drosophila beyinlerindeki protein agregatlarının görüntülenmesini ve miktarının belirlenmesini göstermektedir. Beyinler sabitlenir, yıkanır ve montajdan önce solma önleyici bir madde ile muamele edilir. Görüntüler konfokal bir mikroskop kullanılarak yakalanır ve mutant protein agregatlarının iletimini gözlemlemek için nicelleştirilir.

Genetiği Değiştirilmiş Drosophila Beyinlerinde Protein Agregatlarının Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Biz toplama misfolded proteinlerin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim protocol detayları lentiviral istikrarlı hücre satırı üretimi, otomatik confocal görüntüleme ve görüntü analizi protein toplamları indüklenen. Açıklayıcı bir uygulama olarak SOD1 toplama bir saat ve doz bağımlı şekilde teşvik küçük moleküller etkisini okudu.

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Kanıt biriken patojenik protein toplamları deli dana gibi özelliklere sahip hücreleri arasında yaymak nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili fikir destekler. Burada, hücre hücre yayılma model organizma, Drosophila melanogasterdeli dana gibi toplamları görselleştirme sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır.

Drosophila Melanogaster deli dana gibi Protein toplamları izleme hücre hücre iletim

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

Maya 4D mikroskopisi

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Öğrenin canlı hücrelerde protein katlanma kalite kontrolünün 4D mikroskopi ile dinamiklerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik, hücresel proteostaz ve protein birikimi hastalıklarının anlaşılmasına katkı sağlar.

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Daha fazla video keşfet