Name: Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi Mısır rayado fino virüsü Virüs gibi parçacıklar Nicotiana benthamiana Bitkiler ve Çapraz bağlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, Mısır rayado fino virüsü VLP'lerindeki sistein kalıntılarının solvent erişilebilirliğini analiz etmeyi ve bu kalıntılara peptitleri çapraz bağlamayı. Bu yöntem, bitki virüsü temelli nanomalzemelerin biyoteknolojideki uygulamalarını genişletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Nicotiana benthamiana Bitkiler Virüs Aşılaması ve VLP&#39;ler Arıtma <ol><li> Patates X virüsü (PVX) tabanlı taşıyan vektör plasmidlerden şapkalı T7 RNA transkriptleri üretin MRFV wild-tip (wt) ve Cys-mutasyona uğramış kılıf protein (CP) genleri 12, Ambion en T7-mMessage mMachine Kit kullanarak. </li><li> Her T7 transkript reaksiyon için, N., iki tam genişletilmiş yaprakları aşılamak 10 ul reaksiyon ile ve 25 ışık (25,000-30,000 lux) ile 16 saat süreyle% 60 nem, serada 10 gün için inkübe edilir benthamiana bitkiler 20 ° C&#39;de ve 8 saat karanlık ° C. </li><li> Harves t N. benthamiana virüs bulaşmış yaprakları 10 gün sonrası aşılama (dpi), buz üzerinde bitki doku (50 gram) ve yer tartın. </li><li> 0.5 M Na-sitrat tampon, pH = 5.5 (kullanımı 2 bitki gram doku başına tampon ml) içinde soğutulmuş bir çözeltisi, 100 ml varlığında, bir karıştırıcı içinde bitki materyali homojenize edilir. </li><li> Cheesecl 3 kat boyunca Homojenat Filtreoth ve 30 dakika boyunca 27,000 x g&#39;de santrifüj ile netleştirmek. Soğutulmuş mezun silindirin içine supernatant aktarın, hacmini ölçmek ve sonra soğutulmuş steril behere aktarılır. Pelet atın. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta 15 dakika için karıştırılır,% 10 polietilen glikol 8000 (PEG 8000) ilave edilerek süpernatant işleme ve 4 de ilave bir 45 dakika süreyle inkübe ° C virüs benzeri tanecikler (VLP&#39;ler)-PEG matris çökeltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 27,000 x g numune santrifüjlenir ve süpernatant çıkarın. </li><li> 0.05 M Na-sitrat tamponu, 5.5 2 içeren% Triton X-100, pH 8 ml ilave edilerek pellet işlemden geçirin. Swirl santrifüj tüplerine de pelet yayınlayacak. Soğutulmuş steril behere pelet ve tampon aktarın. Aynı tampon, 2 ml ile hemen tüpler yıkayın ve behere ekleyin. Pelet (genellikle 1 saat) çözülene ° C kadar 4 de süspansiyon karıştırın. </li><li> 27,000 x g&#39;de 5 dakika için santrifüjleme ile netleştirmek için pelet atmak ve p,4 de 2 saat boyunca 140,000 x g&#39;de santrifüj ile roses süpernatant ° C. </li><li> 1 ml 0.05 M Na-sitrat tampon, pH 5.5 &#39;de pelet yeniden süspanse edin ve 0.05 M Na-sitrat tampon, pH = 5.5 içinde yapılmış bir% 10-40 oranında sakaroz eğim üzerine süspansiyon yerleştirin. </li><li> 4 de 140,000 xg&#39;de 3 saat boyunca gradyanı Santrifüj ° C. </li><li> Santrifüj tüpünün üst üzerine hafif bir parlaklık ve tüpün üst kısmından 4 cm ışık saçılım üst bant toplamak, 4 az 140,000 xg&#39;de 3 saat için 0.05 M Na-sitrat tamponu, pH 5.5, ve santrifüj ile sulandırmak ° C. </li><li> Altı ay için 4 ° C de steril su deposu ve 0.5 ml içinde pellet yeniden süspanse edin. </li><li> Bir Bradford protein tayini yapılarak VLP&#39;ler konsantrasyonunu ölçmek. VLP&#39;ler verimi bitki dokusunun 1 ila 3 mg / g&#39;dır. </li></ol> 2. VLP&#39;ler arasında Flöresein-5-maleimid-etiketleme Reaksiyonları <ol><li> 50 mM sodyum fosfat içinde fluoresein-5-maleimit (427,37 g / mol) bir 1 mM çözelti hazırlayınE tamponu, pH 7.0, 1 mM EDTA. Vorteks kullanılarak karıştırılır ve tam çözünme doğrulayın. Alüminyum folyo ile ışıktan tüp koruyun. </li><li> Adım 1 ve karıştırın üretilen VLP&#39;ler fluoreseinin-5-maleimid ekleyin. Sülfhidrilleri molar miktarda fluoresein-5-maleimit bir 25 kat molar fazlalık kullanın. Genel olarak, 1 ug / ml &#39;den ve fluoresein-5-maleimit solüsyonu 60 ul arasında derişimde VLP&#39;ler 30 ul kullanılarak kabul edilebilir sonuçlar elde edilmektedir. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında gece boyunca 2 saat boyunca reaksiyon inkübe </li><li> 50 mM bir son konsantrasyon için ditiyotretol (DTT) ilave edilerek tepkime sona erdirme. </li><li> İzleme olmayan reaksiyona oda sıcaklığında 1,500 x g&#39;de 2 dakika süre ile bir tuzsuzlaştırma spin kolon (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) ve santrifüj kullanılarak floresein. </li><li> SDS-PAGE analizi için, her bir reaksiyon 10 ul 2 x SDS-PAGE Laemmli numune tamponu 10 ul ilave edin. Yukarı bir ay ya da için 4 ° C&#39;de ışıktan koruyarak etiketli protein saklayın3 aya kadar -20 ° C&#39;de tek kullanımlık alikotları. </li></ol> 3. Biotin Kuruluş ve reaksiyon Belirlenmesi Etiketleme <ol><li> Su, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 1. Adımda üretilen VLP&#39;ler arasında pH değeri 7.0 olan bir tampon alışverişi yapmak için tuzsuzlaştırma sıkma kolon (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) kullanın. </li><li> Aşağı yukarı pipetleme ve tarafından maleimid-PEG2-biotin ve mix No-tartılır PBS 190 ul ekleyerek maleimid-PEG2-biotin bir 20 mM stok solüsyonu hazırlayın. </li><li> VLP&#39;ler ve karıştırın maleimid-PEG2-biotin ekleyin. VLP&#39;ler çözümler için bir ayıraç ile 10-kat molar fazlalığı kullanmak ≤ 2 mg / ml idi. </li><li> 4 saat için oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin. </li><li> İzleme olmayan reaksiyona oda sıcaklığında 1,500 x g&#39;de 2 dakika süre ile bir tuz giderme spin kolon (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) ve santrifüj kullanılarak maleimid-PEG2-Biotin. </li><li> Pierce Biotin kantitasyonu Takımı (Thermo Scientific) ve fo kullanarak VLP&#39;ler mol başına biotin mol belirleyinüreticinin talimatlarına llowing. </li></ol> 4. Cys 2-VLP&#39;ler ve F Peptid Çapraz bağlama <ol><li> Adım 2. (2-Cys VLP&#39;ler) çapraz bağlama için mevcut sistein kalıntıları ile sonuçlanmıştır VLP&#39;ler aşağıdaki adımda kullanılır. Dimetil sülfoksit 680 ul NHS-PEG4-maleimid çapraz bağlayıcı 10 mg çözülerek taze bir çapraz-bağlayıcı stok çözeltisi (28.63 mM) hazırlayın. </li><li> , 17 (F) çözülür-amino konjugasyon tamponu 50 ul (1 x PBS, pH 7.2, 1 mM EDTA) içinde asit uzunluğunda peptid (LLPNMOKDKEACAKAPL) 0.1 mM bir konsantrasyonda. </li><li> 1 mM nihai konsantrasyonunda (ki peptid solüsyonu, 0.1 mM için bir 10-kat molar fazlası tercih edilir) çözündürüldü peptit (protein-NH2) 50 ul çapraz bağlayıcının 4 ul ekle. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 saat inkübe reaksiyon </li><li> 1,500 x g&#39;de santrifüj ile, konjugasyon tampon (1 mM EDTA 1 x PBS, pH 7.2) ile dengelenmiş bir tuz giderme kolonu (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL) kullanılarak çapraz bağlı peptit arındırmakOda sıcaklığında 1 dakika için. </li><li> VLP&#39;ler (protein-SH) ve reaksiyon ile VLP&#39;ler ile peptid arasında bir moleküler ağırlık arasındaki fark olarak dahil tioller ve aktive edilmiş aminlerin sayısına göre belirlenen bir molar oranda çapraz bağlı peptit (protein-NH2) birleştiren bir reaksiyon karışımı ayarlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 saat için oda sıcaklığında reaksiyon karışımı inkübe </li><li> Western blot analizi için, Laemmli tamponu, 10 dk için kaynatılır, ile elde edilen konjüge ürün 1:1 Karışım ve% 10-20 Tris-Glisin jeli (Invitrogen) ve bir ön-dökme üzerinde SDS-PAGE ile devam edin, bir üzerine electroblotting takiben Nitroselüloz zar (Invitrogen). 1 x PBS, pH 7.2% 0.05 Tween 20 (PBS-Tween) ve uygun fosfataz-etiketli ikincil antikor tarafından takip peptit-spesifik antikorlar ile% 5 kaymağı alınmış süt tozu ve sonda içeren membranlar ile engelleme. </li></ol>

<ol><li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconj.+Chem%22%5BJournal%5D)">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li>
<li>Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+vector+for+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a vector for gene expression in plants.</a> Plant J. 2, 549-557 (1992).</li>
<li>Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+gold+particles+in+viral+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Packaging of gold particles in viral capsids.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).</li>
<li>Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+liquid+crystals+as+templates+for+the+interior+design+of+silica+mesophases+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles.</a> Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).</li>
<li>Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biomolecular+templates+for+the+fabrication+of+metal+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS.+J%22%5BJournal%5D)">Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires.</a> FEBS. J. 274, 317-322 (2007).</li>
<li>Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+a+viral+cage+for+multivalent+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation.</a> Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).</li>
<li>Hammond, R. W., Hammond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+capsid+proteins+assemble+into+virus-like+particles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli.</a> Virus Res. 147, 208-215 (2010).</li>
<li>Hermamson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermamson%2C+GT+%22Bioconjugate+techniques%22">Bioconjugate techniques</a>. , Academic Press. San Diego. (1991).</li>
<li>Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+studies+of+protein+cage+nanoparticles+demonstrate+broad+tissue+distribution+and+rapid+clearance+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo.</a> Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).</li>
<li>Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotemplate+synthesis+of+3-nm+nickel+and+cobalt+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires.</a> Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).</li>
<li>Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CuCl2+concentration+on+the+aggregation+and+mineralization+of+Tobacco+mosaic+virus+biotemplate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid.+Interface.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).</li>
<li>Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+deposition+of+alternate+layers+of+polyelectrolytes+and+a+charged+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus.</a> Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).</li>
<li>Natilla, A., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+virus-like+particles+expressed+in+tobacco+plants%3A+a+new+platform+for+cysteine+selective+bioconjugation+peptide+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display.</a> J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).</li>
<li>Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+trafficking+of+plant+virus+nanoparticles+in+mice+via+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route.</a> Virology. 343, 2224-2235 (2005).</li>
<li>Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+virus-polymer+materials.+Synthesis+and+properties+of+PEG-decorated+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus.</a> Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).</li>
<li>Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silica-coated+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus.</a> J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+in+the+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li>
</ol>

Yayında ticari ürünlerin ticaret ünvanlı Mansiyon spesifik bilgilerin sağlanması amacıyla sadece ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez.

Burada sunulan yöntem, bitki üretilen VLP&#39;ler yüzeyi üzerinde hem de diğer protein kompleksleri üzerinde mevcut reaktif sistein çok hassas ve hızlı bir analizine izin verir. Maleimides stabil tiyoeter bağları oluşturmak için ücretsiz sülfidril içeren moleküllerle reaksiyona tiyol özgü reaktifler vardır. Bu yöntem, diğer amino asitler ile etkileşimlerine sülfhidril grupları ile tepkimeye maleimides özgüllüğünü dayanmaktadır. VLP&#39;ler arasında doğal yapısının korunması tüm süreç boyunca çok önemlidir. Tarif edilen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Thinwall, Ultra-Clear Tüpler </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7 Takımı </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresein-5-Maleimid </td><td> Thermo Scientific Life Teknolojileri </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 F150 ile sipariş yerine dışında </td></tr><tr><td> Pierce Biotin Kantifikasyonu Takımı </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link Maleimid-PEG2-Biotin, Biçim No-Weigh </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) n Çapraz Bağlayıcılar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> % 10-20 Tris-Glisin jeli </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli Tampon </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glisin SDS Buffer Koşu </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glisin Transferi Tampon </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroselüloz Membran Filtre Kağıdı Sandviç </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan IgG antikor Arıtılmış Fosfataz Etiketli Affinity </td><td> Kirkegaard ve Perry Laboratuvarları </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP Fosfataz Yüzey </td><td> Kirkegaard ve Perry Laboratuvarları </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

sistein kalıntılarının solvent erişilebilirlik analizi<em&gt; mısır rayado fino virüsü</emÜretilen&gt; virüs gibi parçacıklar<em&gt; nicotiana benthamiana</emvlp&#39;ler için peptidlerin&gt; bitkiler ve Çapraz bağlama

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Virüs özellikleri ve fiziko-kimyasal ve fiziksel özelliklerini taklit ve sömürücü dünyanın en acil sorunlarından bazılarına çözümler sunmak için umut vaat ediyor. Sırf aralığı ve ilginç özellikleri ile birleştiğinde virüs tipleri potansiyel virüs tabanlı teknolojilerde uygulamalar için sonsuz fırsatlar verecektir. Virüsler, sıcaklık ve pH koşulları altında geniş bir yelpazede farklı şekil ve boyut, simetri özgüllüğü, polyvalence, ve sabit özelliklere sahip partiküller halinde kendini monte etmek özelliğine sahiptir. Doğal olarak, bu gibi özelliklerinin dikkate değer bir dizi ile, virüs biomateryaller 9, aşılar, 14, 15, elektronik maddeler, kimyasal araçlar, konteynırlar ve moleküler elektronik 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12 olarak kullanım için önerilmiştir. Nanoteknolojide virüsler kullanılması için, yeni işlevler vermek için kendi doğal formlardan değiştirilmesi gerekir. Bu zorlu process gen viral genomun değişiklik ve kimyasal olarak virüs parçacığı reaktif gruplar 8 ile yabancı ya da arzu edilen moleküllerin bağlanması dahil çeşitli mekanizmalar vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. Bir virüs değiştirme yeteneği öncelikle virüs fizikokimyasal ve fiziksel özelliklerine bağlıdır. Buna ek olarak, genetik veya fizikokimyasal olumsuz değişiklikler virüsün doğal yapısını ve fonksiyonunu etkileyen virüs olmadan gerçekleştirilmesi gerekir. Maize rayado fino virüsü (MRFV) kat proteinler, protein-protein stabilize edilmektedir kararlı ve boş VLP&#39;ler üreten E. coli içinde kendi kendine bir araya etkileşimi ve bu virüs bazlı teknolojileri uygulamalar 8 kullanılabilir. Tütün bitkilerinde üretilen peptidlerin VLP&#39;ler çeşitli kovalent 13 görüntülenebilir hangi bir yapı iskelesi olarak incelenmiştir. Burada, bir virüs kapsid içinde çözücü erişilebilir sissteinler hangi modifikasyonu için kullanılabilir belirlemek) 1 adımları açıklarkatyon, ve 2) capsids ile değiştirilmiş peptitler bioconjugate. Doğal ya da mutationally takılan amino asit kalıntıları ve standart bağlama teknolojileri kullanarak, malzemeler çok çeşitli böyle Brom mozaik virüsü 3, karanfil benek virüsü 12, Börülce klorotik benek virüsü 6, Tütün mozaik virüsü gibi bitki yüzeyinde ortaya konulmuştur Virüs 17, Şalgam sarı mozaik virüsü 1 ve MRFV 13.

N. mutant MRFV kılıf protein (CP) genlerin geçici ifadesi bir PVX bazlı vektör üretiminde VLP&#39;ler içinde benthamiana bitki Şekil 1 &#39;de tarif edilmektedir. Modifiye MRFV kılıf protein geni bir PVX tabanlı vektör, pP2C2S 2, (D. Baulcombe, Sainsbury Laboratuvarları, Norwich, İngiltere bir hediye) olarak çoğaltılamaz subgenomik CP organizatörü transkripsiyonel kontrolü altında amplifiye ve sonra yerleştirilir. Yılında In vitro RNA transkripsiyonu sonra N.</e...

Sistein artıkları tiyol grubunun çözücü yönelik analiz etmek için bir yöntem,<em&gt; Mısır rayado fino virüsü</emBir peptid çapraz bağlama reaksiyonu, ardından&gt; (MRFV)-virüs benzeri tanecikler (VLP&#39;ler) tarif edilir. Yöntem, belirli reaksiyonlar için hedef olabilir VLP&#39;ler yüzeyi üzerinde çeşitli kimyasal gruplarından durumu yararlanır.

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi<em&gt; Mısır rayado fino virüsü</emÜretilen&gt; Virüs gibi parçacıklar<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLP&#39;ler için Peptidlerin&gt; Bitkiler ve Çapraz bağlama

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, virüs benzeri parçacıkların (VLP'lerin) yüzeyindeki Sistein kalıntılarının çözücü erişilebilirlik analizini gerçekleştirmek ve ardından peptitlerin virüs benzeri parçacıklardaki Sisteinlere çapraz bağlanmasını sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle Maize rayado fino virüsü veya MRFV kılıf proteininin patates virüsü-X tabanlı bir virüs vektörüne klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, N. benthamiana bitkileri modifiye edilmiş virüs ile inoküle edilir ve kılıf proteininden oluşan MRFV VLP'leri saflaştırılır. Son olarak, VLP'ler ve peptitler amonyak-PEG4-maleimid kullanılarak çapraz bağlanır ve western blot ile tespit edilir. Western blot analizi yoluyla VLP peptit komplekslerinin üretimini tanımlayan sonuçlar elde edilir. Bu teknik, nanoteknoloji için yeni materyaller üretmek amacıyla virüslerin ve virüs benzeri parçacıkların yüzeylerinin nasıl kimyasal olarak modifiye edileceğine dair bilgi birikimini genişletmektedir.MRFV vahşi tip ve kistein-mutasyona uğratılmış kılıf proteini genlerini taşıyan patates virüsü-X tabanlı vektör plazmidlerinden Kepli T7-RNA transkriptleri ürettikten sonra, iki N. benthamiana yaprağını inoküle etmek için her biri 10 µL olan iki alikot kullanın. Bitkileri bir serada %60 nemde, 25 °C'de 16 saat ışık ve 20 °C'de sekiz saat karanlık olacak şekilde 10 gün boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda virüsle enfekte olmuş yaprakları hasat edin, bitki dokusunu tartın ve buz üzerine yerleştirin. Virüs benzeri partikülleri metin protokolüne göre saflaştırdıktan sonra, 50 mM sodyum fosfat tamponu (pH 7.0, 1 mM EDTA) içerisinde 1 mM'lık Fluorescein-5-maleimide çözeltisi hazırlayın. Tamamen çözünmesi için vorteksleyin ve çözeltiyi ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın. Yaklaşık 30 µL 1 µg/µL VLP ile 60 µL Fluorescein-5-maleimide'i karıştırın ve oda sıcaklığında iki saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Reaksiyonu, final konsantrasyonu 50 mM olacak şekilde DTT ekleyerek sonlandırın. Reaktif olmayan floresseini uzaklaştırmak için bir tuz giderme spin kolonu kullanın. Çapraz bağlama için uygun kistein kalıntılarına sahip VLP'leri görselleştirmek için, her bir reaksiyondan 10 µL'ye 10 µL 2x örnek tamponu ekleyerek SDS-PAGE analizi gerçekleştirin. İşaretlenmiş proteini ışıktan korunmuş şekilde 4 °C'de bir aya kadar veya tek kullanımlık alikotlar halinde -20 °C'de üç aya kadar saklayın.10 miligram NHS-PEG4-maleimide çapraz bağlayıcıyı 680 mikrolitre dimetil sülfoksitte çözerek taze bir çapraz bağlama stok çözeltisi hazırlayın. 17 (F)-amino asit uzunluğundaki bir peptidi, 0,1 milimolar konsantrasyonda 50 mikrolitre konjugasyon tamponunda çözün. 1 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için, çözünmüş peptidin 50 mikrolitresine dört mikrolitre çapraz bağlayıcı ekleyin. Reaksiyonu dört derece santigrat sıcaklıkta iki saat boyunca inkübe edin. Ardından reaksiyonu saflaştırmak için bir tuz giderme kolonu kullanın. Çapraz bağlama için mevcut sistein kalıntılarına sahip VLP'ler ve çapraz bağlı peptid kullanarak; reaksiyonda yer alan tiyol ve aktive edilmiş aminlerin sayısı ile VLP'ler ve peptid arasındaki molekül ağırlığı farkı tarafından belirlenen molar oranda bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Reaksiyonu oda sıcaklığında iki saat inkübe ettikten sonra, metin protokolüne uygun olarak SDS-PAGE ve western blotting işlemlerini gerçekleştirin.MRFV kılıf proteininin reaktif amino asitlerine bir örnek burada gösterilmiştir. Seçilen her bir amino asit, yüzeye açık olması durumunda farklı grupları bağlamak için kullanılabilir. Kimyasal teknikler arasında lizin amino grubunun açilasyonu, sistein sülfhidril grubunun alkilasyonu, karboksilik asit kalıntılarının aktivasyonu ve eklenen aminlerle eşleştirilmesi gibi geleneksel biyo-konjugasyon stratejileri yer almaktadır.Ek olarak, tirozin ve triptofanın aromatik grupları, diazotizasyon ve alkillasyon yoluyla biyokonjugasyon için cazip hedefler olabilir. Burada, VLP'lerin Cys kalıntılarının tiyolle spesifik reaktiflere karşı çözücü erişilebilirliği gösterilmiştir. CP geninin 107 ila 111 ve 192 ila 194. pozisyonlarında Sistein kalıntıları taşıyan saflaştırılmış yabani tip VLP'ler ve cys-VLP mutantları, doğal koşullarda tiyol spesifik bir reaktifle reaksiyona girmezler. Fluorescein-5-maleimide, yalnızca CP geninin 125 ila 129. pozisyonlarında Sistein kalıntıları taşıyan Cys-VLP mutantı için turuncu floresan sağlar. Sonuç, ikinci şeritteki VLP'lerin çözücüye maruz kalmış serbest tiyol grupları ile sonuçlanan bir Sistein kalıntısı geometrik düzenlemesine sahip olduğunu, birinci ve üçüncü şeritteki örneklerdeki Sistein kalıntılarının ise muhtemelen kapsid proteininin katlanmasındaki di-sülfit köprülerinde yer aldığını göstermektedir. Maleimide-PEG2-biotin ile etiketleme reaksiyonlarını takip eden bir biotinilasyon analizi, cys kalıntılarının çözücü erişilebilirliğinin analizine başka bir örnek teşkil eder. Biotin nispeten küçük bir molekül olduğundan, burada gösterildiği gibi her biri bir avidin molekülü ile birleşen birkaç kopya halinde VLP'lere konjuge edilebilir. Protein başına 84,74 mol biotin olan biotinilasyon seviyesi, VLP'lere bağlı biotin moleküllerinin sayısını ve dolayısıyla dış yüzeyde sergilenebilecek ligand sayısını belirtir. VLP'lerde birden fazla tiyol grubunun bulunması nedeniyle, NHS-PEG4-maleimide ile çapraz bağlama reaksiyonları kullanılarak peptitler tutturulabilir.Bu reaktif, amin ve sülfhidril içeren moleküllerin kovalent konjugasyonuna olanak tanıyan N-hidroksi süksinimid veya NHS-Ester ve maleimid grupları gibi reaktif uçlar içeren hetero-bifonksiyonel bir çapraz bağlayıcıdır. Bu örnekte, NHS Ester birincil aminlerle reaksiyona girerek amid bağları oluştururken, maleimid sülfhidril grupları ile reaksiyona girerek stabil tioester bağları oluşturur. Burada görüldüğü gibi, çapraz bağlama reaksiyonları, western blot'taki spesifik antikorlarla immünoreaktif olan VLP-peptit kompleksleri üretir.Bu geliştirme, viroloji alanındaki araştırmacılara, çok sayıda uygulama için geniş bir ligand çeşitliliğinin düzenli bir geometrik dizide tutturulması amacıyla virüs partiküllerinin bir iskele olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

analysis-solvent-accessibility-cysteine-residues-on-maize-rayado-fino

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu çalışma, transmisyon elektron mikroskobu ve negatif boyama yöntemleri için mikrodalga destekli bitki numune hazırlama kombinasyonu kullanarak yaklaşık yarım gün bitki virüs hastalıklarının hızlı ve net bir teşhis sağlayan bir yöntem açıklanır.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3'-3 'diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi...

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine ​​bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

Küçük açılı X-ışını yayma (SAXS) bir protein çözeltisi yapısının belirlenmesi tek dağılımlı örnekleri gerektirir. Burada, örnek hazırlama ile veri kazanımı arasında en az gecikme sağlamak için iki seçenek sunmak: Online boyut dışlama kromatografisi (SEC), çevrimiçi iyon değiştirme kromatografisi (IEC).

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Burada, fluorescently Qβ VIP üzerinde disulfides dibromomaleimide ile functionalize için bir yordam mevcut. Biz Qβ ifade ve arıtma, molekülleri dibromomaleimide functionalized sentezi ve dibromomaleimide ve Qβ arasında konjugasyon tepki açıklanmaktadır. Elde edilen Sarı floresan konjuge parçacık bir floresan sonda hücrelere olarak kullanılabilir.

Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

Viral poliproteine gömülü homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantılarını belirlemek için genel bir protokol sayılmiyoruz. SSHHPS viral proteazlar tarafından tanınan ve çeşitli Grup IV virüsler tarafından belirli konak proteinlerin hedefli imha doğrudan.

Grup IV Viral SSHHPS In Vitro ve In Silico Yöntemleri Kullanılarak Analizi

Bu protokol, virüs-plazmodesmata etkileşimleri veya plazmodesmal transport sırasında plazmodesmataya protein hedeflemenin konfokal mikroskopi tabanlı analizleri için optimal plazmodesmal belirteçlerin seçimini açıklar.

Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

Öğrenin, Mısır rayado fino virüsü VLP'lerindeki sistein kalıntılarının solvent erişilebilirliğini analiz etmeyi ve bu kalıntılara peptitleri çapraz bağlamayı. Bu yöntem, bitki virüsü temelli nanomalzemelerin biyoteknolojideki uygulamalarını genişletir.

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi Mısır rayado fino virüsü Virüs gibi parçacıklar Nicotiana benthamiana Bitkiler ve Çapraz bağlama (Video) | JoVE Journal

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi

Daha fazla video keşfet