Name: 3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Öğrenin, immünofloresan ve DNA FISH tekniklerini birleştirerek 3D korunmuş çekirdeklerde kromatin modifikasyonlarını ve DNA dizilerini eş zamanlı tespit etmeyi. Bu yöntem hücre biyolojisi ve genetik araştırmalarında nükleer organizasyonu incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tartışmalar ve yorumlar için Skok laboratuar, özellikle Susannah Hewitt, üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) tarafından desteklenmektedir. JAS Bir Lösemi ve Lenfoma Derneği bilgindir. JC Kanser Araştırma Enstitüsü Irvington Enstitüsü üyesidir. MM Ulusal Bilim Vakfı Hibe Bütünleştirici Lisansüstü Eğitim ve Araştırma Staj (NSF IGERT 0333389) tarafından desteklenmektedir.

1. Fluorophores DNA Prob Etiketleme: Nick Çeviri (~ 6 saat) <ol><li> Temizlik BAC DNA (Maxi-prep göre hazırlanmış) ve plazmit veya PCR ürünleri, H2O içinde tekrar süspanse edilir, tüm etiketleme için de kullanılabilir. Not sağlam bir FISH sinyal için, sondalar, en az 10 kb kapsar gerektiğini. </li><li> RNaz DNA inkübe bir 37 30 dakika ° C (Bütün çözeltiler Tablo 1&#39;de listelenmiştir). </li><li> 16. az 2 saat süreyle nick translation reaksiyon inkübe ° C (Tablo 2 ve 3). Doğrudan etiketleme Alternatif yöntemler (: BALIK Etiket, Invitrogen Örnek) kullanılabilir. </li><li> -80 Az bir saat süreyle reaksiyon inaktive -20 ° C&#39;de ° C ya da gece boyunca </li><li> % 2&#39;lik agaroz jel üzerinde prob boyutu belirleyin. Smear yaklaşık 300-500 bp (Cy5-probların smear görünmez olduğunu unutmayın) de çoğunluğu ile, 100 ve 1000 bp arasında olmalıdır. DNA yeteri kadar sindirilmeyen, daha fazla DNA Pol I veDNaz I reaksiyona eklenmiş, ve 16 ° C de iki saat daha inkübe edilebilir </li><li> Karanlıkta iki saat için H 2 0 dolu iki litrelik bardak 0.025 mm filtrelerde probları arındırın. </li><li> Aşağıdaki gibi probları ile bloke etme faktörleri ekleyin: Manşon-1 DNA&#39;sının 10 ug, Hybloc DNA ve 10 ug DNA probları 10 ug için somon sperm 100 ug. -20 ° C&#39;de saklayın DNA probları </li></ol> 2. Prob Yağış / Denatürasyon / Ön tavlama (3-4 saat) <ol><li> 0.3 ug ve DNA probu 1 mg arasında lamel başına kullanılır. 3M NAAC (pH 5.2) ve% 100 etanol, 2.5 hacim, 0.1 hacim ile karıştırın sondalar, -80 az bir saat süreyle inkübe ° C ya da gece boyunca -20 ° C&#39;de ve 4 13,000 rpm&#39;de aşağı dönüş ° C&#39;de 30 dakika süre ile. DNA probu miktarı DNA kalitesi ve hibridizasyon nükleer bölgesine bağlı olarak ayarlanabilir dikkat ediniz. Doğrudan etiketleme Alternatif yöntemler azaltılmış miktarda kullanımına izin verebilirprob. Bir slayt üzerinde birden fazla DNA FISH sinyal tespiti için, farklı prob (tekrar dizileri gibi, ön-tavlanmış olmamalıdır problar hariç) birlikte çökeltilebilir. Aynı zamanda yapılmış olan deneyler için sondalar da bir arada çökeltilebilir. Granüller hafifçe (problar küçük miktarlarda çöktürülür ise, topak görünür olmayan) ikinci floroforlar göre renkli olmalıdır. </li><li> Kuru granül ve 37-45 karanlıkta (Eppendorf bir termomikser kullanılarak) sallama ile lamel başı (bkz. Tablo 4) 15 ul hibridizasyon tamponu içinde tekrar süspansiyon onları ° C (yaklaşık 20 dakika için). </li><li> 75-95 az 5 dakika boyunca denatüre probları ° C. </li><li> 30-60 dakika boyunca 37 ° C de problar Ön tavlama. Ön tavlama uzunluğu probların karmaşıklığı ve kalitesine bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> Gecede hibridizasyon için lamelleri (bakınız Bölüm 3) için sondalar uygulayın. </li></ol> 3. 3Boyutlu DNA FISH - İlk Gün (~ 3 saat) <ol><li> Sigara yapışık hücrelere 1x PBS (lamel başına 5-10 ul 1x PBS ~ 2x10 5 hücre) küçük bir hacimde yoğunlaşmış ve bir poli-L-lisin kaplı lamel ortasına düştü. Bağlanan hücreler, en az 24 saat (~% 70 kesişme noktası) (lamelleri% 0.1 jelatin ile kaplanmış olabilir) lamelleri üzerinde kültive edilmesi gerekmektedir. 18x18 kare için 24-24 mm lamelleri 6 oyuklu plakalar yerleştirilir, ve protokol boyunca, her bir çözelti, iki ml (alternatif olarak yuvarlak 1.5 mm lamelleri 12/24-well plakalar içinde konulabilir) çukur başına kullanılır. </li><li> RT (% 4 PFA stok -20 ° C&#39;de saklanır bölünüp edilebilir) 10 dakika boyunca,% 2 paraformaldehid / 1 x PBS, pH değeri 7-7.4 de hücre düzeltildi. Paraformaldehit (% 16) çözelti halinde satın alınabilir, veya% 4 stok çözeltileri, toz / zerreciklerinin dan hazırlanabilir. Paraformaldehyde toz&gt; 60 ° buz üzerinde C (pH çözülme kolaylaştırmak için 8-9 yükseltilebilir), soğutmalı aşağı ayarlamak az 1x PBS içinde çözülüred pH 7-7.4 için, süzüldü, şahin içinde bölünüp ve -20 ° C de hafta için saklanır </li><li> 1 x PBS içinde üç kez durulama sonra, buz üzerinde 5 dakika boyunca buzlu-soğuk% 0.4 Triton-X-100/1 x PBS içinde hücreler geçirgenliği. Geçirgenliği uzunluğu hücre tipine bağlı olarak ayarlanabilir Not:. DNA FISH immunofloresan ile birlikte ise, immun (bakınız Bölüm 4) bu aşamada yapılmalıdır. </li><li> 37, bir saat boyunca 0.1 mg / 1 x PBS içinde ul RNaz A ° C&#39;de 1x PBS içinde inkübe hücreler üç durulama sonrasında Lameller parafilm ilgili çözüm veya nemli bir odasında bir slayt 100 ul bir damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir. Lameller sonra dikkatlice forseps ile çıkarılır. Herhangi bir direnç karşılaşılırsa, lamelleri hücrelere hasar görmesini önlemek için, 1 x PBS ile su altında olmalıdır. </li><li> 1 x PBS içinde üç kez durulama sonra, buz üzerinde 10 dakika boyunca buzlu-soğuk% 0.7 Triton-X-100 / 0.1 M HCl içinde hücreler geçirgenliği. </li><li> Üç durular sonra in 1 x PBS, oda sıcaklığında 30 dakika için 1.9 M HCl içinde denatüre hücreler. Seçenek olarak ise, hücreler en az 30 dakika süre ile 75-80 ° C sıcaklıkta% 50 formamid / 2 x SSC içinde denatüre edilebilir olabilir. Hibridizasyon uzunluğu (ve sıcaklık) hücre tipine bağlı olarak optimize edilebileceğini not edin. </li><li> Buz 1x PBS içinde üç durular sonra, ° C karanlık ve nemli odasında 37 gecede probları ile hücrelerin melezleşme. Lameller bir slayt üzerinde prob 15 ul damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir ve lastik çimento ile mühürlenir. </li></ol> 4. 3 boyutlu Immuno-BALIK - İlk Gün (~ 6-7 saat) <ol><li> Kombine immünofloresan / DNA balık, immüno-leke% 0.4 Triton-X-100 (Basamak 3.3) içinde geçirgenliği sonra yapılmalıdır. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika (% 2.5 bovin serum albümini (BSA),% 10 normal keçi serumu,% 0.1 Tween-20) için solüsyon engelleme hücreler inkübe edin. Bloke etme çözeltisi, filtre edilmiş 1.5 ml Eppendorfs içinde bölünüp m depolanır-20 ° C&#39;de onths </li><li> Bir nemli oda içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca, protein ya da bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş ilgi histon modifikasyonu karşı yükseltilmiş birincil antikor ile hücreler inkübe edin. Burada H2AX (; ayrıntılar için bakınız Tablo 5 γ-H2AX, Millipore) ve fosforlu serin-139 karşı bir antikor örneğini gösterir. Lameller parafilm ilgili çözüm veya nemli bir odasında bir slayt 100 ul bir damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir. Lameller sonra dikkatlice forseps (1 x PBS, gerekirse su basması) ile çıkarılır. Not seyreltme ve kuluçka süresini antikor ve hücre-tipi kalitesine bağlı olarak ayarlanabilir olabilir. </li><li> % 0.2 BSA /% 0.1 Tween-20/1 x PBS, sallama ile oda sıcaklığında üç kez 5 dak. Yıkayın hücrelerini </li><li> Karanlık ve nemli odasına RT az bir saat için bir çözüm engelleme seyreltilmiş uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor hücreleri inkübe edin. Burada bir algılama ile bir örneğini gösterirİkinci keçi anti-fare antikoru (Alexa Fluor 488 veya 555, Invitrogen; ayrıntılar için Tablo 5&#39;e bakınız). Hapten-konjuge sekonder antikor (biotin, digoxigenin, vb) de kullanılabilir. Bu durumda, uygun algılama (streptavidin, anti-Dig, vs) için ilave bir adım aşırı gece DNA-FISH hibridizasyon önce ya da sonra gerçekleştirilebilir. </li><li> % 0.1 hücreleri yıkayın Tween-20 / 1x PBS, karanlıkta sallayarak RT az üç kere 5 dk. </li><li> Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehid / 1 x PBS içinde post-fix hücreler. </li><li> Yukarıda RNaz A (Adım 3.4) inkübasyon DNA BALIK devam edin. </li></ol> 5. 3 boyutlu DNA FISH / Immuno-BALIK - İkinci Gün (~ 2 saat) <ol><li> Dikkatlice dikkatle forseps ile çıkarın ve yıkama çözeltisi içeren kuyularda koyun, 2x SSC, sel lamelleri kauçuk çimento çıkarın. </li><li> 37 30 dak ° sallayarak karanlıkta C 2x SSC hücreleri yıkayın.</li><li> Sallama ile karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için 2x SSC içinde hücreleri yıkayın. </li><li> Sallama ile karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika süre ile 1 x SSC içinde yıkayın hücrelerini formamid denatürasyon durumunda, yıkama aşağıdaki ile değiştirilmesi gerektiğini not:. 3 yıkamaya 2x SSC, 5,% 50 formamid / 2 x SSC ve 3 yıkar 37, her bir dak ° C. </li><li> Toplam DNA counterstaining için 1.5 ug / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) ihtiva eden Altın montaj orta uzatmak hücreleri monte edin. Lameller bir slayt üzerinde orta montaj 10-15 ul damla üzerine hücre yüzü aşağı yerleştirilir ve oje ile mühürlenir. Slaytlar -20 ° C&#39;de ay tutulur </li></ol> 6. 3D Mikroskopi ve Analiz <ol><li> 3D görüntüler farklı mikroskop sistemleri ile elde edilebilir. Deneylerde, 0,3 mikron ile ayrılmış optik bölümleri bir Leica SP5 AOBS konfokal sistemi (Acousto-Optik Beam Splitter) üzerinde toplanır. Unutmayın optika arasındaki mesafeyil düzlemleri analiz tipine bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> 3D görüntü yığınlarından farklı yazılım ve araçları kullanılarak analiz edilebilir. Biz faiz lokusların arasındaki mesafe ölçümlerini değerlendirmek ve alt nükleer bölmeleri veya proteinler ile ilgi lokusların dernek farklı analiz Image J yazılımı kullanın. </li><li> Farklı hücre tipleri veya aşamaları arasında karşılaştırma, farklı ilgi lokusları arasında karşılaştırılması: Tüm istatistiksel analizler anlamlılık pairwise değerlendirmesi (ler) ile (veya daha fazla) farklı biyolojik koşulların ikisini karşılaştırmak için yapılmaktadır. Tüm istatistiksel testlerde, P değerleri ≤ 5.00E-2 (a = 0.05) (1.00E-2 olarak anlamlı alınır ≤ p ≤ 5.00E-2 * anlamlı; 1.00E-3 ≤ p ≤ 1.00E-2 * * çok önemli; P &lt;1.00E-3 *** çok önemli). </li></ol> Iki allel arasındaki mesafeleri tüm dağılımlarının istatistiksel analizi. Biz ilk cBiz nonparametrik iki örnekli Kolmogorov-Smirnov (KS) testi 13,14 kullanabilirsiniz ampirik inter-allelik mesafelerin dağılımları farklılıklar önemini değerlendirmek iki alleles.To arasında ölçülen uzaklıkları tüm aralığında kümülatif dağılım frekans eğrileri onstruct. Optimal bir mesafe kesme kullanarak iki allel yakın ilişki (yani eşleştirme) istatistiksel analizi. İki allel veya lokus arasındaki mesafelerde en sağlam farklılıkların aralığını belirlemek için, biz iki kuyruklu Fisher testi 15 s bir dizi kullanın. Yani, her ölçülen mesafe bir şartla anlamlı iki örnek arasındaki kısa mesafelerde daha fazla temsil edilip biz testi. P-Değerler dağıtımında en az iki alleli yakın ilişki (yani eşleştirme) için bir cut-off olarak kabul edilmelidir mesafeleri aralığını gösterir. Ardından iki kuyruklu Fisher exact t testi kullanılırtanımlanan kesim değeri 15 iki allel eşleştirme önemini değerlendirmek o. Bu çoklu test düzeltmeler yapılmıştır 16 Fisher test toplam sayısı için hesap uygulanır. Alt-nükleer bölmeleri veya proteinler ile ilgi odağı ilişkisi istatistiksel analizi. İki kuyruk Fisher-exact testi farklı bölmeleri veya proteinler 15 ile ilgi odağı dernek önemini analiz etmek için kullanılır.

<ol><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells%3A+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li>
<li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li>
<li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture%3A+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+%28immuno%29-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li>
<li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li>
<li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li>
<li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).</li>
<li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li>
<li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951(1951).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li>
<li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interpretation+of+%CF%872+from+contingency+tables%2C+and+the+calculation+of+P%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li>
<li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%2C+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li>
<li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+accessibility%2C+nuclear+positioning%2C+recombination%2C+and+transcription+at+the+Igkappa+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li>
<li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li>
<li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3%27+Igk+enhancer+induces+%27decontraction%27+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li>
<li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li>
<li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568(2008).</li>
<li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li>
<li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li>
<li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+%27decontraction%27+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li>
<li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yukarıda ayrıntılı teknikler lenfositler 30,31 geliştirme İmmunoglobulin ve Tcra / d loci V (D) J rekombinasyon düzenleme analiz etmek için, laboratuar kullanılmıştır. Biz bu tekniği farklı hücre tiplerinde çeşitli nükleer proteinler, nükleer bölmeleri ve lokus tespiti için adapte edilebilir eminiz. Protokol değişiklikler gerekli olabilir, ve bu durumda, odaklanmak için önemli adımlar aşağıdaki gibidir. İlk olarak, geçirgenliği uzunluğu hücre tipine bağlı olarak ayarlanabilir. Primer antikor...

Epigenetik mekanizmalar tetik kuruluş ve gelişim ve hücre tipi özel transkripsiyonel profilleri kalıtım. Bir düzeyde bu aktif veya sessiz genomik bölgelerde tanımlar kromatin paketlenmesi modülasyonu içerir. Daha büyük ölçekte, genom ve nükleer mimarisinin küresel 3D organizasyonu da transkripsiyonel desen kontrolünde bir rol oynamaktadır. Böylece, bu epigenomic özelliklerin diseksiyonu genler 6-11 düzenlenir nasıl tam bir anlayış için önemlidir. Kombine immünofloresan ve 3D DNA FISH spesifik etkileşimler / çekirdeğin içinde DNA dizileri ve / veya protein dernekler değerlendirerek, biyokimyasal ve moleküler analizler tamamlamak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Bunun yanında, bu tür kromatin immünopresipitasyon (ChIP-seq) veya derin dizileme ile birleştiğinde kromozom yakalama konformasyon olarak genom yüksek verimlilik teknikleri (4C-seq, 5C, Hi-C) küresel dat sağlamakhücre popülasyonlarının 12 üzerinde, immünofloresan / DNA FISH teknikleri tek hücre düzeyinde analiz sağlar. Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar. Bu protokolün avantaj DNA ve protein yapılarının korunması kombine görselleştirme olduğunu. Bu alanda tecrübemiz mevcut protokoller geliştirmek ve kolaylaştırmak için bize sağladı. Bu rekombinasyon geçiren lenfosit çift-sarmallı DNA mola tespit etmek için bu protokol kullanılmıştır, ancak bu yöntem, diğer proteinlere ve diğer hücre türleri uygulanabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> H2O </td><td> Balıkçı </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 veya Cy5, dUTP </td><td> Balıkçı </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025 mikron filtre </td><td> MilliporE </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Manşon-1 DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 mg / ml </td><td> Uygulamalı Genetik </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Somon sperm </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> toz H2O içinde 10 mg / ml &#39;de tekrar süspanse edilmesi </td></tr><tr><td> NAAC (Sodyum Asetat, pH 5.2, tampon çözeltisi) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol grade) </td><td> Balıkçı </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polivinilpirolidon (Mol Biol grade) </td><td> Balıkçı </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Dekstran sülfat tozu </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (Tuzlu-Sodyum Fosfat-EDTA) 20x çözümü </td&gt; <td> Balıkçı </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Balıkçı </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Balıkçı </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Slaytlar </td><td> Balıkçı </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well plate </td><td> Balıkçı </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS, </td><td> Balıkçı </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisin çözelti </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, zerreciklerinin,% 95 </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol dereceli </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) Fraksiyon V </td><td> Balıkçı </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Normal keçi serumu </td><td> Vektör Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol dereceli </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (Salin Sodyum Sitrat) 20x çözümü </td><td> Balıkçı </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Altın antifade reaktifi uzatmak </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> En testi tek kat kauçuk çimento </td><td> Sanat veya ofis malzemeleri mağazaları </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Özgül reaktifleri ve küçük ekipman. </td></tr></tbody></table>

3d nükleer teşkilatında değişiklikler eğitim için 3d-korunmuş tane Çekirdekle ilgili kombine İmmünofloresan ve dna fish

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

3D konfokal mikroskopi ardından 3 boyutlu korunmuş çekirdekleri üzerinde DNA problar kullanılarak floresan in situ hibridizasyon (3D DNA FISH) bireysel hücrelerin alt bölgeler kromozomal gen lokuslarının yeri veya tüm ülkelerle görselleştirmek için en doğru yolu gösterir. Bu tip analiz çekirdeğin küresel mimari gibi nükleer boşluk içinde belirli lokus ve genomik bölgenin davranışının fikir verir. Immunofluorescence, diğer taraftan, nükleer proteinlerin tespiti (modifiye edilmiş histon, histon türevleri ve değiştiriciler, transkripsiyon faktörleri ve makine, nükleer alt-bölme, vb) izin verir. Immünofloresan ve 3B DNA FISH birleştirme içinde önemli bir sorun çekirdeğin 3D mimarisi yanı sıra antikor tarafından tespit edilen epitopu korumak için bir taraftan, ve diğer taraftan, DNA prob nüfuz tespit etmesi için gen lokus veya kromozom bölgeleri 1-5. Burada 3D korunmuş çekirdeklerinde genomik lokus ile kromatin modifikasyonları görselleştirme birleştiren bir protokol sağlar.

DNA ve immüno-FISH B ve T lenfosit gelişimi sırasında antijen reseptörünün bir lokus, V (D) J rekombinasyon işlemi ile bağlantılı olarak nükleer organizasyon değişiklikleri çalışması için Skok laboratuvar kullanılmaktadır. Yukarıda ayrıntılı teknikleri) bize i odağının iki ucu (kasılma) arasında) mesafeleri ölçmek için ii) allel veya lokus (eşleştirme) arasındaki mesafeleri ölçmek, iii), lokus içindeki iv meydana DNA hasarı analiz etkinleştirmek allellerin yerini değerlendirmek ve alt bölümlerinde (bizim çalışmamızda ba...

Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Bu prosedürün genel amacı, kromatin modifikasyonlarını ve DNA dizilerini 3D konfokal mikroskopi kullanarak aynı anda tespit etmektir, önce spesifik DNA probları oluşturulur. Bu arada, deney hücreleri sabit geçirgen ve immün boyalıdır. İlgilenilen histon belirteçleri için.Hücreler daha sonra denatüre edilir ve içinizde bir gece boyunca floresan olur. Hibridizasyon veya balık, bir veya daha fazla DNA probu kullanılarak gerçekleştirilir. Son olarak, hücreler yıkanır ve 3D floresan için monte edilir.Elde edilen görüntülerin mikroskopi analizi, ilgilenilen lokusların nükleer lokalizasyonunu ve belirli his taş modifikasyonları ile ilişkiyi ortaya koymaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, taşlar da dahil olmak üzere nükleer proteinin görselleştirilmesini 3D koruma çekirdeklerinde genomik lokuslarla birleştirmesi ve kromatin epigenetik nükleer organizasyonu veya gen regülasyonu alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilmesidir. Bu prosedür için, etiketleme için ya geri plazmitler ya da PCR ürünleri kullanılabilir.Bunlar ekteki metinde anlatıldığı gibi hazırlanmalıdır. Sağlam bir balık sinyali için probların en az 10 kilobaz çifti harcaması gerektiğini unutmayın. Bu prosedüre, bir mikrogram DNA ve 0.17 mikrogram RNA A'yı bir mikro santrifüj tüpünde birleştirerek başlayın.37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, RNA'lar A'yı buz üzerinde kısaca etkisiz hale getirin ve uygun miktarda Nick translasyonu ekleyin. Reaksiyonu etkisiz hale getirmek için soğutulmuş bir su banyosunda veya soğuk bir blokta 16 santigrat derecede iki saat inkübe edin.Tüpleri bir saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye veya gece boyunca eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin. Ardından,% 2'lik bir agros jel üzerindeki prob boyutunu belirleyin. Yayma 101.000 baz çifti arasında olmalı ve çoğunluğu yaklaşık 300 ila 500 baz çifti arasında olmalıdır.Bilim kurgu sondalarının lekesinin görünmediğini unutmayın. Boyut belirlendikten sonra, probları 0.02'de diyaliz ile saflaştırın. Su ile doldurulmuş iki litrelik beherlerde beş milimetre filtreler.Her bir yüzer filtrenin ortasına 200 mikrogram probu nazikçe pipetleyin, ardından karanlıkta iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, probu filtrelerden yeni bir mikro santrifüj tüpüne nazikçe aktarmak için bir pipet kullanın. Ardından, problara aşağıdaki gibi engelleme faktörleri ekleyin.Bir mikrogram CO 1D NA. Bir mikrogram DNA probu ve bir mikrogram DNA probu için 10 mikrogram somon spermi ve karışımı, DNA problarını eksi 20 santigrat derecede saklar. Balık prosedürünün yapıldığı gün, problar çökeltilir ve kullanıma hazırlanır. Videonun bu bölümünde açıklanan adımların, aşağıdaki bölümde yer alan adımlarla paralel olarak gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.Probları çökeltmek için onları takip edin ve bunları pH 5.2'de 0.1 hacim üç molar sodyum asetat ve negatif 80 santigrat derecede bir saat boyunca 2.5 hacim %100 Etanol ile birleştirin. İnkübasyondan sonra, probları 30 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez G'de döndürün. Döndürmenin ardından, süpernatanı atın ve peletleri karanlıkta havayla kurutun.Probların miktarına ve rengine bağlı olarak, pelet görünebilir veya görünmeyebilir. Resus, peleti test koşulu başına 15 mikrolitre hibridizasyon tamponunda askıya alır ve karanlıkta 37 ila 45 santigrat derecede yaklaşık 20 dakika boyunca bir einor termo karıştırıcı kullanarak çalkalayın. Denatüre etmek için, problar onları 75 ila 95 santigrat derecede beş dakika inkübe eder.Daha sonra probları ön plana çıkarmak için, termo karıştırıcı üzerinde 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun hemen ardından, problar, videonun bir sonraki bölümünde açıklandığı gibi kapak fişleri üzerindeki hücrelere uygulanacaktır. Aşağıdaki adımlar için, inkübasyon sürelerinin, kullanılan antikorlar ve hücreler için gerektiği şekilde değiştirilmesi gerektiğini unutmayın.Videonun bu bölümünde açıklanan adımlar, ekteki metinde açıklandığı gibi önceki bölümdeki adımlarla paralel olarak gerçekleştirilmelidir. Yapışmayan hücreleri, altı kuyucuklu plakaların kuyucuklarına poli lizin kaplı kapak kızaklarının üzerine bırakın ve beş dakika boyunca yapışmalarına izin verin. Daha sonra, inkübasyonu takiben oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS inkübe etmek için iki mililitre% 2 paraform aldehit ekleyin.Her bir kuyuyu PB S3 ile durulayın, ardından hücrelere nüfuz etmek için iki mililitre buz gibi, PBS'de% 0.4 Triton X 100 ekleyin ve buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Geçirgen çözeltiyi aspire ettikten sonra, DNA balığı immünofloresan ile birleştirilecekse, aşağıdakileri yapın. İlk olarak, 100 mikrolitre blokaj solüsyonunu nemlendirilmiş bir odada param üzerine pipetleyin.Kapak kayma hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde blokaj çözeltisinin üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, aktarın. Kapak, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikorun 100 mikrolitrelik damlalarına kayar.Burada kullanılan antikor, fosforile Suriye 1: 39, H, iki A x veya gama, H, iki A x'i tanır. Slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kapak fişlerini dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.Kapak fişlerini almak zorsa, PBS ile doldurun ve tekrar deneyin. Her slaydı altılı bir kuyuya aktarın. PBS'de iki mililitre% 0.2 BSA% 0.1 ara 20 içeren kuyu plakası, kapak fişlerini bu çözelti içinde oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez çalkalayarak yıkayın, daha sonra hücreleri, oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş uygun florofor konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.İnkübasyondan sonra olduğu gibi, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika boyunca PB S3'te %0.1 ara 20 oranında durulayın, karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de iki mililitre %2 para formaldehit içine daldırın. Hücreler lekelendikten sonra veya lekelenmemişlerse, kapak fişlerini PBS'de üç kez durulayarak DNA balığına devam edin. Ardından, kapak kaymalarını hücre tarafı aşağı bakacak şekilde mililitre başına 0.1 miligramlık 100 mikrolitrelik bir damla üzerine yerleştirin.Nemlendirilmiş bir odada param üzerindeki RNA'lar ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, kapak kaymalarını PBS'de üç kez durulayın, ardından karanlıkta buz üzerinde 10 dakika boyunca 0.1 molar hidroklorik asit içinde% 0.7 Trix 100'de hücrelere nüfuz edin. PBS'de üç durulamadan sonra, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1.9 molar hidroklorik asit içinde denatüre edin ve hücreleri problarla hibritlemek için buz gibi soğuk PBS'de üç kez daha yıkayın.Kapak kaymalarını hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, bu videonun önceki bölümünde bir mikroskop lamı üzerinde hazırlanan 15 mikrolitrelik bir prob damlası üzerine yerleştirin, slaytı kauçuk çimento ile kapatın ve gece boyunca 37 santigrat derecede karanlık bir nemlendirilmiş odada inkübe edin. Ertesi gün, kauçuk çimentoyu slaytlardan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra kapak fişlerini iki Act SSC ile gribe edin ve kapak fişlerini hücrelerle dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.Sonra bunları yıkama çözeltisi içeren kuyulara yerleştirin. Daha sonra, karanlıkta çalkalayarak aşağıdaki yıkamaları gerçekleştirin: 37 santigrat derecede iki XSSC, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca iki XSSC ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir XSSC slaytları monte etmek için, kapak fişlerini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, oje ile mililitre başına 1,5 miligram DPI conta içeren 10 ila 15 mikrolitrelik uzun süreli altın montaj ortamı üzerine yerleştirin. Slaytlar aylarca eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.Slaytlar hazır olduğunda, 0.3 mikron ile ayrılmış optik bölümlere sahip 3D görüntüleri toplayın ve antijen reseptör lokuslarının iki alelinin ilişkisindeki değişikliklerin VDJ rekombinasyon sürecinin düzenlenmesi ile bağlantılı olup olmadığını belirlemek için ekteki belgede açıklandığı gibi analiz edin lenfosit gelişimi sırasında, rekombinaz proteininde eksik olan vahşi tip ve mutant hücreler, bir DNA kullanarak ilgilenilen bir lokusu incelemek için kullanıldı Genomik bölgeyi kapsayan yaklaşık 200 kilobaz çiftini kapsayan bir sırttan üretilen balık probu. Aleller arasındaki mesafeler, 3D görüntü yığınları, kesikli daireler, anahat çekirdek şekillerindeki her bir geri sinyalin kütle merkezi arasında ölçüldü. Gösterilen ölçek çubukları bir mikrondur, kümülatif frekans dağılım eğrileri daha sonra vahşi tip ve mutant hücrelerde ölçülen iki alel arasındaki tüm mesafe aralığını göstermek için oluşturulmuştur.Daha sonra iki dağılım arasındaki farkların anlamlılığını değerlendirmek için parametrik olmayan iki örneklem KS testi kullanıldı. Alelikler arası mesafelerdeki en sağlam farkların aralığı, mavi noktalarla gösterilen bir dizi iki kuyruk balıkçısı kesin testi kullanılarak değerlendirildi. Daha yüksek noktalarla gösterilen en sağlam P değerleri, bir mikron civarındaki mesafeler için bulundu.Böylece, iki alelin yakın birleşmesi veya eşleşmesi için kesme noktası bir mikronda ayarlandı. Burada gösterilen kümülatif frekans eğrileri, iki farklı biyolojik koşulda iki alelin sıfırdan 1.5 mikrona kadar yakın ilişkisi için mesafe aralığını gösterir. İki alelin eşleşmesinin önemi, bir mikronda bir kesme için iki kuyruk balıkçısı kesin testi kullanılarak değerlendirildi.Bu grafik, mutant durumda, iki alelin vahşi tipte olduğu gibi yüksek frekansla ilişkili olmadığını göstermektedir. Böylece, eksik protein bezi bir inik eşleşme ile ilgilidir. Bu videoyu izledikten sonra, immünofloresan ve DNA balıklarının nasıl birleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.Bu teknik, nükleer mimarideki küresel değişiklikler, nükleer alan içindeki belirli genomik lokusların ve bölgelerin davranışı ve bu bölgelerdeki belirli nükleer proteinlerin ilişkisi hakkında bilgi vererek araştırmacıların yolunu açtı. Ve bu prosedürü takiben farklı hastalıkların altında yatan mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olur. Hücre popülasyonları hakkında küresel veri sağlamak için kromatin, immünoçökeltme veya çip arama veya kromozom yakalama onayı gibi genom çapında buz verim teknikleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Bu makale, tek hücreli FISH, blastomer çekirdeklerinin yayılmasını teknikleri, in situ hibridizasyon ve klinik bir ortamda pre-implantasyon genetik tanı (PGD) uygulanan sinyal puanlama için uygun probların seçim açıklamaktadır.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Bu videoda, ışınlanmış hücre çekirdeğindeki çift sarmallı DNA kırılma bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'in lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan yöntemini açıklıyoruz.

DNA Onarım Protein Etkileşimlerinin İmmünofloresan Tabanlı Görselleştirilmesi

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

3D çok renkli DNA FISH, 3B korunmuş çekirdekler içinde birden fazla genomik loci görselleştirmek için bir araç temsil eder, kesin olarak tek bir hücre düzeyinde nükleer alan içinde karşılıklı etkileşimleri ve lokalizasyon tanımlayan. Burada, adım protokol bir adım insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için açıklanmıştır.

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Öğrenin, immünofloresan ve DNA FISH tekniklerini birleştirerek 3D korunmuş çekirdeklerde kromatin modifikasyonlarını ve DNA dizilerini eş zamanlı tespit etmeyi. Bu yöntem hücre biyolojisi ve genetik araştırmalarında nükleer organizasyonu incelemek için güçlü bir araç sunar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Daha fazla video keşfet