3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Bu prosedürün genel amacı, kromatin modifikasyonlarını ve DNA dizilerini 3D konfokal mikroskopi kullanarak aynı anda tespit etmektir, önce spesifik DNA probları oluşturulur. Bu arada, deney hücreleri sabit geçirgen ve immün boyalıdır. İlgilenilen histon belirteçleri için.

Hücreler daha sonra denatüre edilir ve içinizde bir gece boyunca floresan olur. Hibridizasyon veya balık, bir veya daha fazla DNA probu kullanılarak gerçekleştirilir. Son olarak, hücreler yıkanır ve 3D floresan için monte edilir.

Elde edilen görüntülerin mikroskopi analizi, ilgilenilen lokusların nükleer lokalizasyonunu ve belirli his taş modifikasyonları ile ilişkiyi ortaya koymaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, taşlar da dahil olmak üzere nükleer proteinin görselleştirilmesini 3D koruma çekirdeklerinde genomik lokuslarla birleştirmesi ve kromatin epigenetik nükleer organizasyonu veya gen regülasyonu alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilmesidir. Bu prosedür için, etiketleme için ya geri plazmitler ya da PCR ürünleri kullanılabilir.

Bunlar ekteki metinde anlatıldığı gibi hazırlanmalıdır. Sağlam bir balık sinyali için probların en az 10 kilobaz çifti harcaması gerektiğini unutmayın. Bu prosedüre, bir mikrogram DNA ve 0.17 mikrogram RNA A'yı bir mikro santrifüj tüpünde birleştirerek başlayın.

37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, RNA'lar A'yı buz üzerinde kısaca etkisiz hale getirin ve uygun miktarda Nick translasyonu ekleyin. Reaksiyonu etkisiz hale getirmek için soğutulmuş bir su banyosunda veya soğuk bir blokta 16 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

Tüpleri bir saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye veya gece boyunca eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin. Ardından,% 2'lik bir agros jel üzerindeki prob boyutunu belirleyin. Yayma 101.000 baz çifti arasında olmalı ve çoğunluğu yaklaşık 300 ila 500 baz çifti arasında olmalıdır.

Bilim kurgu sondalarının lekesinin görünmediğini unutmayın. Boyut belirlendikten sonra, probları 0.02'de diyaliz ile saflaştırın. Su ile doldurulmuş iki litrelik beherlerde beş milimetre filtreler.

Her bir yüzer filtrenin ortasına 200 mikrogram probu nazikçe pipetleyin, ardından karanlıkta iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, probu filtrelerden yeni bir mikro santrifüj tüpüne nazikçe aktarmak için bir pipet kullanın. Ardından, problara aşağıdaki gibi engelleme faktörleri ekleyin.

Bir mikrogram CO 1D NA. Bir mikrogram DNA probu ve bir mikrogram DNA probu için 10 mikrogram somon spermi ve karışımı, DNA problarını eksi 20 santigrat derecede saklar. Balık prosedürünün yapıldığı gün, problar çökeltilir ve kullanıma hazırlanır. Videonun bu bölümünde açıklanan adımların, aşağıdaki bölümde yer alan adımlarla paralel olarak gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

Probları çökeltmek için onları takip edin ve bunları pH 5.2'de 0.1 hacim üç molar sodyum asetat ve negatif 80 santigrat derecede bir saat boyunca 2.5 hacim %100 Etanol ile birleştirin. İnkübasyondan sonra, probları 30 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez G'de döndürün. Döndürmenin ardından, süpernatanı atın ve peletleri karanlıkta havayla kurutun.

Probların miktarına ve rengine bağlı olarak, pelet görünebilir veya görünmeyebilir. Resus, peleti test koşulu başına 15 mikrolitre hibridizasyon tamponunda askıya alır ve karanlıkta 37 ila 45 santigrat derecede yaklaşık 20 dakika boyunca bir einor termo karıştırıcı kullanarak çalkalayın. Denatüre etmek için, problar onları 75 ila 95 santigrat derecede beş dakika inkübe eder.

Daha sonra probları ön plana çıkarmak için, termo karıştırıcı üzerinde 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun hemen ardından, problar, videonun bir sonraki bölümünde açıklandığı gibi kapak fişleri üzerindeki hücrelere uygulanacaktır. Aşağıdaki adımlar için, inkübasyon sürelerinin, kullanılan antikorlar ve hücreler için gerektiği şekilde değiştirilmesi gerektiğini unutmayın.

Videonun bu bölümünde açıklanan adımlar, ekteki metinde açıklandığı gibi önceki bölümdeki adımlarla paralel olarak gerçekleştirilmelidir. Yapışmayan hücreleri, altı kuyucuklu plakaların kuyucuklarına poli lizin kaplı kapak kızaklarının üzerine bırakın ve beş dakika boyunca yapışmalarına izin verin. Daha sonra, inkübasyonu takiben oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS inkübe etmek için iki mililitre% 2 paraform aldehit ekleyin.

Her bir kuyuyu PB S3 ile durulayın, ardından hücrelere nüfuz etmek için iki mililitre buz gibi, PBS'de% 0.4 Triton X 100 ekleyin ve buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Geçirgen çözeltiyi aspire ettikten sonra, DNA balığı immünofloresan ile birleştirilecekse, aşağıdakileri yapın. İlk olarak, 100 mikrolitre blokaj solüsyonunu nemlendirilmiş bir odada param üzerine pipetleyin.

Kapak kayma hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde blokaj çözeltisinin üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, aktarın. Kapak, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikorun 100 mikrolitrelik damlalarına kayar.

Burada kullanılan antikor, fosforile Suriye 1: 39, H, iki A x veya gama, H, iki A x'i tanır. Slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kapak fişlerini dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.

Kapak fişlerini almak zorsa, PBS ile doldurun ve tekrar deneyin. Her slaydı altılı bir kuyuya aktarın. PBS'de iki mililitre% 0.2 BSA% 0.1 ara 20 içeren kuyu plakası, kapak fişlerini bu çözelti içinde oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez çalkalayarak yıkayın, daha sonra hücreleri, oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş uygun florofor konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.

İnkübasyondan sonra olduğu gibi, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika boyunca PB S3'te %0.1 ara 20 oranında durulayın, karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de iki mililitre %2 para formaldehit içine daldırın. Hücreler lekelendikten sonra veya lekelenmemişlerse, kapak fişlerini PBS'de üç kez durulayarak DNA balığına devam edin. Ardından, kapak kaymalarını hücre tarafı aşağı bakacak şekilde mililitre başına 0.1 miligramlık 100 mikrolitrelik bir damla üzerine yerleştirin.

Nemlendirilmiş bir odada param üzerindeki RNA'lar ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, kapak kaymalarını PBS'de üç kez durulayın, ardından karanlıkta buz üzerinde 10 dakika boyunca 0.1 molar hidroklorik asit içinde% 0.7 Trix 100'de hücrelere nüfuz edin. PBS'de üç durulamadan sonra, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1.9 molar hidroklorik asit içinde denatüre edin ve hücreleri problarla hibritlemek için buz gibi soğuk PBS'de üç kez daha yıkayın.

Kapak kaymalarını hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, bu videonun önceki bölümünde bir mikroskop lamı üzerinde hazırlanan 15 mikrolitrelik bir prob damlası üzerine yerleştirin, slaytı kauçuk çimento ile kapatın ve gece boyunca 37 santigrat derecede karanlık bir nemlendirilmiş odada inkübe edin. Ertesi gün, kauçuk çimentoyu slaytlardan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra kapak fişlerini iki Act SSC ile gribe edin ve kapak fişlerini hücrelerle dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.

Sonra bunları yıkama çözeltisi içeren kuyulara yerleştirin. Daha sonra, karanlıkta çalkalayarak aşağıdaki yıkamaları gerçekleştirin: 37 santigrat derecede iki XSSC, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca iki XSSC ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir XSSC slaytları monte etmek için, kapak fişlerini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, oje ile mililitre başına 1,5 miligram DPI conta içeren 10 ila 15 mikrolitrelik uzun süreli altın montaj ortamı üzerine yerleştirin. Slaytlar aylarca eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Slaytlar hazır olduğunda, 0.3 mikron ile ayrılmış optik bölümlere sahip 3D görüntüleri toplayın ve antijen reseptör lokuslarının iki alelinin ilişkisindeki değişikliklerin VDJ rekombinasyon sürecinin düzenlenmesi ile bağlantılı olup olmadığını belirlemek için ekteki belgede açıklandığı gibi analiz edin lenfosit gelişimi sırasında, rekombinaz proteininde eksik olan vahşi tip ve mutant hücreler, bir DNA kullanarak ilgilenilen bir lokusu incelemek için kullanıldı Genomik bölgeyi kapsayan yaklaşık 200 kilobaz çiftini kapsayan bir sırttan üretilen balık probu. Aleller arasındaki mesafeler, 3D görüntü yığınları, kesikli daireler, anahat çekirdek şekillerindeki her bir geri sinyalin kütle merkezi arasında ölçüldü. Gösterilen ölçek çubukları bir mikrondur, kümülatif frekans dağılım eğrileri daha sonra vahşi tip ve mutant hücrelerde ölçülen iki alel arasındaki tüm mesafe aralığını göstermek için oluşturulmuştur.

Daha sonra iki dağılım arasındaki farkların anlamlılığını değerlendirmek için parametrik olmayan iki örneklem KS testi kullanıldı. Alelikler arası mesafelerdeki en sağlam farkların aralığı, mavi noktalarla gösterilen bir dizi iki kuyruk balıkçısı kesin testi kullanılarak değerlendirildi. Daha yüksek noktalarla gösterilen en sağlam P değerleri, bir mikron civarındaki mesafeler için bulundu.

Böylece, iki alelin yakın birleşmesi veya eşleşmesi için kesme noktası bir mikronda ayarlandı. Burada gösterilen kümülatif frekans eğrileri, iki farklı biyolojik koşulda iki alelin sıfırdan 1.5 mikrona kadar yakın ilişkisi için mesafe aralığını gösterir. İki alelin eşleşmesinin önemi, bir mikronda bir kesme için iki kuyruk balıkçısı kesin testi kullanılarak değerlendirildi.

Bu grafik, mutant durumda, iki alelin vahşi tipte olduğu gibi yüksek frekansla ilişkili olmadığını göstermektedir. Böylece, eksik protein bezi bir inik eşleşme ile ilgilidir. Bu videoyu izledikten sonra, immünofloresan ve DNA balıklarının nasıl birleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik, nükleer mimarideki küresel değişiklikler, nükleer alan içindeki belirli genomik lokusların ve bölgelerin davranışı ve bu bölgelerdeki belirli nükleer proteinlerin ilişkisi hakkında bilgi vererek araştırmacıların yolunu açtı. Ve bu prosedürü takiben farklı hastalıkların altında yatan mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olur. Hücre popülasyonları hakkında küresel veri sağlamak için kromatin, immünoçökeltme veya çip arama veya kromozom yakalama onayı gibi genom çapında buz verim teknikleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.