Name: Floresans Desenler incelenmesi için Maya Toplulukları Cryosectioning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Keşfedin maya topluluklarında kriyoseksiyon yöntemiyle floresan hücrelerin uzamsal dağılımını incelemeyi. Bu protokol metanol fiksasyonu ve OCT gömme kullanarak hücre düzenini korur ve mikrobiyal etkileşim çalışmaları için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz onların kriyostat kullanma izni için Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi&#39;nde Jonathan Cooper Lab teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH ve WM Keck Vakfı tarafından desteklenmiştir. BM Yaşam Bilim Araştırma Vakfı, Gordon ve Betty Moore akademisyendir. Biz bize yaptığı tespit protokolü paylaşmak için Daniel Gottschling minnettarız.

1. Maya Topluluklar Tespit <ol><li> Bir membran filtreden (; Şekil 2A, örneğin Millipore MF membran filtre) mayaya topluluklar büyütün. Bu protokol, bir 6 mm çapındaki membran filtre üzerinde daha az 2x10 8 hücrelerin, tipik bir topluluk karşılık gelir. </li><li> Iyi bir 1 cm çaplı (Şekil 2B) alt kapak 541 Whatman filtre kağıdı parçası kullanın. Bu whatman kağıt sonraki aşamalarda topluluk aktarmak için bir taşıyıcı olarak kullanılacaktır. De 1 ml% 100 metanol ekleyin ve dengelemek için sıcaklık -20 ° C de bırakın. </li><li> Bir Dewar sıvı N 2 koyun. Sıvı içinde en az 15 saniye boyunca topluluk daldırma N 2 bir cımbız (Şekil 2C) kullanılarak sıvı azot içinde topluluk dondurun. </li><li> -20 ° C metanol (Şekil 2B) ve de dondurulmuş topluluk aktarın. Metanol içinde batış zaman toplumun yatay tutulur emin olun.20 dakika bekleyin. MF Membran filtre metanol içinde parçalanmaya başlar. </li><li> De metanol buharlaşma (Şekil 2E) için -20 ° C&#39;de muhafaza soğuk bir Petri kabı metanol topluluk taşıyıcı kullanılarak Whatman 541 filtre kağıdı aktarın. Aktarırken, taşıyıcı whatman filtrenin üstüne topluluk tutmak ve soğuk Petri kabı koymadan önce kalın whatman kağıt başka bir parça kullanılarak metanol ilave damla uzaklaştıracağım. Bu buharlaşma süresi numuneden numuneye tutarlı olmasını sağlayacaktır. </li><li> Taşıyıcı whatman filtre kuru görünüyor kadar buharlaşma için 4-6 saat bekleyin. Yetersiz buharlaşma kesit engelleyen kalıntı metanol bırakır. Topluluklarda nedenler çatlak ve deformasyon üzerinde kuruyan. </li><li> -20 ° C dondurucu örnek çıkarın. Toplum tarafından kapsanmayan whatman 541 filtre kağıdı kesip. </li><li> Numune en az ~ 2 mm kenar var böyle büyüklükte bir dikdörtgen küp alüminyum folyo konteyner Yapher iki tarafında (Şekil 2F). Alüminyum folyo konteyner alt yüzeyinde topluluk yerleştirin; hemen 3 OCT ile örnek ~ topluluk yüksekliği yukarıda 4 mm kapsamaktadır. Önemli ise, örnek yönünü kabın yanlarına ile ilgili olarak, bu adımda ayarlanabilir. 10 dakika bekleyin. </li><li> Dondurmak için kuru buz üzerinde metal bir plaka üzerinde OCT-gömülü örneği yerleştirin. -20 ° C veya -80 ° C derin dondurucu da donmuş topluluklar saklayın. </li></ol> 2. Floresans Görüntüleme için Dondurulmuş Toplulukları Kesit <ol><li> -25 ° C ila cryosection odasının sıcaklığı ayarlanır ve sıcaklık odasının bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar oda içinde örnekleri bırakın. </li><li> Montaj üzerine OCT bir damla uygulandıktan sonra kriyo-montaj üzerine numune monte edin. Ekim kalınlığı 2-3 mm olacak şekilde maruz Whatman filtre kağıdı (konteynerin alt) ile numune yan tarafında eşit Ekim yayılır. Se önce kriyostat odacıkta Ekim donma edelimctioning. Örneğin her iki tarafta 2-3 mm olan bir OCT kenar bölümleri sağlanması bütünlüğünü korumaya yardımcı olur. </li><li> OCT örnek bloğun iki numune hizalamak için kullanılabilir. Örnek bıçağı ile ilgili olarak hizalı değilse, kesit örnek bir köşesine veya yan başlayacaktır. Bıçak örnek blok bir mükemmel dikey (veya yatay) yüz keser emin olmak için montaj ayarlayın. </li><li> Maya topluluklar için tipik bölümler ~ 14 mikron kalınlığında vardır. Bir bölüm kestikten sonra, yavaş yavaş kesik bölümüne slaydı yaklaşarak, bölüm toplamak için oda sıcaklığında bir mikroskop slaydı kullanır. Bölümü eritmek ve mikroskop lamı transfer olacak. Dakikada 18 bölüm, bir slayttan aktarılabilir. </li><li> Tercihen -20 soğuğa, ° C, görüntüleme önce de slaytlar saklayın. 4 ° C&#39;de bir hafta tutulduğunda sinyal kaybı minimal Maksimum floresans sinyali için, görüntüleme tercihen kesit hemen sonra yapılır. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan prosedür maya toplulukların iç yapısını incelemek için bir yol sunar. Metanol sabitleme adım 8 maya kolonisi sertleştirir ve koloninin bütünlüğünü korur, ancak aynı zamanda sonuçların yorumlanmasında dikkate alınması gerektiğini büzülme 8 neden olur. Biz genellikle, doğrudan 9 düzeltmeden OCT gömülü koloniler göre maya kolonilerinin yüksekliği yaklaşık% 30 daralma, bkz. Çekmeyi önlemek için, cryosectioning için alternatif bir yaklaşım doğrudan ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 100% Metanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek Ekim Bileşik </td><td> Andwin Bilimsel </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Sınıf No 541 Kantitatif Filtre Kağıdı </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF Membran Filtre </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Kriyostat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

floresans desenler incelenmesi için maya toplulukları cryosectioning

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Mikroplar genellikle topluluklar yaşıyor. Bir topluluk içinde hücrelerin mekansal organizasyon topluluğu 1 hayatta kalma ve fonksiyon etkisi olduğuna inanılmaktadır. Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Optik kesit teknikleri, bakteri ve arke topluluklarının 2,3 mekansal organizasyon gözlemlemek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Konfokal görüntüleme ve maya kolonileri fiziksel kesit kombinasyonu hücreleri 4 iç organizasyonu ortaya koymuştur. Ancak, konfokal veya iki foton mikroskopi kullanılarak doğrudan optik kesit maya kolonileri içine derin bir kaç hücre tabakaları ulaşmak için sadece mümkün olmuştur. Bu sınırlama nedeniyle maya hücreleri 4 ışık güçlü saçılma muhtemeldir. Burada, sabitleme ve Saccharomyces cerevisiae topluluklar içinde floresan hücrelerin mekansal dağılımını elde etmek için cryosectioning dayalı bir yöntem sunuyoruz. Biz sabitleştirici ajan olarak metanol kullanımıhücrelerinin mekansal dağılımını korumak. Sabit topluluklar Kriyostaz OCT bileşiği, dondurulmuş ve cryosectioned ile infiltre edilir. Bölümlerin Floresans görüntüleme toplum içinde floresan hücrelerin iç organizasyonunu ortaya koymaktadır. Kırmızı ve yeşil floresan protein eksprese eden maya suşu oluşan toplulukların örnekleri de mantar kolonileri 2.3 içinde gen ekspresyonunun bu gibi floresan hücrelerinin uzaysal dağılımının ortaya çıkarmak için cryosectioning yöntem potansiyellerini göstermek. Bizim odak Saccharomyces cerevisiae topluluklar olmuştur rağmen, aynı yöntem potansiyel olarak diğer mikrobiyal topluluklar incelemek için uygulanabilir.

Kırmızı-yeşil-etiketli rakip popülasyonları 6 içeren bira mayası toplulukların dikey kesit görüntüleri floresans Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bu topluluklar, maya ve uzay gibi paylaşılan kaynaklar, onların rekabet iki Prototrofik suşlarının oluşur olarak düşey kesitleri gösterilir kolumnar desenleri 7, yol açar. Tek bir hücreye Kararları aşağı kesitlerde çözülebilir. Şekil 3 Şekil 1&#39;de protokolleri takip ederek (alt) ve (üst) metanol-sabitleme olmadan elde ç...

Biz floresan hücrelerin iç kalıplarını gözlemlemek maya topluluklar donma ve cryosectioning için bir protokol mevcut. Yöntem metanol-sabitleme dayalıdır ve bir topluluk içinde floresan proteinleri inaktive olmadan hücrelerinin mekansal dağılımını korumak için OCT-katıştırma.

Floresans Desenler incelenmesi için Maya Toplulukları Cryosectioning

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir topluluk içindeki farklı floresan hücre popülasyonlarının mekansal dağılımını incelemek için maya topluluklarının kesitlerini üretmektir. Bu, önce topluluğun dondurulması ve ardından topluluktaki hücrelerin mekansal dağılımını korumak için metanol kullanılarak sabitlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, gömme OCT bileşiğinin nüfuz etmesine izin vermek için metanol buharlaştırılır.Gömülü topluluk daha sonra kriyoseksiyona hazırlık olarak dondurulur. Ardından, bir kriyo bazı bölümler. Topluluk ve kesitler bir floresan mikroskobu altında görüntülenebilir Bir topluluk içindeki floresan hücre popülasyonlarının uzamsal dağılımını gösteren sonuçlar elde edilir.Bu tekniğin optik kesit alma gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu toplulukların derinliklerindeki popülasyonların mekansal dağılımını ortaya çıkarmasıdır. Bu prosedüre başlamak için, bir membran filtrede maya toplulukları büyütün. Bu protokol, eksi 20 santigrat derece dondurucuda altı milimetre çapında bir membran filtredeki sekiz hücrenin iki katından daha az 10'dan daha az tipik bir topluluğa karşılık gelir.Daha fazla floresan derecesini korumak için, bir santimetre çapın altını

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Bu protokol, fotoototrofik şeker salgılayan siyanobakteriler ve heterotrofik mayalar dahil olmak üzere ko-kültürlerin kurulumu ve kantitatif izlenmesi için kapsamlı bir kılavuz sağlar.

Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Keşfedin maya topluluklarında kriyoseksiyon yöntemiyle floresan hücrelerin uzamsal dağılımını incelemeyi. Bu protokol metanol fiksasyonu ve OCT gömme kullanarak hücre düzenini korur ve mikrobiyal etkileşim çalışmaları için uygundur.

Floresans Desenler incelenmesi için Maya Toplulukları Cryosectioning

Daha fazla video keşfet