Name: Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi Plasmodium berghei ANKA-enfekte Fare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Öğrenin, Plasmodium berghei ANKA enfekte farelerden beyin kan damarlarındaki adezyonlu inflamatuar lökositleri izole etme ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon yapma yöntemini. Bu teknik, serebral malarya patogenezindeki immün yanıtı anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar teknik yardım için Bayan Liana Mackiewicz teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme ve Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi IRIISS ve Proje Hibe 1031212 sayesinde mümkün oldu.

1. P. ile Fare enfeksiyonu berghei-ANKA <ol><li> Defrost kriyoprezerve P. bir kısım berghei ANKA pRBC. </li><li> Iki elli emniyet tekniği kullanılarak serebral sıtma dirençli BALB / c donör fare (8-12 hafta-eski) dizginlemek. Bir 1 ml insülin şırınga (28G iğne) kullanarak pRBC 100-200 ul fare enjekte. Rutin olarak, 1-2 verici farelere enjekte edilir. </li><li> Enfeksiyon sonrası 4-5 gün hakkında (pi) kafes donör fare çıkarın ve bir iş istasyonu veya bir tek çalışma yüzeyi üzerine yerleştirin. </li><li> Yavaşça kuyruk sonuna fare dizginlemek ve küçük makas kullanarak (yaklaşık 1 mm) kuyruk ucu kesilir. Alternatif olarak, 25 G iğne kullanılarak küçük bir kuyruk ponksiyon olabilir. </li><li> Bir buzlu uç mikroskop lamı sonuna farenin kuyruk damarından kan bir damla yerleştirin. </li><li> 45 ° açı ile ilgili ikinci bir slayt (yayıcı) yerleştirin ve kan damlasını içine geri. Kan kenarı boyunca yayılır sonra, serpme-slayt arifesinde itinkan yayması yapmak için mikroskop lamı üzerinde nly. Smear kurumaya bırakın. </li><li> 10 dakika için taze hazırlanan Giemsa slaytlar leke sonra 30 sn için% 100 metanol kan smear Fix. </li><li> 1 dakika boyunca su ile çalışan yaymada durulayın, hava-kuru izin ve mikroskop (100x, immersiyon yağı) altında slayt inceleyin. 1000 eritrositler içinde pRBC numaralandırmak ve yüzde parazitemi hesaplayabilirsiniz. Onlar deney hayvanı enfeksiyon için bled önce Donör farelerin 2.5-5% arası parazitemi düzeylerine ulaşmak gerekir. </li><li> Bir heparinize mikro-hematokrit kapiller tüp kullanarak retroorbital kanama ile donör fare kan toplayın. Tüm deneyler Walter &amp; Eliza Hall Institute Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri ile uygun olarak gerçekleştirilir. Yerel Hayvan Etik Kurulu gereksinimlerine bağlı olarak diğer kanama prosedürler kullanılabilir. 1X10 pRBC/0.2 6 ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon RPMI medyumu içinde kan gerekli miktarda eritilir. DüşününNormal bir fare hematokrit ~ 6x10 9 kırmızı kan hücrelerinin / 1 ml &#39;dir. </li><li> Intraperitoneal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml enjekte edilerek deneysel C57BL / 6 fareler (8-12 haftalık) Infect. </li><li> Enfekte farelerde parazitemi düzeylerini izlemek için adımları 1.3-1.8 izleyin. Parazitemi günde 2 ya da 3 pi başlayarak 2-3 gün her bir tespit edilmesi gerekmektedir </li><li> Fareler kambur görünümü olarak tezahür olabilir C57BL içinde / 6 şiddetli sıtma Onset, kürk ve düşük aktiviteli ruffed. Bazı fareler bu aşamada kurtarmak olabilir, ama kendini doğrulma refleksini kaybı ilerleme geri dönüşümsüz hastalık gösterir ve hayvan ötenazi gerekir. </li></ol> 2. Fareler ve Beyin Extraction Intracardial Perfüzyon <ol><li> Bir 60 cm kolon stand üst bağlı bir kolon için bir tutucu 500 ml rezervuar sabitleyerek bir kılavuz ağırlık perfüzyon sistemi birleştirin. Rezervuarın alt ucuna plastik boru bağlayın ve tampon akışını kontrol etmek için bir boru kelepçesi sabitleyin. Bir 23 G iğne hortumu takın. FilPBS (22 ° C&#39;de tutulur) ile rezervuar l, kelepçe ve tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için tüp aracılığıyla çalıştırmak için tampon izin açın. </li><li> Ötenazi P. CO 2 Solunması berghei ANKA-enfekte fare. Pedalı, orbital ve solunum tepkilerin yokluğu ölüm onaylayın. </li><li> Dorsal bir plastik tepsi içinde bulunan bir styrofoam diseksiyon gemide arka ve ön pençeleri tarafından ötenazi fare Pin. Yerel Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri anestezi bağlı intracardial pefusion önceden başlaması idare edilebileceği. </li><li> % 70 etanol ile ventral tarafta silin. </li><li> Göğüs boşluğu göstermek için orta hat boyunca cildi açmak için büyük bir makas ve forseps kullanın. Yanlarına Kıvrım ve pin cilt. </li><li> Ince forseps ile sternumun tutun ve diyafram kesmek ve sternumun her iki yanında kaburga severing. Herhangi bir büyük kan damarlarına zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> Kafasına gevşek yanındaki sternum ile göğüs kafesi Pin. </li><li> Ventriküller zekâ tutunh ince forseps ve ince makas ile dikkatlice kazımak sağ atrium. </li><li> PBS çalışırken asendan aorta doğru sol ventrikül içine yerçekimi perfüzyon sistemine takılı 23G iğne takın. Iğne ucu sadece 0.5 cm yerleştirin. </li><li> 5 dakika için ya da atık kadar fare serpmek açıktır. </li><li> Ayır farenin ve karın üzerinde yatıyordu. % 70 etanol ile kafasını temizleyin. </li><li> Büyük makas kullanarak, sadece servikal spinal kord alanı üzerinde bir kesim yapmak. </li><li> Medyan kaudal-rostral kesim kafatası maruz uzak kafatası tabanında başlayan ve cilt soyma yapmak için ince makas kullanın. </li><li> Başımı tutarak, her yörünge boşluğuna küçük bir makas bıçakları yerleştirin ve yörüngeleri arasında bir kesim yapmak. </li><li> Sutur boyunca uzunlamasına kesilmiş olun ve dikkatlice dışarı doğru her beyin yarımkürede kafatası kabuğu. </li><li> Bir spatula kullanarak, yavaşça beyin kaldırın ve RPMI medyumu içeren 10 ml santrifüj tüpüne yerleştirin. </li></ol>3. Beyin-sekestre Lökosit izolasyonu (BSL) <ol><li> Bir güvenlik kabini içinde çalışarak, yerde taze RPMI doku kültür ortamı 3-5 ml içeren bir Petri kabındaki bir paslanmaz çelik hücre süzgecinden (40-60 mesh boyutu) üstüne beyin hasat. </li><li> Küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin. </li><li> Bir kristal piston kullanarak hücre süzgecinden beyin dokusunun küçük parçalar bastırın. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 250 ° C&#39;de xg&#39;de 10 ml tüp ve santrifüj ile beyin Homojenat, transfer </li><li> % 0.05 collagenase, D ve 2U/ml DNAz I içeren RPMI medyumu, 3 ml içinde çözülür pelet </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için karışım döndürün. Bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden ve / ya da itme karışım 5 dakika süreyle buz üzerinde inkübe ederek hücre artıkları çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika için 400 x g&#39;da (herhangi bir fren) bir 7 ml% 30 Percoll yastık ve santrifüj üzerine beyin Homojenat yerleştirin. </li><li> 5 dakika için buz üzerinde kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile inkübe 1 ml pelet yeniden süspanseintracardial perfüzyon beyin kaldırılır olamazdı yapışık pRBC, lyse. </li><li> RPMI medyumu 9 mL, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 250 x g santrifüj ile hücreler yıkamak </li><li> RPMI medyumu ile bir Eppendorf tüpü transfer hücre 50-100 ul içinde süspanse BSL içeren pelet. </li><li> Yaşayabilir hücrelerin tanımlanması için Tripan mavi hücre örneği bir 5-10 ul alikot 1:02 seyreltin. </li><li> Hemasitometre kullanarak mikroskop altında canlı hücreleri saymak. Günde 6 pi itibaren, P. Gönderen berghei ANKA-enfekte farelerde 20,000-100,000 BSLs telafi edilebilir, nörolojik belirtiler gösterir. </li></ol> 4. Multicolour akış sitometri yöntemi ile BSL immünofeotipleme <ol><li> 4, 10 dakika boyunca 250 ° C&#39;de x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri, (PBS,% 1 dana fetus serumu (FCS), 2 mM EDTA) ile boyanarak 50 ul tampon içinde tekrar süspansiyon topak süpernatantı ve aspire. </li><li> Anti-CD16/32 antikor (Fcblock) saflaştırılmış 1 ul ekle. </li><li> 1 için hücreler inkübeBuz üzerinde 0 dk. </li><li> Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire. </li><li> Gerekli floresan antikor önceden belirlenmiş en uygun seyreltmeler, yani anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR ve anti-NK1.1 ihtiva eden tampon Boyama 50 ul içinde süspanse hücreler. </li><li> Buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire. </li><li> PBS içinde 100 ul hücre içinde yeniden süspanse edin. </li><li> Bir akım sitometri plastik tüp hücreleri aktarın. </li><li> Bir akış sitometresinin kullanarak, en az 5.000-10.000 olaylar kazanmak. Gerektiği gibi uygun boyanmamış hücre kontrolleri ve florokrom tazminat örnekleri dahil edilmelidir. </li><li> Uygun akım sitometri yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

BSL izolasyonu ve karakterize edilmesi ve analiz deneysel fare modellerinde doku hasarı ya da enfeksiyona yanıt olarak beyin göç inflamatuar hücrelerin miktarının sağlayan bir yöntem. Organ ekstraksiyonu ve bunu izleyen hücre izolasyonu önce kan bölmesinin çıkarılması için bir intracardial perfüzyon adım giriş non-inflamatuar dolaşımdaki lökositler ile inflamatuar hücrelerin kirlenmesini önlemek için yararlıdır. Bu inflamatuar hücreler beyin parankimi 5 nüfuz hangi tür kemirgen ensefalomyelit virüs gibi nörot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözümler ve tamponlar </td></tr><tr><td> Giemsa en azur eosin metilen mavisi çözeltisi </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Distile su 1:10 seyreltme </td></tr><tr><td> RPMI medyumu </td><td></td><td></td><td> Fare tonisite </td></tr><tr><td> Fare tonisite PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM sodyum fosfat, 0.149 NaCl, pH 7.3 </td></tr><tr><td> % 0,4 Tripan Mavisi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:02 dilüsyon </td></tr><tr><td> Kollajenaz D </td><td> Biyokimyasal Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Sığır pankreas Gönderen </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> PBS içinde% 30 çözelti </td></tr><tr><td> Ultra Saf Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Amonyum Klorür (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı Hücre Lizis Tampon </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nm NH4CI, pH 7.2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA disodyum tuzu </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M, pH 7.2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikorlar ve konjugatlarının </td></tr><tr><td> Anti-fare CD16/CD32 (Fc Blok), klon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553.142 </td><td> 50 ul boyama tampon içinde 1 ul (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-fare CD4, klon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-fare NK1.1, klon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-fare CD8, klon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-fare anti-TCR-β, klon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-fare CXCR3, klon 220.803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinlenmiş-anti-fare CCR5, klon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman ve malzeme </td></tr><tr><td> SuperFrost mikroskop lamı </td><td> Lomb Menzel-Glaser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps, makas </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS rezervuar </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kauçuk hortum </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G iğne </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre ayrışma kiti metal elek içeren </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikron naylon hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri tüpler </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

den beyin sekestre lökositler İzolasyonu ve analizi<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka-enfekte fare

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Biz P. beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir yöntem tarif berghei ANKA-enfekte fareler. Deneysel serebral sıtma indüksiyon, bir nörolojik sendromu bu parazitin suşu sonuçlar duyarlı fare suşlarının enfeksiyonu insanlarda 1,2 Plasmodium falciparum aracılı şiddetli sıtma özetlediği bazı önemli yönleri olduğunu. Kan aşama sıtma Olgun formlar vasküler endotel hücreleri ile bağlamak sağlar enfekte eritrosit, yüzeyi üzerinde parazit proteinleri ifade eder. Bu süreç hipoksi ve kanamalar 3 sonuçlanan kan akımında engel indükler ve aynı zamanda parazit sekestrasyon sitesine inflamatuvar lökositlerin işe uyarır. Diğer enfeksiyonlar, örneğin neutrotopic virüsler 4-6, sıtma-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC) yanı sıra ilişkili yatkın aksine, hemekspirayon lökositlerin kan damarları içindeki yerine beyin parankimi infiltre daha münzevi kalır. Böylece non-inflamatuar dolaşan hücre, organ çıkarma ve doku işleme öncesi enfekte-farelerin geniş intracardial perfüzyon ile sekestre lökositlerin kirlenmesini önlemek için kan bölmesi çıkarmak için bu prosedürü gereklidir. Perfüzyon sonra, beyinleri hasat edilir ve küçük parçalar halinde disseke. Dokuların yapısı daha da oluşan beyin homojenat sonra miyelin ve diğer doku enkaz beyin sekestre lökositlerin ayrılması (BSL) sağlayan bir Percoll degrade üzerinde santrifüj edilir Kollajenaz D ve DNAz I. ile enzimatik tedavi ile bozulur. İzole hücreler daha sonra yıkanır, flow sitometri ile sonraki analiz için floresan antikorlar ile hemasitometre ve lekeli kullanılarak sayıldı. Bu prosedür inflamatuvar lökositlerin kapsamlı fenotipik karakterizasyonu re beyin göç veriyorinme gibi viral veya paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli uyarılara yanıtı. Yöntemi de klinik öncesi hayvan modellerinde yeni anti-inflamatuvar tedaviler değerlendirilmesi için yararlı bir araç sağlar.

Şekil sonuçlanır. 2 gösteri yüzdeleri ve perfüze veya unperfused sıtma ile enfekte olmuş ve naif kontrol farelerin beyinleri kurtarıldı farklı BSL nüfus mutlak sayıları. Protokol metninde de belirtildiği gibi İzole BSL PE-anti-NK1.1 ve APC-anti-TCR-β antikorları ile boyandı. Önceki bulguları 7-9 ile uyumlu olarak, αβTCR + T hücreleri perfüze sıtma ile enfekte farelerde (günde 6 pi) ve beyinlerinde BSL havuzu yüksek oranda oluşur. Bu nüfusun önemli ölçüde (Şekil 2A-B) non-perfüze hayvanların beyinle...

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir yöntem<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA ile enfekte olmuş fareler tarif edilmektedir. Yöntemi flow sitometri ile floresan antikorlar ve müteakip analizler ile boyanarak miktarının yanı sıra izole lökositlerin fenotipik karakterizasyonu sağlar.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bu prosedürün genel amacı, deneysel serebral sıtmayı indüklemek için plazmodium burge göz anca ile enfekte olmuş farelerin beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar lökositleri izole etmektir. Fareler, enjeksiyon yoluyla plazmodium berge göz anca parazitli kırmızı kan hücreleri ile enfekte edilir. Fareler hastalık belirtileri göstermeye başladıktan sonra, sıtma ile enfekte olmuş farelerin dolaşımdaki hücreleri ağız içi perfüzyon ile uzaklaştırılır.Beyinler daha sonra toplanır ve doku, enflamatuar lökositlerin izolasyonuna izin vermek için enzimlerle sindirilir. Daha sonra immün fenotipe çok renkli akış sitometrisi yapılır. Elde edilen verilerin beyin tecrit edilmiş lökosit analizi, sıtma ile enfekte olmuş farelerin beynine göç eden lökositlerin yüzdesini ve mutlak sayılarını ortaya koymaktadır.Bu yöntem, sıtma patogenezi alanında, farklı deneysel koşullar altında enfekte hayvanların beynindeki parazit sekestrasyon bölgesine hangi tür enflamatuar hücrelerin göç ettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin Görsel Gösterimi çok önemlidir. Perfüzyon adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü herhangi bir önemli kan damarına zarar vermemek için hem hız hem de ö

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Bu video, serebral sıtmanın deneysel bir fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium berghei ile enfekte dişi sivrisineklerden izole edilen sporozoitler, kısıtlanmış bir farenin kuyruk damarlarına enjekte edilir, bu da kan-beyin bariyerinin bozulmasına ve beyin iltihabına yol açarak serebral sıtmaya neden olur. Bu enfekte fare modeli, serebral sıtma ile ilişkili in vivo mikrovasküler patolojiyi incelemek için değerli bir araç sunar.

Konakçı sivrisinek türevli sporozoitler kullanılarak deneysel serebral sıtmanın bir fare modelinin oluşturulması

Bu video, bir fare modelini canlı zayıflatılmış sporozoitlerle bağışıklamak için bir testi göstermektedir. Radyasyonla zayıflatılmış Plasmodium sporozoitler, farenin kulağının sırt tarafına enjekte edilir. Her iki kulakta birden fazla yere enjeksiyonlardan sonra, farenin iyileşmesine izin verilir.

Bir Fare Modelinde Canlı Zayıflatılmış Sporozoitlerle İntradermal Bağışıklama

kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Bu protokolün genel amacı, merkezi sinir sisteminden murine astrositi ve mikroglia hücrelerinin nasıl çıkarılabildiğini, bakımını ve ayrıştırığunu ve ardından protozoa parazitleri ile enfeksiyonun nasıl sağlanmadığını öğretmektir.

Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Plasmodium cinsel gelişimi sivrisinek orta bağırsağında meydana gelir. Parazitin cinsel aşamalarını hedeflemek, bulaşmayı engellemek için umut verici bir stratejidir. Zigot oluşumundan sonra nanolusiferaz eksprese eden transgenik bir P. berghei olan Ookluc'u geliştirdik ve iletim bloke edici bileşiklerin yüksek verimli taramasını sağladık. Bu makale, Ookluc kullanarak tarama yöntemlerini detaylandırmaktadır.

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Öğrenin, Plasmodium berghei ANKA enfekte farelerden beyin kan damarlarındaki adezyonlu inflamatuar lökositleri izole etme ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon yapma yöntemini. Bu teknik, serebral malarya patogenezindeki immün yanıtı anlamak için değerlidir.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi

Daha fazla video keşfet