Name: Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi Plasmodium berghei ANKA-enfekte Fare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Öğrenin, Plasmodium berghei ANKA enfekte farelerden beyin kan damarlarındaki adezyonlu inflamatuar lökositleri izole etme ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon yapma yöntemini. Bu teknik, serebral malarya patogenezindeki immün yanıtı anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik yardım için Bayan Liana Mackiewicz teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme ve Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi IRIISS ve Proje Hibe 1031212 sayesinde mümkün oldu.

1. P. ile Fare enfeksiyonu berghei-ANKA <ol><li> Defrost kriyoprezerve P. bir kısım berghei ANKA pRBC. </li><li> Iki elli emniyet tekniği kullanılarak serebral sıtma dirençli BALB / c donör fare (8-12 hafta-eski) dizginlemek. Bir 1 ml insülin şırınga (28G iğne) kullanarak pRBC 100-200 ul fare enjekte. Rutin olarak, 1-2 verici farelere enjekte edilir. </li><li> Enfeksiyon sonrası 4-5 gün hakkında (pi) kafes donör fare çıkarın ve bir iş istasyonu veya bir tek çalışma yüzeyi üzerine yerleştirin. </li><li> Yavaşça kuyruk sonuna fare dizginlemek ve küçük makas kullanarak (yaklaşık 1 mm) kuyruk ucu kesilir. Alternatif olarak, 25 G iğne kullanılarak küçük bir kuyruk ponksiyon olabilir. </li><li> Bir buzlu uç mikroskop lamı sonuna farenin kuyruk damarından kan bir damla yerleştirin. </li><li> 45 ° açı ile ilgili ikinci bir slayt (yayıcı) yerleştirin ve kan damlasını içine geri. Kan kenarı boyunca yayılır sonra, serpme-slayt arifesinde itinkan yayması yapmak için mikroskop lamı üzerinde nly. Smear kurumaya bırakın. </li><li> 10 dakika için taze hazırlanan Giemsa slaytlar leke sonra 30 sn için% 100 metanol kan smear Fix. </li><li> 1 dakika boyunca su ile çalışan yaymada durulayın, hava-kuru izin ve mikroskop (100x, immersiyon yağı) altında slayt inceleyin. 1000 eritrositler içinde pRBC numaralandırmak ve yüzde parazitemi hesaplayabilirsiniz. Onlar deney hayvanı enfeksiyon için bled önce Donör farelerin 2.5-5% arası parazitemi düzeylerine ulaşmak gerekir. </li><li> Bir heparinize mikro-hematokrit kapiller tüp kullanarak retroorbital kanama ile donör fare kan toplayın. Tüm deneyler Walter &amp; Eliza Hall Institute Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri ile uygun olarak gerçekleştirilir. Yerel Hayvan Etik Kurulu gereksinimlerine bağlı olarak diğer kanama prosedürler kullanılabilir. 1X10 pRBC/0.2 6 ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon RPMI medyumu içinde kan gerekli miktarda eritilir. DüşününNormal bir fare hematokrit ~ 6x10 9 kırmızı kan hücrelerinin / 1 ml &#39;dir. </li><li> Intraperitoneal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml enjekte edilerek deneysel C57BL / 6 fareler (8-12 haftalık) Infect. </li><li> Enfekte farelerde parazitemi düzeylerini izlemek için adımları 1.3-1.8 izleyin. Parazitemi günde 2 ya da 3 pi başlayarak 2-3 gün her bir tespit edilmesi gerekmektedir </li><li> Fareler kambur görünümü olarak tezahür olabilir C57BL içinde / 6 şiddetli sıtma Onset, kürk ve düşük aktiviteli ruffed. Bazı fareler bu aşamada kurtarmak olabilir, ama kendini doğrulma refleksini kaybı ilerleme geri dönüşümsüz hastalık gösterir ve hayvan ötenazi gerekir. </li></ol> 2. Fareler ve Beyin Extraction Intracardial Perfüzyon <ol><li> Bir 60 cm kolon stand üst bağlı bir kolon için bir tutucu 500 ml rezervuar sabitleyerek bir kılavuz ağırlık perfüzyon sistemi birleştirin. Rezervuarın alt ucuna plastik boru bağlayın ve tampon akışını kontrol etmek için bir boru kelepçesi sabitleyin. Bir 23 G iğne hortumu takın. FilPBS (22 ° C&#39;de tutulur) ile rezervuar l, kelepçe ve tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için tüp aracılığıyla çalıştırmak için tampon izin açın. </li><li> Ötenazi P. CO 2 Solunması berghei ANKA-enfekte fare. Pedalı, orbital ve solunum tepkilerin yokluğu ölüm onaylayın. </li><li> Dorsal bir plastik tepsi içinde bulunan bir styrofoam diseksiyon gemide arka ve ön pençeleri tarafından ötenazi fare Pin. Yerel Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri anestezi bağlı intracardial pefusion önceden başlaması idare edilebileceği. </li><li> % 70 etanol ile ventral tarafta silin. </li><li> Göğüs boşluğu göstermek için orta hat boyunca cildi açmak için büyük bir makas ve forseps kullanın. Yanlarına Kıvrım ve pin cilt. </li><li> Ince forseps ile sternumun tutun ve diyafram kesmek ve sternumun her iki yanında kaburga severing. Herhangi bir büyük kan damarlarına zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> Kafasına gevşek yanındaki sternum ile göğüs kafesi Pin. </li><li> Ventriküller zekâ tutunh ince forseps ve ince makas ile dikkatlice kazımak sağ atrium. </li><li> PBS çalışırken asendan aorta doğru sol ventrikül içine yerçekimi perfüzyon sistemine takılı 23G iğne takın. Iğne ucu sadece 0.5 cm yerleştirin. </li><li> 5 dakika için ya da atık kadar fare serpmek açıktır. </li><li> Ayır farenin ve karın üzerinde yatıyordu. % 70 etanol ile kafasını temizleyin. </li><li> Büyük makas kullanarak, sadece servikal spinal kord alanı üzerinde bir kesim yapmak. </li><li> Medyan kaudal-rostral kesim kafatası maruz uzak kafatası tabanında başlayan ve cilt soyma yapmak için ince makas kullanın. </li><li> Başımı tutarak, her yörünge boşluğuna küçük bir makas bıçakları yerleştirin ve yörüngeleri arasında bir kesim yapmak. </li><li> Sutur boyunca uzunlamasına kesilmiş olun ve dikkatlice dışarı doğru her beyin yarımkürede kafatası kabuğu. </li><li> Bir spatula kullanarak, yavaşça beyin kaldırın ve RPMI medyumu içeren 10 ml santrifüj tüpüne yerleştirin. </li></ol>3. Beyin-sekestre Lökosit izolasyonu (BSL) <ol><li> Bir güvenlik kabini içinde çalışarak, yerde taze RPMI doku kültür ortamı 3-5 ml içeren bir Petri kabındaki bir paslanmaz çelik hücre süzgecinden (40-60 mesh boyutu) üstüne beyin hasat. </li><li> Küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin. </li><li> Bir kristal piston kullanarak hücre süzgecinden beyin dokusunun küçük parçalar bastırın. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 250 ° C&#39;de xg&#39;de 10 ml tüp ve santrifüj ile beyin Homojenat, transfer </li><li> % 0.05 collagenase, D ve 2U/ml DNAz I içeren RPMI medyumu, 3 ml içinde çözülür pelet </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için karışım döndürün. Bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden ve / ya da itme karışım 5 dakika süreyle buz üzerinde inkübe ederek hücre artıkları çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika için 400 x g&#39;da (herhangi bir fren) bir 7 ml% 30 Percoll yastık ve santrifüj üzerine beyin Homojenat yerleştirin. </li><li> 5 dakika için buz üzerinde kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile inkübe 1 ml pelet yeniden süspanseintracardial perfüzyon beyin kaldırılır olamazdı yapışık pRBC, lyse. </li><li> RPMI medyumu 9 mL, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 250 x g santrifüj ile hücreler yıkamak </li><li> RPMI medyumu ile bir Eppendorf tüpü transfer hücre 50-100 ul içinde süspanse BSL içeren pelet. </li><li> Yaşayabilir hücrelerin tanımlanması için Tripan mavi hücre örneği bir 5-10 ul alikot 1:02 seyreltin. </li><li> Hemasitometre kullanarak mikroskop altında canlı hücreleri saymak. Günde 6 pi itibaren, P. Gönderen berghei ANKA-enfekte farelerde 20,000-100,000 BSLs telafi edilebilir, nörolojik belirtiler gösterir. </li></ol> 4. Multicolour akış sitometri yöntemi ile BSL immünofeotipleme <ol><li> 4, 10 dakika boyunca 250 ° C&#39;de x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri, (PBS,% 1 dana fetus serumu (FCS), 2 mM EDTA) ile boyanarak 50 ul tampon içinde tekrar süspansiyon topak süpernatantı ve aspire. </li><li> Anti-CD16/32 antikor (Fcblock) saflaştırılmış 1 ul ekle. </li><li> 1 için hücreler inkübeBuz üzerinde 0 dk. </li><li> Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire. </li><li> Gerekli floresan antikor önceden belirlenmiş en uygun seyreltmeler, yani anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR ve anti-NK1.1 ihtiva eden tampon Boyama 50 ul içinde süspanse hücreler. </li><li> Buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire. </li><li> PBS içinde 100 ul hücre içinde yeniden süspanse edin. </li><li> Bir akım sitometri plastik tüp hücreleri aktarın. </li><li> Bir akış sitometresinin kullanarak, en az 5.000-10.000 olaylar kazanmak. Gerektiği gibi uygun boyanmamış hücre kontrolleri ve florokrom tazminat örnekleri dahil edilmelidir. </li><li> Uygun akım sitometri yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

BSL izolasyonu ve karakterize edilmesi ve analiz deneysel fare modellerinde doku hasarı ya da enfeksiyona yanıt olarak beyin göç inflamatuar hücrelerin miktarının sağlayan bir yöntem. Organ ekstraksiyonu ve bunu izleyen hücre izolasyonu önce kan bölmesinin çıkarılması için bir intracardial perfüzyon adım giriş non-inflamatuar dolaşımdaki lökositler ile inflamatuar hücrelerin kirlenmesini önlemek için yararlıdır. Bu inflamatuar hücreler beyin parankimi 5 nüfuz hangi tür kemirgen ensefalomyelit virüs gibi nörot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözümler ve tamponlar </td></tr><tr><td> Giemsa en azur eosin metilen mavisi çözeltisi </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Distile su 1:10 seyreltme </td></tr><tr><td> RPMI medyumu </td><td></td><td></td><td> Fare tonisite </td></tr><tr><td> Fare tonisite PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM sodyum fosfat, 0.149 NaCl, pH 7.3 </td></tr><tr><td> % 0,4 Tripan Mavisi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:02 dilüsyon </td></tr><tr><td> Kollajenaz D </td><td> Biyokimyasal Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Sığır pankreas Gönderen </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> PBS içinde% 30 çözelti </td></tr><tr><td> Ultra Saf Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Amonyum Klorür (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı Hücre Lizis Tampon </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nm NH4CI, pH 7.2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA disodyum tuzu </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M, pH 7.2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikorlar ve konjugatlarının </td></tr><tr><td> Anti-fare CD16/CD32 (Fc Blok), klon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553.142 </td><td> 50 ul boyama tampon içinde 1 ul (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-fare CD4, klon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-fare NK1.1, klon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-fare CD8, klon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-fare anti-TCR-β, klon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-fare CXCR3, klon 220.803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinlenmiş-anti-fare CCR5, klon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman ve malzeme </td></tr><tr><td> SuperFrost mikroskop lamı </td><td> Lomb Menzel-Glaser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps, makas </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS rezervuar </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kauçuk hortum </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G iğne </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre ayrışma kiti metal elek içeren </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikron naylon hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri tüpler </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

den beyin sekestre lökositler İzolasyonu ve analizi<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka-enfekte fare

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Biz P. beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir yöntem tarif berghei ANKA-enfekte fareler. Deneysel serebral sıtma indüksiyon, bir nörolojik sendromu bu parazitin suşu sonuçlar duyarlı fare suşlarının enfeksiyonu insanlarda 1,2 Plasmodium falciparum aracılı şiddetli sıtma özetlediği bazı önemli yönleri olduğunu. Kan aşama sıtma Olgun formlar vasküler endotel hücreleri ile bağlamak sağlar enfekte eritrosit, yüzeyi üzerinde parazit proteinleri ifade eder. Bu süreç hipoksi ve kanamalar 3 sonuçlanan kan akımında engel indükler ve aynı zamanda parazit sekestrasyon sitesine inflamatuvar lökositlerin işe uyarır. Diğer enfeksiyonlar, örneğin neutrotopic virüsler 4-6, sıtma-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC) yanı sıra ilişkili yatkın aksine, hemekspirayon lökositlerin kan damarları içindeki yerine beyin parankimi infiltre daha münzevi kalır. Böylece non-inflamatuar dolaşan hücre, organ çıkarma ve doku işleme öncesi enfekte-farelerin geniş intracardial perfüzyon ile sekestre lökositlerin kirlenmesini önlemek için kan bölmesi çıkarmak için bu prosedürü gereklidir. Perfüzyon sonra, beyinleri hasat edilir ve küçük parçalar halinde disseke. Dokuların yapısı daha da oluşan beyin homojenat sonra miyelin ve diğer doku enkaz beyin sekestre lökositlerin ayrılması (BSL) sağlayan bir Percoll degrade üzerinde santrifüj edilir Kollajenaz D ve DNAz I. ile enzimatik tedavi ile bozulur. İzole hücreler daha sonra yıkanır, flow sitometri ile sonraki analiz için floresan antikorlar ile hemasitometre ve lekeli kullanılarak sayıldı. Bu prosedür inflamatuvar lökositlerin kapsamlı fenotipik karakterizasyonu re beyin göç veriyorinme gibi viral veya paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli uyarılara yanıtı. Yöntemi de klinik öncesi hayvan modellerinde yeni anti-inflamatuvar tedaviler değerlendirilmesi için yararlı bir araç sağlar.

Şekil sonuçlanır. 2 gösteri yüzdeleri ve perfüze veya unperfused sıtma ile enfekte olmuş ve naif kontrol farelerin beyinleri kurtarıldı farklı BSL nüfus mutlak sayıları. Protokol metninde de belirtildiği gibi İzole BSL PE-anti-NK1.1 ve APC-anti-TCR-β antikorları ile boyandı. Önceki bulguları 7-9 ile uyumlu olarak, αβTCR + T hücreleri perfüze sıtma ile enfekte farelerde (günde 6 pi) ve beyinlerinde BSL havuzu yüksek oranda oluşur. Bu nüfusun önemli ölçüde (Şekil 2A-B) non-perfüze hayvanların beyinle...

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir yöntem<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA ile enfekte olmuş fareler tarif edilmektedir. Yöntemi flow sitometri ile floresan antikorlar ve müteakip analizler ile boyanarak miktarının yanı sıra izole lökositlerin fenotipik karakterizasyonu sağlar.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bu prosedürün genel amacı, deneysel serebral sıtmayı indüklemek için plazmodium burge göz anca ile enfekte olmuş farelerin beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar lökositleri izole etmektir. Fareler, enjeksiyon yoluyla plazmodium berge göz anca parazitli kırmızı kan hücreleri ile enfekte edilir. Fareler hastalık belirtileri göstermeye başladıktan sonra, sıtma ile enfekte olmuş farelerin dolaşımdaki hücreleri ağız içi perfüzyon ile uzaklaştırılır.Beyinler daha sonra toplanır ve doku, enflamatuar lökositlerin izolasyonuna izin vermek için enzimlerle sindirilir. Daha sonra immün fenotipe çok renkli akış sitometrisi yapılır. Elde edilen verilerin beyin tecrit edilmiş lökosit analizi, sıtma ile enfekte olmuş farelerin beynine göç eden lökositlerin yüzdesini ve mutlak sayılarını ortaya koymaktadır.Bu yöntem, sıtma patogenezi alanında, farklı deneysel koşullar altında enfekte hayvanların beynindeki parazit sekestrasyon bölgesine hangi tür enflamatuar hücrelerin göç ettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin Görsel Gösterimi çok önemlidir. Perfüzyon adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü herhangi bir önemli kan damarına zarar vermemek için hem hız hem de özen gerektirirler Bu prosedürün bazı kısımlarını gösterenler, bir hayvan teknisyeni olan Leanna Mcic, bir hayvan teknisyeni olan Bayan Victoria, bir doktora öğrencisi olan Rick ve Dr. Lisa Aez, laboratuvarımdan bir doktora sonrası.Bu protokole, fareleri p berge göz anca defrostu ile enfekte ederek başlayın, P berge göz anca parazitlenmiş kırmızı kan hücrelerinin veya pbc'lerin dondurularak saklanmış bir alikotunu oda sıcaklığına gelmesine izin vererek çözün. Sekiz ila 12 haftalık bir donör fareyi kafesinden çıkarın ve bir iş istasyonuna yerleştirin. İşaret parmağı ve başparmak arasındaki boynun tırnağını kavrayın.Fareyi ters çevirin ve periton boşluğuna 100 ila 200 mikrolitre plasmodium berge eye enjekte edin. Rutin olarak iki donör fareye pbcs enjekte edilir. Enjekte ettikten sonra, fareleri enfeksiyondan dört ila beş gün sonra kafeslerine yerleştirin.Bir donör fareyi kafesinden çıkarın ve bir iş istasyonuna yerleştirin. Buzlu uçlu bir mikroskop lamının ucuna yakın bir yerde farenin kuyruk damarından bir damla kan yerleştirin. 45 derecelik bir açıyla ikinci bir slayt yerleştirin ve kan damlasına geri koyun.Kan kenar boyunca yayıldığında, kanın bulaşmasını sağlamak için yayıcı sürgüyü mikroskop lamı boyunca eşit şekilde itin. Kan lekelerini düzeltmek için smear'ın kurumasını bekleyin. Slaytları 30 saniye boyunca %100 metanole batırın.Daha sonra slaytları taze hazırlanmış GIM ZA'da 10 dakika boyunca boyayın, gim za ile boyadıktan sonra slaytı 30 saniye akan su ile durulayın. Slaytın kurumasını bekleyin, ardından 100 x yağa daldırma lensini kullanarak mikroskop altında inceleyin. PRBC'yi bin eritrosit içinde numaralandırın ve donör farenin gerekli %2,5 ila %5 seviyelerine ulaşması durumunda para yüzdesini hesaplayınParsit Heparinize mikro hematokrit kılcal tüp kullanarak anestezi altında kardiyak ponksiyon veya retroorbital kanama ile donör fareden kan toplayın.Kanı, fare başına 0.2 mililitre başına altı PRBC'nin bir katı 10 ila altı PRBC'lik bir nihai konsantrasyonda RPMI ortamında çözün. Normal bir fare hematokritinin mililitre başına yaklaşık altı kez 10 ila dokuzuncu kırmızı kan hücresi olduğunu düşünün. Aslında, sekiz ila 12 haftalık deneysel C 57, daha önce olduğu gibi 0.2 mililitre intraperitoneal içinde altıncı PRBC'ye 10 kez enjekte ederek altı fareyi siyahlaştırır.Enfekte farelerin para seviyelerini izlemek için, daha önce olduğu gibi bir kan yayması hazırlayın. Para, beşinci günden itibaren enfeksiyondan sonraki ikinci veya üçüncü günden başlayarak her iki ila üç günde bir belirlenmelidir. Enfeksiyon sonrası sonrası.Fareler, para seviyeleri %5'in üzerine çıktığında şiddetli sıtma belirtileri açısından günlük olarak izlenir ve fareler, enfeksiyondan yaklaşık altıncı gün sonra nörolojik semptomlar gösterir. Enfekte fareler, CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapılır ve ekteki belgede açıklandığı gibi hemen PBS ile perfüze edilir. Bu işlemin en zor yönü intrakardiyak perfüzyondur.Burada bir dizi sorun giderme ipucu özetlenmiştir: Fare bir strafor diseksiyon tahtasına sabitlenmiş durumdayken. Bir diseksiyon tepsisi içinde. Ventral tarafı% 70 etanol ile silin, daha sonra göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için orta hat boyunca cildi açmak için büyük makas ve forseps kullanın, cildi katlayın ve yanlara sabitleyin.Sternumu ince forseps ile tutun ve diyaframı ve sternumun her iki tarafı boyunca kesin, kaburgaları kesin. Büyük kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Göğüs kafesini sternumdan başın yanına gevşek bir şekilde sabitleyin.Ventrikülleri ince forseps ile tutun ve sağ atriyumu ince bir makasla dikkatlice kesin. Yerçekimi perfüzyon sistemine bağlı 23 gauge iğneyi çıkan aorta doğru sol ventriküle sokun. PBS çalışırken, iğne ucunun yalnızca 0,5 santimetresini sokun, fareyi beş dakika boyunca veya atık su berraklaşana kadar perfüze edin.İnteral perfüzyonu takiben, beyni inceleyin ve RPMI içeren 10 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Orta. Taze hasat edilmiş beyni, üç ila beş mililitre RPMI doku kültürü ortamı içeren bir Petri kabına 40 ila 60 gözenekli paslanmaz çelik hücre süzgecinin üzerine yerleştirin. Beyin dokusunu küçük parçalar halinde kesin.Daha sonra bir kristal piston kullanarak küçük beyin dokusu parçalarını hücre süzgecinden itin. Beyin homojenatını 10 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Döndürmeyi takiben, süpernatanı atın ve peleti üç mililitre RPM'de çözün.Kollajenaz D ve DNA kuğu içeren ortam. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika döndürün. Karışımı 70 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden geçirerek hücre kalıntılarını temizleyin.Daha sonra 10 mililitrelik bir tüpte inkübasyonu takiben beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Beyin homojenatını, kopma ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 400 kez G'de yedi mililitrelik %30'luk bir çağrı yastığı santrifüjü üzerine dikkatlice yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti bir mililitre kırmızı kan hücresi lizizinde yeniden süspanse edin, tamponlayın ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Ağız içi perfüzyon ile beyinden çıkarılmayan yapışık pbc'leri parçalamak için. Dokuz mililitre RPMI orta yıkama hücresi ekleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Resus, beyin sekestre edilmiş lökositleri veya BSL içeren peleti 50 ila 100 mikrolitre RPMI ortamında askıya alır ve hücreleri bir hemo sitometre ve trian mavisi dışlama kullanarak mikroskop altında canlı hücreleri sayan bir mikro santrifüj tüpüne aktarır.Enfeksiyondan altı gün sonra, canlı hücre sayıları elde edildikten sonra 20.000 ila 100.000 BSL geri kazanılabilir. Hücreler akış sitometrisi ile analiz için hazırlanır. Bu prosedürün ayrıntıları ekteki belgede verilmiştir, ancak önce burada özetlenmiştir.Her beyinden izole edilen hücrelerin tamamı 1.5 mililitrelik mikro fuge tüpünde santrifüj edilir ve anti CD 16 ve CD 32 bloke edici antikorlar ile boyama tamponunda yeniden süspanse edilir. Buz üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreler boyama tamponu ile yıkanır, tekrar santrifüjlenir ve anti CD dört, anti CD sekiz, anti TCR ve anti NK 1.1 floresan antikorları içeren boyama tamponunda yeniden süspanse edilir. Hücreler bir saat buz üzerinde inkübe edilir, boyama, tampon ve santrifüj ile yıkanır.Spinden sonra, hücreler PBS'de yeniden süspanse edilir ve bir akış sitometresinde en az 5.000 ila 10.000 olay elde edilir. Elde edilen veriler uygun akış sitometrisi yazılımı kullanılarak analiz edilir. BSL popülasyonları, perfüze veya UN perfüze, sıtma ile enfekte ve naif kontrol farelerinin beyinlerinden elde edildi ve pe, anti NK 1.1 ve bir PC anti TCR beta antikorları ile boyandı.Bu nokta grafikler, NK hücrelerinin, T lenfositlerinin, NK 1.1 pozitif TCR pozitif hücrelerin ve çift negatif hücrelerin yüzdelerini gösterir. Önceki bulgularla tutarlı olarak perfüze edilmiş veya kaynaşmamış, sıtma ile enfekte ve saf kontrol farelerinde NK 1.1 negatif TCR negatif. Alfa beta TCR pozitif T hücreleri, enfeksiyondan sonraki altıncı günde perfüze sıtma ile enfekte olmuş farelerin beyinlerinde BSL havuzunun yüksek bir oranını oluşturdu.Bu popülasyonun, perfüze edilmemiş hayvanların beyinlerinde önemli ölçüde yetersiz temsil edildiği ortaya çıktı. Perfüze edilmemiş beyinlerde T hücresi frekanslarının belirgin şekilde azalması, bu hayvanlarda önemli ölçüde daha yüksek bir yüzde ve toplam çift negatif hücre sayısı ile ilişkilendirildi. Perfüze edilmemiş beyinlerdeki çift negatif hücrelerin yüksek yüzdesi ve sayıları sadece sıtma ile enfekte farelerde değil, aynı zamanda naif kontrollerde de tespit edildi, bu da bu hücrelerin beyin kan damarlarında bulunan ve intrakardiyak perfüzyon yapılmazsa inflamatuar hücrelerle birlikte geri kazanılan inflamatuar olmayan lökositler olduğunu düşündürdü.Bu prosedürü denerken, tecrit edilmiş lökositlerin enflamatuar olmayan dolaşımdaki hücrelerle kontaminasyonunu önlemek için organ ekstraksiyonundan önce enfekte farelerin kapsamlı intra kardiyo profüzyonunu gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, beyin tecrit edilmiş lökositlerin Plasmodium virga ile enfekte olmuş farelerden akıcı geometri ile nasıl izole edileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Bu video, serebral sıtmanın deneysel bir fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium berghei ile enfekte dişi sivrisineklerden izole edilen sporozoitler, kısıtlanmış bir farenin kuyruk damarlarına enjekte edilir, bu da kan-beyin bariyerinin bozulmasına ve beyin iltihabına yol açarak serebral sıtmaya neden olur. Bu enfekte fare modeli, serebral sıtma ile ilişkili in vivo mikrovasküler patolojiyi incelemek için değerli bir araç sunar.

Konakçı sivrisinek türevli sporozoitler kullanılarak deneysel serebral sıtmanın bir fare modelinin oluşturulması

Bu video, bir fare modelini canlı zayıflatılmış sporozoitlerle bağışıklamak için bir testi göstermektedir. Radyasyonla zayıflatılmış Plasmodium sporozoitler, farenin kulağının sırt tarafına enjekte edilir. Her iki kulakta birden fazla yere enjeksiyonlardan sonra, farenin iyileşmesine izin verilir.

Bir Fare Modelinde Canlı Zayıflatılmış Sporozoitlerle İntradermal Bağışıklama

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Bu protokolün genel amacı, merkezi sinir sisteminden murine astrositi ve mikroglia hücrelerinin nasıl çıkarılabildiğini, bakımını ve ayrıştırığunu ve ardından protozoa parazitleri ile enfeksiyonun nasıl sağlanmadığını öğretmektir.

Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Plasmodium cinsel gelişimi sivrisinek orta bağırsağında meydana gelir. Parazitin cinsel aşamalarını hedeflemek, bulaşmayı engellemek için umut verici bir stratejidir. Zigot oluşumundan sonra nanolusiferaz eksprese eden transgenik bir P. berghei olan Ookluc'u geliştirdik ve iletim bloke edici bileşiklerin yüksek verimli taramasını sağladık. Bu makale, Ookluc kullanarak tarama yöntemlerini detaylandırmaktadır.

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Öğrenin, Plasmodium berghei ANKA enfekte farelerden beyin kan damarlarındaki adezyonlu inflamatuar lökositleri izole etme ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon yapma yöntemini. Bu teknik, serebral malarya patogenezindeki immün yanıtı anlamak için değerlidir.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi

Daha fazla video keşfet