Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi Plasmodium berghei ANKA-enfekte Fare

Bu prosedürün genel amacı, deneysel serebral sıtmayı indüklemek için plazmodium burge göz anca ile enfekte olmuş farelerin beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar lökositleri izole etmektir. Fareler, enjeksiyon yoluyla plazmodium berge göz anca parazitli kırmızı kan hücreleri ile enfekte edilir. Fareler hastalık belirtileri göstermeye başladıktan sonra, sıtma ile enfekte olmuş farelerin dolaşımdaki hücreleri ağız içi perfüzyon ile uzaklaştırılır.

Beyinler daha sonra toplanır ve doku, enflamatuar lökositlerin izolasyonuna izin vermek için enzimlerle sindirilir. Daha sonra immün fenotipe çok renkli akış sitometrisi yapılır. Elde edilen verilerin beyin tecrit edilmiş lökosit analizi, sıtma ile enfekte olmuş farelerin beynine göç eden lökositlerin yüzdesini ve mutlak sayılarını ortaya koymaktadır.

Bu yöntem, sıtma patogenezi alanında, farklı deneysel koşullar altında enfekte hayvanların beynindeki parazit sekestrasyon bölgesine hangi tür enflamatuar hücrelerin göç ettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin Görsel Gösterimi çok önemlidir. Perfüzyon adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü herhangi bir önemli kan damarına zarar vermemek için hem hız hem de özen gerektirirler Bu prosedürün bazı kısımlarını gösterenler, bir hayvan teknisyeni olan Leanna Mcic, bir hayvan teknisyeni olan Bayan Victoria, bir doktora öğrencisi olan Rick ve Dr. Lisa Aez, laboratuvarımdan bir doktora sonrası.

Bu protokole, fareleri p berge göz anca defrostu ile enfekte ederek başlayın, P berge göz anca parazitlenmiş kırmızı kan hücrelerinin veya pbc'lerin dondurularak saklanmış bir alikotunu oda sıcaklığına gelmesine izin vererek çözün. Sekiz ila 12 haftalık bir donör fareyi kafesinden çıkarın ve bir iş istasyonuna yerleştirin. İşaret parmağı ve başparmak arasındaki boynun tırnağını kavrayın.

Fareyi ters çevirin ve periton boşluğuna 100 ila 200 mikrolitre plasmodium berge eye enjekte edin. Rutin olarak iki donör fareye pbcs enjekte edilir. Enjekte ettikten sonra, fareleri enfeksiyondan dört ila beş gün sonra kafeslerine yerleştirin.

Bir donör fareyi kafesinden çıkarın ve bir iş istasyonuna yerleştirin. Buzlu uçlu bir mikroskop lamının ucuna yakın bir yerde farenin kuyruk damarından bir damla kan yerleştirin. 45 derecelik bir açıyla ikinci bir slayt yerleştirin ve kan damlasına geri koyun.

Kan kenar boyunca yayıldığında, kanın bulaşmasını sağlamak için yayıcı sürgüyü mikroskop lamı boyunca eşit şekilde itin. Kan lekelerini düzeltmek için smear'ın kurumasını bekleyin. Slaytları 30 saniye boyunca %100 metanole batırın.

Daha sonra slaytları taze hazırlanmış GIM ZA'da 10 dakika boyunca boyayın, gim za ile boyadıktan sonra slaytı 30 saniye akan su ile durulayın. Slaytın kurumasını bekleyin, ardından 100 x yağa daldırma lensini kullanarak mikroskop altında inceleyin. PRBC'yi bin eritrosit içinde numaralandırın ve donör farenin gerekli %2,5 ila %5 seviyelerine ulaşması durumunda para yüzdesini hesaplayınParsit Heparinize mikro hematokrit kılcal tüp kullanarak anestezi altında kardiyak ponksiyon veya retroorbital kanama ile donör fareden kan toplayın.

Kanı, fare başına 0.2 mililitre başına altı PRBC'nin bir katı 10 ila altı PRBC'lik bir nihai konsantrasyonda RPMI ortamında çözün. Normal bir fare hematokritinin mililitre başına yaklaşık altı kez 10 ila dokuzuncu kırmızı kan hücresi olduğunu düşünün. Aslında, sekiz ila 12 haftalık deneysel C 57, daha önce olduğu gibi 0.2 mililitre intraperitoneal içinde altıncı PRBC'ye 10 kez enjekte ederek altı fareyi siyahlaştırır.

Enfekte farelerin para seviyelerini izlemek için, daha önce olduğu gibi bir kan yayması hazırlayın. Para, beşinci günden itibaren enfeksiyondan sonraki ikinci veya üçüncü günden başlayarak her iki ila üç günde bir belirlenmelidir. Enfeksiyon sonrası sonrası.

Fareler, para seviyeleri %5'in üzerine çıktığında şiddetli sıtma belirtileri açısından günlük olarak izlenir ve fareler, enfeksiyondan yaklaşık altıncı gün sonra nörolojik semptomlar gösterir. Enfekte fareler, CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapılır ve ekteki belgede açıklandığı gibi hemen PBS ile perfüze edilir. Bu işlemin en zor yönü intrakardiyak perfüzyondur.

Burada bir dizi sorun giderme ipucu özetlenmiştir: Fare bir strafor diseksiyon tahtasına sabitlenmiş durumdayken. Bir diseksiyon tepsisi içinde. Ventral tarafı% 70 etanol ile silin, daha sonra göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için orta hat boyunca cildi açmak için büyük makas ve forseps kullanın, cildi katlayın ve yanlara sabitleyin.

Sternumu ince forseps ile tutun ve diyaframı ve sternumun her iki tarafı boyunca kesin, kaburgaları kesin. Büyük kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Göğüs kafesini sternumdan başın yanına gevşek bir şekilde sabitleyin.

Ventrikülleri ince forseps ile tutun ve sağ atriyumu ince bir makasla dikkatlice kesin. Yerçekimi perfüzyon sistemine bağlı 23 gauge iğneyi çıkan aorta doğru sol ventriküle sokun. PBS çalışırken, iğne ucunun yalnızca 0,5 santimetresini sokun, fareyi beş dakika boyunca veya atık su berraklaşana kadar perfüze edin.

İnteral perfüzyonu takiben, beyni inceleyin ve RPMI içeren 10 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Orta. Taze hasat edilmiş beyni, üç ila beş mililitre RPMI doku kültürü ortamı içeren bir Petri kabına 40 ila 60 gözenekli paslanmaz çelik hücre süzgecinin üzerine yerleştirin. Beyin dokusunu küçük parçalar halinde kesin.

Daha sonra bir kristal piston kullanarak küçük beyin dokusu parçalarını hücre süzgecinden itin. Beyin homojenatını 10 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Döndürmeyi takiben, süpernatanı atın ve peleti üç mililitre RPM'de çözün.

Kollajenaz D ve DNA kuğu içeren ortam. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika döndürün. Karışımı 70 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden geçirerek hücre kalıntılarını temizleyin.

Daha sonra 10 mililitrelik bir tüpte inkübasyonu takiben beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Beyin homojenatını, kopma ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 400 kez G'de yedi mililitrelik %30'luk bir çağrı yastığı santrifüjü üzerine dikkatlice yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti bir mililitre kırmızı kan hücresi lizizinde yeniden süspanse edin, tamponlayın ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Ağız içi perfüzyon ile beyinden çıkarılmayan yapışık pbc'leri parçalamak için. Dokuz mililitre RPMI orta yıkama hücresi ekleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Resus, beyin sekestre edilmiş lökositleri veya BSL içeren peleti 50 ila 100 mikrolitre RPMI ortamında askıya alır ve hücreleri bir hemo sitometre ve trian mavisi dışlama kullanarak mikroskop altında canlı hücreleri sayan bir mikro santrifüj tüpüne aktarır.

Enfeksiyondan altı gün sonra, canlı hücre sayıları elde edildikten sonra 20.000 ila 100.000 BSL geri kazanılabilir. Hücreler akış sitometrisi ile analiz için hazırlanır. Bu prosedürün ayrıntıları ekteki belgede verilmiştir, ancak önce burada özetlenmiştir.

Her beyinden izole edilen hücrelerin tamamı 1.5 mililitrelik mikro fuge tüpünde santrifüj edilir ve anti CD 16 ve CD 32 bloke edici antikorlar ile boyama tamponunda yeniden süspanse edilir. Buz üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreler boyama tamponu ile yıkanır, tekrar santrifüjlenir ve anti CD dört, anti CD sekiz, anti TCR ve anti NK 1.1 floresan antikorları içeren boyama tamponunda yeniden süspanse edilir. Hücreler bir saat buz üzerinde inkübe edilir, boyama, tampon ve santrifüj ile yıkanır.

Spinden sonra, hücreler PBS'de yeniden süspanse edilir ve bir akış sitometresinde en az 5.000 ila 10.000 olay elde edilir. Elde edilen veriler uygun akış sitometrisi yazılımı kullanılarak analiz edilir. BSL popülasyonları, perfüze veya UN perfüze, sıtma ile enfekte ve naif kontrol farelerinin beyinlerinden elde edildi ve pe, anti NK 1.1 ve bir PC anti TCR beta antikorları ile boyandı.

Bu nokta grafikler, NK hücrelerinin, T lenfositlerinin, NK 1.1 pozitif TCR pozitif hücrelerin ve çift negatif hücrelerin yüzdelerini gösterir. Önceki bulgularla tutarlı olarak perfüze edilmiş veya kaynaşmamış, sıtma ile enfekte ve saf kontrol farelerinde NK 1.1 negatif TCR negatif. Alfa beta TCR pozitif T hücreleri, enfeksiyondan sonraki altıncı günde perfüze sıtma ile enfekte olmuş farelerin beyinlerinde BSL havuzunun yüksek bir oranını oluşturdu.

Bu popülasyonun, perfüze edilmemiş hayvanların beyinlerinde önemli ölçüde yetersiz temsil edildiği ortaya çıktı. Perfüze edilmemiş beyinlerde T hücresi frekanslarının belirgin şekilde azalması, bu hayvanlarda önemli ölçüde daha yüksek bir yüzde ve toplam çift negatif hücre sayısı ile ilişkilendirildi. Perfüze edilmemiş beyinlerdeki çift negatif hücrelerin yüksek yüzdesi ve sayıları sadece sıtma ile enfekte farelerde değil, aynı zamanda naif kontrollerde de tespit edildi, bu da bu hücrelerin beyin kan damarlarında bulunan ve intrakardiyak perfüzyon yapılmazsa inflamatuar hücrelerle birlikte geri kazanılan inflamatuar olmayan lökositler olduğunu düşündürdü.

Bu prosedürü denerken, tecrit edilmiş lökositlerin enflamatuar olmayan dolaşımdaki hücrelerle kontaminasyonunu önlemek için organ ekstraksiyonundan önce enfekte farelerin kapsamlı intra kardiyo profüzyonunu gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, beyin tecrit edilmiş lökositlerin Plasmodium virga ile enfekte olmuş farelerden akıcı geometri ile nasıl izole edileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.