Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Bu deney, tek hücrelerde hücre içi patojenler tarafından ortaya çıkan VA rüptürünü izler. İlk önce hücreleri, hücresel esterazlar tarafından parçalanan CCF 4:00 boyası ile yükleyin. Daha sonra FL nöro bakterilerini hazırlayın ve CCF'ye uygulayın, dört yüklü hücre, konakçı hücrelerin bakteri istilası için hücreleri 37 santigrat derecede inkübe eder.

Ardından 450 nanometre ve 535 nanometre kanallarında yayılan yoğunlukların oranını belirleyin. Sonuçlar, yüksek verimli lys'ye uyarlanabilirliği nedeniyle sitozolde patojenlerin varlığını göstermektedir. Bu teknik, konakçı patojenlerin etkileşimleri sırasında bakteri subselüler lokalizasyonunun önemli bir sorununu ele alarak yeni antibiyotiklerin tanımlanmasını kolaylaştırır.

Meslektaşım Tran Vanu ile birlikte, hücre içi patojenlere yüksek zamansal çözünürlüğe sahip yaklaşımlar geliştirmekle ilgilendik. Bu, CCF dört betalaktamaz düzenli ular rüptür testinin kurulmasına yol açtı. Bugün, bu yaklaşım laboratuvarda iki yüksek lisans öğrencisi tarafından deneysel olarak sunulacak, Nora MellU ve Charlotte Keller Yabani tip ve mutant bakteri suşlarını, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram içeren sekiz mililitre TCSB'ye aşılayın, kültürleri 37 derecelik bir çalkalayıcıya yerleştirin, şimdi kuyu başına beş kez 10 ila üçüncü hela hücresine tohumlayın.

% 10 fetal buzağı serumu% 1 penisilin streptomisin kültürü içeren 100 mikrolitre DMEM'de,% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründeki hücreler, ertesi gün% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründeki hücreler, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram ile takviye edilmiş TCSB'de 100'üncü bir seyreltmede bakteriler, iki buçuk saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda büyür. Şimdi hela hücrelerini yüklemek için CCF 4:00 hazırlayın, em tamponunda boya, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, bakterileri 500 mikrolitre PBS Resus ile bir yıkamadan sonra santrifüjleme ile santrifüjleme yoluyla bir mililitre kültür enfeksiyon peletine hazırlamak için karanlıkta oda sıcaklığında kuyu başına 25 mikrolitre CCF 4:00 yükleme karışımı ekleyin, bakterileri mililitre başına 10 mikrogram poliol lizin ve mililitre başına 40 mikrogram beta-laktamaz ile desteklenmiş 500 mikrolitre PBS'de askıya alın.

Oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde 10 dakika inkübe edin, daha sonra 500 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın ve her bir bakteri peletini 500 mikrolitre bir milimolar Probenecid içinde EM tamponunda yeniden süspanse edin, hücreleri bir kez 150 mikrolitre bir milimolar prob ile yıkayın. Daha sonra, 10 mikrolitre bakteriyi 100 mikrolitre bir milimolar problu çözelti içinde seyreltin ve hela hücrelerinin her bir kuyusuna dağıtın. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildikten sonra, plakayı bir saat boyunca 37 santigrat dereceye aktarın.

150 mikrolitre bir milimolar probit solüsyonu ile bir kez yıkayın. Daha sonra numuneleri 50 mikrolitre% 4 paraform aldehit ile karanlıkta 10 dakika boyunca bir milimolar Pro çözeltisinde sabitleyin Probenecid çözeltisi ile bir yıkamadan sonra, optimum hücre segmentasyonu için 30 mikrolitre 10 mikromolar nükleer boya drac beş ekleyin. Hücreleri 30 dakika inkübe edin, bir kez yıkayın ve ters çevrilmiş bir epi floresan mikroskobu kullanarak görüntü elde etmek için 100 mikrolitre bir milimolar çözelti ekleyin.

405 nanometrede bir uyarma dalga boyu kullanın. 450 nanometre ve 535 nanometre filtrelerle iletilen ışık için beş milisaniyelik pozlama sürelerini kullanarak emisyonu tespit edin. 535 nanometre için 1000 milisaniye ve 450 nanometre için 500 milisaniye.

Otomatik mikroskopiye bağlı bir odak kalibrasyon cihazının kullanılması, birden fazla kuyuda düzinelerce farklı pozisyonun aynı anda elde edilmesini sağlar. Konfokal mikroskop kullanıyorsanız, 450 nanometrede 240 milisaniye, 405 nanometre lazer için 535 nanometrede 360 milisaniye ve 640 nanometre lazer için 640 milisaniye maruz kalma süreleri kullanın. Verileri, her bir hücre için floresan sinyalinin otomatik olarak puanlanmasına izin veren bir bilgisayar algoritması ile analiz edin.

Örneğin, 450 nanometre ve 535 nanometre emisyon sinyalleri arasındaki oranı ölçmek için bir komut dosyası oluşturmak için metamorph ve acapella gibi yazılımlar kullanın. Bu test için, iki mililitrelik bir son hacimde iki kez 10 ila beşinci hücrelere sahip bir HELOC kültürü başlatın. Bakterileri enfeksiyona hazırlayın ve hela hücrelerini CCF ile yükleyin 04:00 37 santigrat derece ısıtma odası içinde N plan hava objektifi olan bir konvoy mikroskobu düzenleyin.

405 nanometre lazeri ayarlayın ve 450 nanometre ve 535 nanometre filtrelerle emisyonu ayarlayın. Ayrıca iletilen ışık için beş milisaniyelik pozlama süreleri girin. 535 nanometre için 200 milisaniye ve 450 nanometre için 100 milisaniye.

60 dakika boyunca her 90 saniyede bir veri toplamayı ayarlayın. Şimdi hücreleri bir kez iki mililitre bir milimolar Probenecid çözeltisi ile yıkayın. Em tamponuna iki mililitre bir milimolar prob ekleyin.

Daha sonra çanağı mikroskobun sahnesine monte edin ve altı dakika sonra edinime başlayın. Satın alma işlemini beklemeye alın. Hücrelerin üzerine 250 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin ve edinme sonrası analiz için alımı yeniden başlatın.

Velocity metamorph kullanarak filmleri görselleştirin veya görüntü J. Her bir hücre için 450 ila 535 nanometre yoğunluk oranları elde edin. CCF 04:00 beta-laktamaz yaklaşımı, HELOC hücre enfeksiyonu üzerine jel flexneri gibi hücre içi patojenlerin üler rüptürünü izlemek için sağlam ve hassas bir yöntemdir. Non-invaziv BS 176 AFA bir saat boyunca bir gerinim ile, CCF dört perde probu bozulmadan kalır ve yeşil bir sinyal yayar.

Buna karşılık, virülan M 90 TFA I suşu, oran metrik sinyalinin belirlenmesi için sitozoldeki prob bölünmesi ile tutarlı olarak sinyali maviye çevirir. 535 ve 450 nanometre kanallarındaki hücrelerin ve ölçümlerin algılanmasını otomatikleştirmek için metamorf ve akapella yazılımı için bir komut dosyası geliştirdik. Hücrelerin çekirdeği ve sitozu, DR beş kanalı kullanılarak bölümlere ayrılır.

Daha sonra algoritma, 450 nanometre ve 535 nanometre pozitif hücre popülasyonlarını tespit etme ve ölçme yeteneğine sahiptir. Hesaplanan ortalama oranlar mutant suş için düşük ve virülan suş için yüksektir. Deneyler, Gila epitel hücreleri ve THP bir makrofaj benzeri hücreler gibi farklı insan hücre tipleri üzerinde gerçekleştirilebilir.

Her iki hücre tipi de enfeksiyon altında yayılan sinyali yeşilden maviye değiştirerek virülan M 90 T AFA bir cha suşuna yanıt verir. Non-invaziv suş ile yeşil sinyal, metamorf yazılımı üzerinde geliştirilen bir komut dosyası kullanılarak nicelemeye devam eder ve Excel'de geliştirilen bir makro, hücre dağılımının bir fonksiyonu olarak ular yırtılma histogramlarını sunar. Yöntem, farklı bakterilerin enfektivitesini anlamak için başarılı bir şekilde uyarlanabilir.

Örneğin, bu veri seti mycobacterium Bovis'i gösterir. BCG, kalıcı yeşil sinyalle gösterildiği gibi, deneyin tüm seyri boyunca fagozomda bulunur. Buna karşılık, mikobakteri tuberculosis, aynı algoritmayı kullanarak yedi günlük enfeksiyondan sonra 450 nanometrelik bir sinyalin ortaya çıkmasıyla vurgulandığı gibi, yedi günlük enfeksiyondan sonra THP'de bir makrofajda vagaomal membran rüptürüne neden olur.

Ella'nın valar rüptürünü incelemeye gelince, mycobacterium tuberculosis ile enfekte olmuş hücrelerin, yedi günlük enfeksiyondan sonra mycobacterium bovis BCG'den daha yüksek 450 ila 535 nanometre oranları gösterdiğini bulduk. Bu videoyu izledikten sonra, CCL dört betalaktamaz testi ile patojenler tarafından ular rüptürü nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol dört saat içinde gerçekleştirilebilir, ancak unutmayın, protokol boyunca her tampona proce eklemeniz gerekir. Bu tekniğin elektron mikroskobu veya membran fraksiyonasyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, herhangi bir biyokimyasal işlem gerektirmeden gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilebilmesidir.

Konakçı hücrelerde bakterilerin alımını ve çoğalmasını değerlendirmek için aktin etiketleme veya gentamisin koruma testi gibi daha ileri analizler yapılabilir.