Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, civciv arka beynindeki belirli nöron alt kümelerini etiketlemek ve aksonal yörüngelerini ve hedeflerini izlemektir. Bu, önce embriyonik bir günün merkezinde küçük oval bir pencere açılarak gerçekleştirilir.2.75. Yumurta sonraki DNA plazmitleri arka beyin lümenine enjekte edilir.

Daha sonra arka beyin, istenen nöronal gruptaki yapıların ekspresyonuna izin vermek için tek taraflı olarak elektropore edilir ve yumurtalar kuluçkaya yatırılır. Son olarak, beyin sapı, düz montaj hazırlığı veya doku kesiti için tüm embriyodan diseke edilir. Sonuç olarak, immünofloresan boyama ve mikroskopi analizi ile çeşitli gelişim aşamalarında arka, beyin ve beyincikte aksonal projeksiyonları ve sinaptik hedefleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, gelişimsel nörobiyoloji alanında, belirli nöronal hücrelerin aksonlarını nasıl yansıttığı ve embriyonik gelişim sırasında sinaptik bağlantılar oluşturduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Elektroporasyona hazırlanmak için, 16 ila 17. aşamaya ulaşana kadar 65 ila 70 saat boyunca 37 ila 38 buçuk santigrat derecede inkübe edin. Yumurtalar kuluçkaya yatarken, cam kılcal damarları çekin, bükülmüş L şeklindeki altın elektrotları bir adaptör tutucu ile nabız anlatıcısına bağlayın.

Elektroporasyon parametrelerini 25 volt, beş darbe sayısı, 45 milisaniye darbe uzunluğu ve 300 darbe aralığına ayarlayın. Bir ağız pipeti, 10 mililitrelik bir şırınga iğnesi, paraform şeritleri, yumuşak bir fırça, keskin diseksiyon makası ve 25 mililitre steril PBS hazırlayın. Yeterli bir DNA plazmit karışımı hazırlayın ve enjekte edilen DNA'yı görselleştirmek için hızlı yeşil boya ekleyin.

Yumurtalar uygun gelişim aşamasına ulaştığında, onları kuluçka makinesinden çıkarın ve yatay konumda tutun. Yumurta kabuklarını temizlemek için %70 etanol kullanın. Embriyonik maruziyeti en aza indirmek için her seferinde bir yumurta kullanın.

Makasın uçlarıyla hava alma zamanı. Yumurta direğinde bir delik açın ve şırınga ile üç ila dört mililitre albümini çıkarın. Diseksiyon makasını kullanarak yumurta kabuğunun üst yatay direğinde küçük oval bir pencere açın.

Tüm süreç boyunca, kuruluğu önlemek için embriyonun üzerine birkaç damla PBS damlatın. Bir ağız pipeti kullanarak, cam kılcal damara az miktarda DNA karışımı yükleyin. Daha sonra, embriyoyu arka ucu dolaylı görünümü ile yerleştirin.

Daha sonra kılcal damarı yaklaşık 45 derecede tutarak, arka beynin içine nüfuz edin. Herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan embriyonun etrafındaki herhangi bir zarı çıkarmayın. DNA solüsyonunu arka beyin lümenine enjekte etmek için dikkatlice nefes verin.

Çözelti, DNA enjeksiyonundan hemen sonra öne doğru yayılacaktır. Paralel elektrotları kesin olarak hedeflenen AP ve DV arka beyin pozisyonlarına yerleştirin. Kalbe dokunmadan, elektrotları hafifçe ventral olarak itin ve elektroyu nabız atın.

Elektrotlar, elektriksel iletkenliği belirtmek için kabarcıklarla kapatılmalı, elektrotları dikkatlice çıkarmalı ve embriyoyu soğutmak ve kabarcıkları çıkarmak için birkaç damla PBS damlatılmalıdır. Kuluçka sırasında yumuşak bir fırça ile kurumayı önlemek için yumurta açıklığını düzgün bir şekilde kapatmak için bir perfil şeridi kullanın ve PBS elektrotları yıkayın, yumurtayı istenen süre boyunca kuluçka makinesine yerleştirin. Embriyoların sağkalımı, elektroporasyondan iki ila üç gün sonra yaklaşık% 90'dır ve elektroporasyondan 12 gün sonra% 50'ye kadar azalır.

Arka beynin düz montaj preparatlarını yapmak için, embriyoyu çevreleyen zarlardan ve kan damarlarından ayırarak dikkatlice inceleyin. Embriyoyu, embriyo dorsalya bakacak şekilde PBS içeren küçük bir silikon kaplı Petri kabına yerleştirin. Yemeğe takmak için tungsten pimleri kullanın.

Sonra keskin bir cam kılcal damar kullanarak. Keskin cımbız ve mikro makasla arka beyin çatı plakasında bir sırt yarığı açın. Başın üst kısmını tutun ve arka beyin dokusunu rostraldan yürümeye kadar çok dikkatli bir şekilde çekin.

Arka beynin ayrılmasından sonra, kalan ventral dokuları çıkarın. Arka beyni oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca% 4 paraform aldehit veya PFA çözeltisi içinde inkübe edin. Ardından PFA'yı çıkarmak için PBT ile yıkayın.

Metin protokolünde açıklanan immünofloresan preparatını takip ettikten sonra, arka beyni dorsala bakacak şekilde bir cam slayt üzerine yerleştirin. Arka beyne floresan montaj ortamı ekleyin ve arka beyni slayt üzerinde düzleştirmek için cam kılcal damarlar veya tungsten iğneleri kullanın. Kapak kaymasının doku tarafından sıkılmasını önlemek için her köşeye az miktarda yağ ekleyin.

Yapışma için hava kabarcıklarından kaçınarak arka beynin üzerine dikkatlice bir kapak fişi yerleştirin. Kapak camı kenarlarına oje sürün. Beyin sapının kriyo kesitleri, E 6.5'ten sonra herhangi bir gelişim aşamasında gerçekleştirilebilir.

Çok kalınlaşan düz monte embriyoda aksonların görüntülenmesinin zorluğu nedeniyle tercih edilen yöntem olmalıdır. Ayrıca, sinapsisin gösterilmesi, dokunun kesitlenmesini ve mikroskop altında yüksek büyütmeli görüntüyü gerektirir. Kriyo bölümü için bir örnek hazırlamak için embriyoyu inceleyin ve beyni çevreleyen tüm dokuları çıkarın.

PBS ile durulayın. Daha sonra embriyoyu medullanın kundaklama bölgesinde kesmek için mikro makas ve keskin cımbız kullanın. Beyincik ile orta beyin arasında geniş bir kesi yapın ve tüm beyin sapını çıkarın.

Doku medulla pons ve serebellum em içermelidir. Aşağıdaki örnekte, kontrol arka beynindeki inter nöronların bir alt grubu olan DA'da eksprese edilen bir güçlendirici eleman, Cree rekombinazının yukarı akışında klonlandı ve bir Cree'ye bağımlı sitoplazmik GFP raportör plazmidi ile birlikte elektropore edildi. Evre E 4.5'te düz bir montaj hazırlığı, gelişimin sonraki aşamalarında DA bir inter nöronların aksonal çıkıntılarını haritalamak için iki kontralateral yükselen aksonal projeksiyon modelini ortaya çıkarır.

A TOH bir creen arttırıcı ve transpoze vektör ile birlikte iki sırtlı kol arasında bir pre-con koşulsuz GFP muhabir kaseti klonlandı. Bu stratejiyi kullanarak, Elektroporated C precon koşullu MG FP, civciv kromozomlarına entegre edilir ve sonuç olarak, durdurma kaseti sadece D bir nöronlarda çıkarılır ve GFP'nin uzun süreli ekspresyonunu sağlar. DA'da bir hücre.

GFP'nin mesilatlı formu, sitoplazmada seyreltilmek yerine aksonal zar boyunca lokalize olacak şekilde zara bağlar. Beyin saplarında E 13.5'te toplanır ve sagital kesitlerde analiz edilir. DA bir aksonların beyincikte biriktiği ve ZI bir pozitif hücreler ile işaretlenen dış granüler tabakaya veya EGL'ye doğru uzandığı bulundu.

Serebellumdaki D one aksonlarının sinaptik hedefleri de analiz edildi. E 2.75 embriyoları, sinaptik vezikül proteini iki raportör plazmid, bir H bir Cree arttırıcı ve piggyback transpozeleri ile elektropore edildi. Bu yöntem, GFP raportörünün presinaptik DA bir aksonal terminalde ekspresyonunu sağlar.

Beyincik E 13.5'te kesitlere ayrıldı ve genel presinaptik belirteç sinaptik taman ve bikini tabakasını işaretleyen kalbindin ile boyandı. Kesitin yüksek büyütmeli bir görünümü, bikini tabakası da dahil olmak üzere çoklu serebellar bölgelerde SV iki GFP pozitif sinaptik vezikülü göstermektedir. Bu sonuç, DA'nın beyincikteki nöronlar arası bir arka beynin sinaptik bağlantılarını ortaya koymaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, nöronal hücrelerin bir alt kümesini spesifik olarak etiketlemek için embriyonik ikinci gün nokta 75'te DNA'nın kuş Hein'ine nasıl elektro olarak çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedür, etiketli nöronal hücrelerin aksonal projeksiyonlarını ve sinaptik bağlantılarını çoklu gelişim aşamalarında takip etmeyi sağlar.