Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (

Bu prosedürün genel amacı, böcek koku alma yolunun ilk üç sinyal işleme merkezinden koku ile iptal edilen çok birimli nöral aktiviteyi kaydetmektir. Bu, önce bir çekirgeyi özel olarak tasarlanmış bir odada tutarak ve antenlerinden birini elektrofizyolojik kayıtlar için stabilize ederek gerçekleştirilir. İkinci adım, bir cam mikro elektrot imal etmek ve koku uyandıran tepkileri izlemek için bir güneşin tabanına yerleştirmektir.

Çekirge beyninden nöral aktiviteyi kaydetmenin yanında. Koku alma duyu nöronlarından gelen girdiyi işleyen nöral dokuyu ortaya çıkarmak için çok aşamalı bir diseksiyon prosedürü izlenir. Son adım, çekirge ve anten lobundan ve mantar gövdesinden topluluk nöral aktivitesini kaydetmek için çoklu elektrot dizilerinin uygun şekilde yerleştirilmesini içerir.

Sonuç olarak, burada gösterilen hücre dışı kayıt yöntemleri, böcek koku alma yolu boyunca ilk üç işleme merkezinde koku uyarılmış tepkileri karakterize etmek için kullanılır. Bu yöntem, nispeten basit bir omurgasız koku alma sisteminde koku uyandıran nöro tepkiyi karakterize etmek için kullanılmış olsa da, diğer sinir sistemlerindeki topluluk aktivitesini incelemek için de uyarlanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü bu prosedürün elektrot yerleştirme ve bazı diseksiyon adımları gibi bazı önemli yönlerinin öğrenilmesi çok zordur.

Ek olarak, yöntemler çoğunlukla kalitatiftir ve farklı laboratuvarlar bunu zaman içinde farklı şekilde mükemmelleştirmiştir. Bu işleme başlamak için, her iki cinsiyetten de tamamen yetişkin kanatlara sahip, ancak çiftleşme aşamasından önce kalabalık bir koloniden genç bir yetişkin çekirge seçin. Ardından, bacaklarını keserek çekirgeyi kısıtlayın.

Amputasyon bölgelerini doku yapıştırıcısı ile kapatın. Ardından, çekirgeyi göğüs kafesinin etrafına saran küçük bir parça elektrik bandı ile özel olarak tasarlanmış hazneye sabitleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, anten yerleşimi için balmumu platformunda sığ bir oluk açın.

Anteni oluğa yerleştirin ve antenin iki ucunda bati balmumu kullanarak sabitleyin. Bundan sonra, göğüs kafesine bir toprak elektrodu yerleştirin. Kesi bölgesini kapatmak ve topraklama telini yerinde tutmak için Batik balmumu kullanın.

Ardından, stabilize edilmiş çekirge antenini stereo mikroskop altında bir titreşim izolasyon masasına yerleştirin. Koku şişelerinin çıkış hatlarını koku verme tüpüne bağlayın. Koku verme tüpünü antenin birkaç santimetre yakınına yerleştirin, iletilen koku buharları, çekirge anteninin yaklaşık 10 santimetre arkasına yerleştirilmiş bir vakum hunisi ile uzaklaştırılır.

Daha sonra, bir mikro pipet polar ile bir burs, silisik cam kılcal kullanarak cam elektrotları üretin, cam elektrodu keçiboynuzu tuzlu su ile doldurun. Ardından, cam elektrodu motorlu bir mikro manipülatöre bağlı bir mikro pipet tutucusuna yerleştirin. Kayıt senkronizasyonunun tabanının mikroskop altında net bir şekilde görülebildiğinden emin olun.

Elektrodu yavaşça bir syn'in tabanına yerleştirin. Daha sonra sinyali 10.000 kez yükseltin. Bir AC amplifikatör kullanma.

Sinyali 0,3 ila 10,0 kilohertz arasında filtreleyin ve 15 kilohertz örnekleme hızında elde edin. Bir veri toplama sistemi kullanılarak, elektrot uygun şekilde konumlandırıldığında, spontan nöral aktivite tespit edilebilir. Uyaran uyarılmış tepkiler, koku dağıtım tüpünden bir koku darbesi verilerek izlenebilir.

Antene yakın konumlandırılmış ve hücre dışı aktivitedeki değişikliği izleyerek, daha önce açıklandığı gibi kısıtlama prosedürlerini takip etti. Çekirgeyi özel olarak tasarlanmış bir odaya yerleştirin. Çekirge kafasının etrafına bir balmumu kabı inşa ederek diseksiyon işlemine başlayın.

Çekirge kafasının her iki tarafına, antenin yüksekliğine kadar ulaşan iki balmumu kulesi inşa edin. Ardından, her anteni lastik bir contaya sıkıca oturan küçük bir polietilen boru parçasından geçirin. Ardından contaları, bir antenin hareket etmesini önlerken, plastik boru bir antenin tabanına doğru veya ondan serbestçe kayabilecek şekilde mum kulelerine takın.

Daha sonra mikroskop altında, diseksiyon prosedürü sırasında ve sonrasında salin perfüzyonuna izin vermek için keçiboynuzu kafasının etrafına bir balmumu kabı oluşturmaya başlayın. Ağda kabı ağız kısımlarının hemen üzerinde başlamalı, her iki ağda kulesini de kapsamalı ve bileşik gözlerin ötesine uzanmalıdır. Balmumu kabı tamamen inşa edildikten sonra, bir antenin tabanını epoksi reçine kullanarak plastik borunun alt ucuna takın.

Bu, çevreleyen kütikül çıkarıldıktan sonra bile bir antenin yerinde tutulmasını sağlayacaktır. Ağda kabını bu noktadan itibaren tuzlu su çözeltisi ile dolu tutun. Şimdi, ikisi arasındaki merkezi dikdörtgen bölgeyi çıkarın.

Bir anten. Daha sonra, bir antenin tabanındaki bileşik gözleri veya kütikülü rahatsız etmeden komşu bölgelerdeki kütikülü çıkarın. İnce forseps kullanarak, beyni çevreleyen hava torbalarını ve yağ cisimlerini nazikçe çıkarın.

Çekirge beyni artık açıkça görülebilir olmalıdır. Koku alma bilgisini işleyen beyin bölgeleri ikisi arasında yer alır. Bir anten bağırsağı nazikçe çeker ve ince makas kullanarak kesin.

Sonra kanatları çıkarın ve rektumun hemen üzerindeki karın bölgesinde küçük bir kesi yapın. Arka bağırsağı kaba forseps ile çekerek bağırsağı çıkarın. Bu adım, bağırsak hareketinin preparatın dengesini bozmamasını sağlar.

Tuzlu su sızıntısını önlemek için. Karnı kesi yerinin hemen önüne dikiş iplikleri ile bağlayın. Daha sonra, beyni yükseltmek ve elektrofizyolojik için stabilize etmek için ince bir balmumu tabakası ile kaplanmış ince bir tel halkadan yapılmış küçük bir platform kullanın.

Beynin kaydedilmesi, kayıtlardan önce çıkarılması gereken yarı saydam bir kılıfla korunur. Kılıfı zayıflatmak için, balmumu kabını kısmen boşaltın ve beynin yüzeyine az miktarda proteaz dikkatlice yayın. Yaklaşık beş ila 10 saniye enzim uygulamasından sonra, beyni tuzlu su ile iyice durulayın.

Ardından, kılıfı çok nazikçe sıkıştırın ve süper ince forsepslerle yukarı çekerek yırtın ve kayıt alanlarını ortaya çıkarın. Bu prosedürde, çekirge preparatını stereo mikroskop altında bir titreşim izolasyon masasına yerleştirin. Saatte yaklaşık 40 mililitrelik sabit bir tuzlu su perfüzyon hızını koruyun.

Deney boyunca, toprak elektrodu olarak tuzlu su dolu balmumu kabına batırılmış bir klorür gümüş tel kullanın. Tek sensörlü kayıt deneyine benzer şekilde koku verme kurulumunu hazırlayın. Deneyden önce, 200 ila 300 kilo aralığındaki empedansları elde etmek için elektrotları altınla elektrolizle kaplayın.

Ana nöron kayıtları için 16 kanallı bir silikon prob kullanın. Mikroskop altında. Elektrodu bir anten lobunun yüzeyine yakın bir yere yerleştirin ve ideal bir kayıt bölgesinde manuel bir mikrom manipülatörü kullanarak dokuya nazikçe yerleştirin, hücre dışı sinyaller birden fazla kayıt kanalı tarafından alınacak ve yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahip olacaktır.

Kenyon hücre kayıtları için, özel yapım bir bükümlü tel tero, elektrokaplama prosedürlerini takiben tero elektrolizle kullanılır. Silikon prob daha sonra teroyu mantar gövdesinin yüzeyine yerleştirir. Kenya hücrelerinin Samaraları bu bölgenin yüzeysel tabakası ile sınırlı olduğundan, aynı çekirge preparatından hem ana nöron hem de Kenya hücre kayıtları aynı anda yapılabilir.

Kayıt konumunu belirledikten sonra, elektrotların stabilizasyonuna izin vermek için en az 15 dakika bekleyin. Ardından hücre dışı sinyali 15 kilohertz'de alın. 0,3 ila altı kilohertz arasında filtreleyin ve hem spontan hem de uyaran uyandıran 16 kanallı bir AC amplifikatör kullanarak yükseltin.

Bir anten lobundaki projeksiyon nöronlarından çok birimli nöral aktivite gözlemlenebilir. Bir koku alma reseptörü nöronunun iki farklı kokuya verdiği yanıtları gösteren ham hücre dışı voltaj izleri. Burada iki sekizli ve bir H etanol gösterilmiştir.

Çok birimli bir anten lobu kaydından temsili bir hücre dışı iz burada gösterilmektedir. Farklı prensip nöronlarından kaynaklanan değişen genliklerdeki aksiyon potansiyelleri veya ani yükselmeler bu voltaj izinde gözlemlenebilir. Gri kutu ile gösterilen süre boyunca dört saniyelik bir koku darbesi uygulandığına dikkat edin.

Örnek bir mantar gövdesi hücre dışı kaydı burada gösterilmiştir. Koku alma reseptörü nöronları ve temel nöronların aksine, böcek mantarı gövdesindeki Kenyon hücreleri daha düşük temel aktiviteye sahiptir ve kokulara seyrek ve seçici bir şekilde yanıt verir. Bu çok birimli kayıtlardan tek birim yanıtlarını izole etmek için, yayınlanan yazılımı çevrimdışı bir şekilde kullanarak ani bir sıralama prosedürü gerçekleştiriyoruz.

Bu videoyu izledikten sonra, temel nöron ve Kenya hücre spike sıralama örnekleri burada gösterilmektedir. Ekleme koku yolu boyunca ilk üç koku alma merkezinde topluluk nöral aktivitesini karakterize etmek için hücre dışı çok birimli kayıtların nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.