Topikal Transgenik Rats nesil tarafından Utero Elektroporasyon ve In vivo Biyoparlaklık Eleme
24 Eylül 2013
Genler yetişkin hayvanlarda davranış veya nöropatoloji sonraki çalışmalar için nöronal bağlantı hızlı ve hedeflenen değişiklikleri mümkün kılmak için, E16 de utero elektroporasyon (IUE) in ile korteks veya sıçanın hipokampusun gelişimi sırasında manipüle edilebilir. IUE başarı kontrolü için in vivo görüntüleme doğum sonrası ko-transfekte edilmiş lusiferaz aktive biyolüminesans ile gerçekleştirilir.
Bu prosedürün genel amacı, daha fazla analiz için utero elektroporasyonlu sargıları başarılı bir şekilde seçmektir. Bu, önce hedef DNA'nın enjekte edilmesi ve ardından beyinde seçilen alan için bir in utero elektroporasyon gerçekleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Elektropore embriyolar annenin rahmi içinde gelişir ve normal olarak canlı olarak doğarlar.
2D görüntüleme, tanımlanmış doğum sonrası zaman noktalarında başarılı bir şekilde elektroporasyona maruz kalmış hayvanları tanımlamak için kullanılır. Son olarak, hedeflenen alan 3D görüntüleme ile daha ayrıntılı olarak karakterize edilir. Sonuç olarak, bu topikal olarak transgenik sıçanlar, bozulmuş nörogelişimin yetişkin davranışı üzerindeki sonuçlarını göstermek için davranışsal testlerde kullanılabilir.
Elektroporasyon yerleşik bir teknik olsa da, topikal olarak transgenik yetişkin hayvanların nesli için yaygın olarak kullanılmamıştır. Bu kısmen gerekli teknik becerilerden kaynaklanmaktadır, ancak aynı zamanda yalnızca başarılı elektroporasyonlu yenidoğan yavruları seçme konusundaki mevcut yetersizliğimizden de kaynaklanmaktadır. Nötr bir elektro sıçanların başarılı in vivo bios özü görüntülemesini sağlamak için canlı in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak bu soruna bir çözüm sunuyoruz.
Lucifer ışınları bildirilen gen ko-elektroporasyonludur. Lüminesans algılama, nominal hücrelerin yaklaşık konumunu izlemek için Luciferian enjeksiyonu ile etkinleştirilebilir. Bu daha sonra başarılı bir şekilde elektroporasyonlu kırmızı patlamaların seçilmesine izin verir.
Başlamak için, utero elektroporasyon için gerekli steril malzemeleri bir araya getirin. Ardından, hedef D-N-A-G-F-P vektörü, lusiferaz vektörü ve hızlı yeşil boyayı içeren DNA çözeltisini hazırlayın. ISO flor anestezisi altında, enjekte edilecek embriyoyu görselleştirmek için uterusu açığa çıkarın.
İnce bir cam iğne kullanarak, DNA çözeltisini embriyonun lateral ventriküllerinden birine enjekte edin. Üst kortikal tabakalardan oluşan bir hücre popülasyonunu vurmak için, embriyonun başının etrafına yedi milimetrelik bir elektrot yerleştirin ve pozitif elektrotu hafif bir dorsal lateral eğilim ile ventrikülün üzerine yerleştirin. Hipokampal hücreleri hedeflemek için ayak pedalına basarak kare dalga darbe elektroporasyonu ile elektroporasyonu gerçekleştirin.
Pozitif elektrodu enjekte edilen ventrikülün karşı tarafına yerleştirin. Elektroporasyondan önce, önce Lucifer sodyum tuzunu PBS'de mililitre başına 10 miligram konsantrasyona seyreltin ve steril filtrasyon ile sterilize edin. Tartıdan sonra, görüntüleme prosedürüne başlamak için Lucifer'i enjekte etmeden önce karnı yukarıda ve hafifçe gerilmiş bir yavru tutun.
Lucifer enjekte edilen yavrular uyuşturulur ve Ivis spektrum cihazı içinde yüzüstü pozisyona yerleştirilir. İlk olarak, Ivis toplama kontrol panelinde çalışarak hangi yavruların başarılı bir şekilde elektroporasyona tabi tutulduğunu belirlemek için 2D biyolüminesans görüntüleri gereklidir, ölçümün başında tepegöz fotoğrafları çekmek için biyolüminesan görüntüleme modunu seçin. Fotoğraf ayarını kontrol edin ve gruplamayı orta seviyeye ve F-stop'u sekize ayarlayın, odak ayarı altında Konu yüksekliğini kullan'ı seçin.
Ardından, emisyon filtresinin açılmasını ve gruplamanın orta seviyeye ulaşmasını engellemek için uyarma filtresini ayarlayın. F-stop bir olarak ayarlanmalıdır ve sahne seviyesi veya görüş alanı bir 2D görüntü elde etmek için ayarlanmalıdır. 180 saniyelik lüminesans maruz kalma süresi ile, pozitif yavruların elektroporasyonlu alanları daha sonra ateşböceği lusiferaz ayarlarını takiben 3D görüntüler çekilerek daha fazla araştırılır.
İlk olarak, görüntülemenin başlangıcında bir tepegöz fotoğrafı elde etmek için fotoğraf seçeneğinin seçildiğini onaylayın. Biyolüminesans ölçümünden önce hayvanın yüzeyini taramak için, iki haftaya kadar olan yavrular için yapı seçeneğini seçin. Aşağıdaki emisyon filtreleri ve maruz kalma süreleri, yaşlı hayvanlarda sinyal gücündeki azalma nedeniyle seçilir, P 20'den daha yaşlı sıçanlarda en iyi üç emisyon filtresi için maruz kalma süresi artırılır.
Ardından, sahne seviyesini benning'den orta'ya ve F'den durağa bir olacak şekilde ayarlayın ve 3D görüntüyü elde edin. Görüntülemeden sonra, fareleri birbirinden ayırt etmek ve Ivis canlı görüntüleme resimleriyle eşleştirmek için farklı kulak delikleri ile işaretleyin. Son olarak, tamamen iyileşene kadar hayvanı ısıtılmış bir yüzeye çıkarın.
3D görüntüler, Ivis spektrum sistemine önceden yüklenmiş canlı görüntü yazılımı kullanılarak oluşturulur. İlk adım, yüzey topografyasını yeniden yapılandırmaktır. Bunu yapmak için, ilgilenilen bir bölgeyi kırpın ve eşiği %20 ile %30 arasında ayarlayın: Her dalga boyu ayarı için %10'luk bir görüntü eşiği ile beyin dokusu için DLIT 3D rekonstrüksiyonunu başlatın.
3B filmler oluşturmak için, canlandır düğmesini seçin 3B araç çubuğunda, 3B görüntünün yönlendirmesini ve yakınlaştırmasını istediğiniz gibi değiştirin. Ardından, bir konumdan veya yönden diğerine geçişi izlemek için kayıt düğmesine basın. Bu örneklerde, bir lusiferian enjeksiyonundan sonra görüntülenen P yedi sıçan, elektroporasyon başarısına bağlı olarak ya lüminesans sinyali göstermedi, ya zayıf bir sinyal ya da güçlü bir lüminesans sinyali gösterdi.
Bu görüntüler, aynı sıçanda ardışık biyolüminesans ölçümlerinin bir zaman çizelgesini gösterir ve uzun bir algılama penceresini gösterir. Burada 2D görüntüler, korteks veya hipokampusa başarılı bir elektroporasyonu göstermektedir. Hedeflenen alanlar, hem kortikal hem de hipokampal elektroporasyonlu hayvanlarda 3D görüntüleme kullanılarak daha da görselleştirilir.
Bu video, başarılı bir şekilde elektroporasyona tabi tutulan alanı birden fazla perspektiften göstermektedir. Bu örnekte, canlı hayvanda 2D ve 3D görüntülemeden tanımlanan hedeflenen konumlar, diseke edilen beyinde biyolüminesans ve GFP epi floresan tespiti yoluyla daha fazla doğrulanmıştır. Aynı başarılı elektroporasyonlu sıçan beyninden alınan bu görüntü, doğru şekilde gerçekleştirildiğinde P 14'te GFP eksprese eden hücrelerin ayrıntılı bir görünümünü göstermektedir.
Bu yöntem, nörogelişimsel kusurların davranışsal ve nöropatolojik sonuçlarının incelenmesine izin verir. Yalnızca başarılı bir şekilde elektro dereceli sıçanların seçilmesi, maliyetleri ve çabayı büyük ölçüde azaltır. Bu teknikle başarı pratik gerektirir ve değişken motilite ve etkinlik oranlarına sahiptir.
Çekirdek elektro GFP'nin immünohistolojisi, davranışsal sonuçların post-hoc düzeltilmesi için anatomik çözünürlüklerde tam transfeksiyon alanını belgelemek için önemlidir.
Genel Bakış
Bu çalışma, E16'da rahim içinde elektroporasyon (IUE) yoluyla sıçan korteks ve hipokampustaki genleri manipüle etmek için bir yöntem sunar. Teknik, nöronal bağlantılarda hedefli değişikliklere olanak tanır ve yetişkin sıçaklarda daha sonraki davranışsal ve nöropatolojik çalışmaları kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Genetik Mühendislik
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Rahim içinde elektroporasyon, gelişmekte olan embriyolara DNA tanıtmak için kullanılan bir tekniktir.
- Başarılı elektroporasyon, araştırma için transgenik hayvanların üretilmesine yol açabilir.
- Doğum sonrası görüntüleme, başarılı elektroporasyonu tanımlamak için kritik öneme sahiptir.
- Biyolüminesan görüntüleme, canlı hayvanlarda gen ekspresyonunu izlemek için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Başarılı elektropore edilmiş sıçakların daha fazla analiz için güvenilir bir şekilde seçilmesi için bir yöntem geliştirmek.
- Elektroporasyon başarısını izlemek için biyolüminesan görüntülemeyi kullanmak.
- Nörogelişimsel modifikasyonların davranışsal sonuçlarını araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyonun lateral ventriküllerine hedef DNA enjeksiyonu.
- Belirli beyin bölgelerine hedeflemek için kare dalga darbe elektroporasyonunun uygulanması.
- 2D ve 3D biyolüminesan teknikleri kullanılarak doğum sonrası görüntüleme.
- Görüntüleme ve histolojik analiz yoluyla elektropore edilmiş alanların karakterizasyonu.
Ana Sonuçlar
- Biyolüminesan görüntüleme yoluyla başarılı şekilde elektropore edilmiş yavruların tanımlanması.
- 3D görüntüleme, hedeflenen beyin alanlarının ayrıntılı görselleştirilmesini sağlamıştır.
- Canlı hayvanlarda gen ekspresyonunu zaman içinde izleme yeteneği gösterilmiştir.
- Araştırma için yalnızca başarılı elektropore edilmiş sıçakların seçilmesinin önemi vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- Yöntem, davranışsal çalışmalar için genetik olarak modifiye edilmiş sıçakların etkili seçilmesine olanak tanır.
- Canlı görüntüleme, transgenik hayvan üretiminin verimliliğini artırır.
- Daha fazla araştırma, nörojeleşimsel bozuklukların davranış üzerindeki etkilerini araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method addresses a key bottleneck in behavioral neuroscience: the inability to non-invasively confirm successful in utero electroporation in postnatal animals. By enabling longitudinal bioluminescence tracking of transfected cells, it improves predictive confidence in target validation and reduces attrition in preclinical model generation. The approach supports mechanistic de-risking by linking early neurodevelopmental interventions to adult phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses in developing neural circuits.
- Operational Value: Facilitates selection of animals with sufficient transfection for biological effect detection.
- Strategic Value: Supports target de-risking by correlating early gene manipulation with later behavioral phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative bioluminescence readouts to standardize transfection efficiency across litters.
- Operational Value: Enables non-invasive, longitudinal monitoring of gene expression up to 5 weeks postnatal.
- Strategic Value: Improves assay reproducibility for downstream behavioral and neuropathological screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by tracking gene expression from neurodevelopment to adulthood.
- Operational Value: Allows correlation of early transfection with long-term outcomes, such as amphetamine hypersensitivity at 3 months.
- Strategic Value: Enhances translational continuity by validating target engagement in vivo over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical behavioral assessment, enabling iterative refinement of mechanistic hypotheses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling spatially and temporally controlled gene delivery in embryonic brain.
- Screening: Delivers assay-ready models with quantifiable transfection success for compound or phenotype screening.
- Analytics: Generates 2D and 3D bioluminescence data to compare transfection efficiency and spatial distribution.
- Translational Research: Connects embryonic manipulation to adult behavioral readouts, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating topically transgenic rats across multiple targets and brain regions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false-negative models.
- Operational Value: Standardizes prenatal transfection success assessment, reducing variability in behavioral cohorts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing resource investment in unsuccessfully electroporated animals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed neurodevelopmental engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, electroporation parameters, and postnatal imaging protocols.
- Dependent on access to IVIS Spectrum or comparable bioluminescence imaging systems with 3D reconstruction capability.
- Necessitates standardization of luciferin dosing, anesthesia, and animal handling for reproducible signal detection.
- Adaptation across models may require optimization of electrode placement and DNA construct design.
- Practical limitations include variable transfection efficacy and the need for postnatal screening to confirm success.
