Name: Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, iki foton mikroskobisi ile fare kortikal nöronlarında deneyim bağımlı moleküler değişiklikleri canlı izleme yöntemini. ARC geni ifadesini gerçek zamanlı takip ederek sinir plastisitesi mekanizmalarını araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yardımı filme yönelik cerrahi filme ekipmanları, D. Kwon L. Belluscio teşekkür etmek istiyorum, video için K. Liu tüm arka plan müziği için yardım düzenleme ve K. MacLeod. KW İntramural Araştırma Programları NIMH Bölümü ve Genler, Biliş ve Psikoz Programı cömert desteğini onaylar. Bu çalışma NIMH İntramural Araştırma Programı (VC, YY, SMKW) ve intramural Klinik ve Biyolojik Araştırma Programı NIAAA Bölümü (VC, RMC, DML) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Ruh Sağlığı Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Ulusal Enstitüsü tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre idi. 1. Pre-operatif Hazırlama <ol><li> Aseptik cerrahi öncesi sıcak boncuk sterilizatör tüm araçları temizleyin,% 70 etanol ile cerrahi alan temiz ve temiz açılan bezler indirdi. Steril eldiven giyin. Ml / g, intraperitonially 0.02 verilen taze hazırlanmış% 1.2 avertin çözeltisi ile hayvan anestetize. Alternatif olarak, pasif bir çöpçü devreli bir burun konisi, indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5, izofluran ile gaz ile uyutmak. Tam sedasyon sağlamak için kuyruk veya ayak tutam kullanarak anestezi seviyesini kontrol edin. </li><li> Steril oftalmik merhem ile hayvanın göz kapağı ve taze hazırlanmış deksametazon enjekte edilir (0.2 mg / kg) ve karprofen (5 mg / kg) subcutaneouslBeyin şişme ve iltihaplanmayı önlemek için 11 y. Kulakları arasındaki kafatası üzerinde saç Tıraş ve betadin fırçalayın ve% 70 etanol üç alternatif bezlerle cildi sterilize. </li><li> 37 hayvan seti altında bir su sirkülasyon ısıtma pedi ile, earbars olan bir stereotaksik cerrahi aşamasında hayvan monte ° C. Düzenli hayvanın anestezi düzeyleri kontrol etmek ve gerektiğinde orijinal anestezik dozu tamamlamak. </li><li> Alan uyuşturmak için kafa derisi deri altına% 0.5 marcain 200 ul enjekte edilir. Cilt kesilirken ve kafatası üzerinde flep kaldırmak. Periost çıkarın ve temiz pamuklu çubukla kurulayın. </li></ol> 2. Kronik Kranial Pencere Cerrahisi <ol><li> Yavaşça ilgi beyin bölgesi üzerinde 3-5 mm çaplı daire özetledi 0,5 mm çapak ile yüksek hızlı bir diş matkap kullanın. Düzenli, temiz pamuklu çubukla steril% 0.9 salin ve uzak net kemik tozu ile sondaj sahasını ıslak. Kemik kanamaları, g kullanınelfoam taşma kurulayın ve bunu durdurmak için beklemek steril serum fizyolojik ile çimlendirilmiş. </li><li> Son kemik tabakası ulaşıldığında, ince uçlu forseps ile kemik ada kaldırın ve çıkarın. Penceresinde bir kemik sütür geçerse kemiğin alt rafa Dura ekleri karşılaştı olabilir. Kemik kapak kaldırıldığında gibi Bu nazikçe kaldırılması gerekir. </li><li> Rulo yüzeyi temizlemek ve durdurmak için herhangi dural kanama için beklemek maruz dura üzerinde hafifçe jel köpük nemlendirilmiş Kritik adım:. Tüm dural kanama durana kadar devam etmeyin. Kraniyal pencere içine hapsolur Kan genellikle opak bir pencere açar. </li><li> Dura yukarıda dura kaldırarak, özellikle kalın olduğu ilgi bölgesi bir yer altında ise, gerekli olabilir. Bu durumda, hafifçe çok ince forseps ile aşağıdaki pia gelen dura ayırmak, ince forseps bir çift ile kaldırdı dura küçük bir kesi yapmak, sonra kesik kenarları kavrayın ve yavaşçadura bölünmüş. Dura ince fakat kuvvetli, yani dura sağlam kenarları ile beyin dilim için dikkatli olun. </li><li> Steril ACSF veya steril serum fizyolojik ile alanı durulayın. </li><li> . Dura veya pia üzerinde steril bir cam lamel (3-5 mm) Kritik adım Lay: çevreleyen kafatası eğrileri önemli ölçüde ise, dura veya pia bölgelerde lamel ile yakın temas yapmazdım yerleri doldurmak için Kwiksil 12 yapıştırıcı kullanın bilgidir olmayacaktır. </li><li> Elastomer yapıştırıcı ve cam lamel kenarlarını kaplayacak şekilde Siyanoakrilat jeli kullanın. . Herhangi bir siyanoakrilat jel beyin yüzeyine temas etmesine izin vermeyin: siyanoakrilat jel veya krazyglue ve diş çimento karışımı ile tüm maruz kafatası Kritik adım örtün. </li><li> Kafatasının karşı ucuna bir ısmarlama metal kafa sabitleme çubuğu gömün. </li><li> Ketoprofen bir İntraperitoneal enjeksiyon, 5 mg / kg fo sonra, sıcak bir iyileşme odasına hayvan Dönüşr ağrı yönetimi. İki gün daha operasyon sonrası için analjezik devam edin. </li><li> Ameliyat sonrası iyileşme iki hafta sonra, (indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5) izofluran ile hayvan uyutmak, bir baş-fiksasyon çerçeve ile ısmarlama bir mikroskop aşamasında monte ve optik netlik için kraniyal penceresini kontrol edin mavi ışık ile aydınlatma altında. Beyin yüzeyi damar netlik kraniyal pencere kalitesi önemli bir göstergesidir. Damar kenarları keskin olarak tanımlanmış ise, pencereyi kullanılabilir olması muhtemeldir. Iki hafta ameliyat sonrası iyileşme süresi cerrahi kurtarmak için hayvan için yeterli zaman tanımak için tavsiye edilir. Kraniyal pencereler genellikle temizlemek ve iyileştirmek bu süre içinde, ve dura kafatası veya kalınlaşma büyütme penceresi kalitesini düşürür kadar ay ek hafta optik saydam kalır. </li></ol> 3. İki foton Mikroskobu, Taramalı Davranış Protokolü ve Lazer <ol><li> Net c Hayvanlarranial pencere çevresel bir uyarıcı maruz kalan ya da bir davranış antrenman tabi tutuldu ve daha sonra maksimal Arc-GFP tanımının o zaman sonra yansıma olacaktır. Bir davranış protokolü başlamadan önce, hayvan bazal Arc-GFP ifade düzeylerinde gün-gün varyasyonu azaltmak için tutarlı bir ev kafes ortamında tutulmalıdır. </li><li> Ilgi beyin bölgesine bağlı olarak, davranışsal eğitim veya çevresel stimülasyon paradigmaları başlayın. Örneğin, hayvanlar ardışık gün içinde farklı görsel ortamlara maruz kalabileceği ve görsel korteks 10 uyarıcı-özel yanıtlar tanımlamak için görsel uyarı sonrasında her gün görüntülenmiş. </li><li> Nöronlarda Arc-GFP floresan genellikle iki saat stimülasyonu sonrası doruk düzeyine ulaşır. Deneysel çizelgesi doruğa floresan seviyelerde nöronlarda Arc-GFP tanımının algılama için optimize edilebilir. </li><li> Davranışsal bir antrenmandan ya environmenta sonral uyarım tamamlandığında, (indüksiyonu için% 5, bakım için% 1.5), izofluran ile hayvan anestetize ve iki-fotonlu mikroskop altında kafa tespit çerçeve ile ısmarlama mikroskop aşamasında hayvan monte edin. </li><li> Hayvanın baş pozisyonu kafatası üzerinde implante metal çubuk kullanarak, sahne doğrudan bağlanan kafa fiksasyon çerçeveye sabitlenir. Isoflurane ve oksijen kesintisiz bir burun yoluyla fare için temin edilir. Vücut sıcaklığı bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur. </li><li> Mikroskop dedektörler karanlık bir odada iki foton lazer tarama yaparak ortam ışığı korunur emin olun. Görüntüleme için bir 20x veya 25x (1.05 sayısal diyafram) suya daldırma objektifi kullanın. Birincisi, epi-floresan aydınlatma altında, gelecekte görüntü uyum için bir CCD kamera ile ilgi beyin bölgesi üzerinde yüzey damar desenleri bir görüntü kazanır. </li><li> 3-D görüntü yığını elde etmek için tarama iki foton lazer başlatın. Bir Olympus FV1000MPE çoklu foton mikroskop bizim kurulum kullanılmaktadır. Iki-fotonlu lazer uyarma dalga uzunluğu 920 nm &#39;de yer almaktadır, ve objektif yayılan lazer gücü yaklaşık 50 mW ayarlanır. Yayılan floresans eşzamanlı örneği yakın yerleştirilmiş harici iki kanallı photomutiplier algılama sistemi kullanılarak yeşil ve kırmızı kanalları (570 nm&#39;de dikroik ayna, 495-540 nm ve 570-625 nm bariyer filtreler), tespit edilmiştir. Doku oto-floresans kanal 13, 14 hem görünür, oysa Arc-GFP floresan sadece yeşil kanal görünür. </li><li> Tipik görüntü yığınlarını yaklaşık 320x320x100 mikron boyutları (en x boy x derinlik), 0,5 mikron / piksel yatay çözünürlük ve 3 mikron / piksel dikey çözünürlüğe sahip. </li><li> Görüntü yığını aldıktan sonra, onun ev kafesine hayvan dönün. Sonraki davranış ve görüntüleme oturuma kadar hayvan rahatsız etmeyin. Desir olarak gün boyunca davranış ve görüntüleme işlemi tekrarlayıned. Geri aynı görüntüleme konuma yönlendirmek için önceden edinilmiş beyin yüzeyinde kan damarı resmi kullanın. </li></ol>

<ol><li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li>
<li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li>
<li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li>
<li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li>
<li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+growth+factor+and+activity-regulated+gene%2C+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li>
<li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li>
<li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+Arc%2C+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Mice.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li>
<li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li>
<li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

In vivo görüntüleme yöntemi burada açıklanan canlı hayvan birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri Arc gen ekspresyon değişiklikleri tekrar muayene sağlar. Çeşitli davranışsal deneyimler yanıt bireysel nöronların nöral plastisite ile ilgili moleküler dinamiği hakkında bilgi edinmek için etkin ve çok yönlü bir yöntemdir. Böyle situ hibridizasyon ve immün olarak Standart histokimyasal yöntemler çözünürlüğü 3 tek hücreli ulaşmak, ancak birden fazla gün içinde...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> FV1000 çoklu foton lazer tarama mikroskobu </td><td> Olimpos </td><td> FV1000MPE </td><td> Görüntüleme </td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> Fareler için Stereotaktik cerrahi aşamasında </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> 20X veya 25X su immersiyon objektif </td><td> Olimpos </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Görüntüleme </td></tr><tr><td> Baş-fiksasyon çerçeve Mikroskop sahnede </td><td> Özel yapılmış </td><td> N / A </td><td> Görüntüleme </td></tr><tr><td> Güzel forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-20 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> Diş matkap çapak </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 19007-05 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> Görüntüleme </td></tr></tbody></table>

kortikal nöronlar in vivo İki foton of görüntüleme deneyimi bağımlı moleküler değişiklikler

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Deneyimi yanıt olarak değiştirmek için beyin yeteneği sağlıklı beyin fonksiyonu için önemlidir ve bu süreçte anormallikler beyin bozuklukları 1,2 çeşitli katkıda. Iyi beyin devrelerinin bir hayvanın deneyimi tepki hangi mekanizmalar anlamak için canlı hayvan, zaman uzun bir süre boyunca, nöronların belirli bir set deneyimi bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için yeteneği gerektirir. Deneyim ve ilişkili nöral aktivitenin nöronlar 1,2 gen ekspresyon değişiklikleri tetiklemek için bilinen iken, yöntemlerin çoğu bu değişiklikleri algılamak için birden fazla gün içinde aynı nöronların tekrar gözlem izin vermez ya da bireysel nöronlar 3 gözlemlemek için yeterli çözünürlüğe sahip değilsiniz , 4. Burada, üzerinde bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı gen ekspresyon değişiklikleri izlemek için genetik olarak kodlanmış floresan muhabiri olan iki foton mikroskopi vivo birleştiren bir yöntem tarif<html> gün-gün deneyim tabii. Köklü deneyimi bağımlı genlerden biri Aktivite regüle sitoskeletal ilişkili protein (Arc) 5,6 olduğunu. Arc transkripsiyon hızla ve son derece yoğunlaştırılmış nöronal aktivitenin 3 ile tetiklenen, ve onun protein ürünü glutamat reseptörleri ve uzun vadeli sinaptik plastisite 7 endositoz düzenler. Arc ifadesi yaygın 3 özel davranış katılan nöral devrelerin eşlemek için bir moleküler belirteç olarak kullanılmıştır. Bu çalışmaların çoğunda, Arc ifadesi sabit beyin bölümlerinde situ hibridizasyon veya immünohistokimya saptandı. Bu yöntemleri Arc ifade Arc ifade hücresel desenleri gün boyunca tekrarlanan ya da farklı deneyimler çoklu atakları ile değişebilir incelenmiştir değildi nasıl davranışsal deneyim, sonra eksitatör nöronların bir alt kümesi lokalize olduğunu göstermiştir rağmen. ntent &quot;&gt; in vivo iki foton mikroskopi canlı beyin 8,9 deneyim bağımlı hücresel değişiklikleri incelemek için güçlü bir yol sunar. iki foton mikroskopi ile canlı nöronlar Arc ifade muayene etkinleştirmek için, önceden oluşturulan bir knock- fare doğrultusunda bir GFP muhabiri endojen Arc organizatörü 10 kontrolü altında yerleştirilir. hangi Bu protokol cerrahi hazırlıkları ve canlı hayvan nöronal toplulukları deneyim-bağımlı Arc-GFP ifade desenleri izlemek için görüntüleme yöntemleri anlatılmaktadır. Bu yöntemde , kronik kranial pencereler ilk ilgi kortikal bölgeler üzerinde Arc-GFP fareler implante edildi. Bu hayvanlar daha sonra art arda birkaç gün boyunca istenilen davranış paradigmaları sonra iki foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bu yöntem taşıyan hayvanların genel olarak uygulanabilir olabilir diğer floresan gazetecilere deneyim-bağımlı moleküler değişikliklere 4.

<html> Bu protokol canlı hayvanların bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için bir yöntem açıklanır. Kronik bir kraniyal pencere ilk gen floresan muhabiri taşıyan bir fare bir ilgi kortikal bölge üzerinde oluşturulur. İki foton mikroskopi sonra tek tek nöronların davranışsal indüklenmiş moleküler değişiklikleri gözlemlemek ve birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri tür değişiklikler (Şekil 1) izlemek için çeşitli davranışsal modeller ile birleştiğinde olab...

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir. An<em&gt; In vivo</em&gt; Iki foton görüntüleme yöntemi genetik olarak kodlanmış gazetecilere yoluyla bireysel kortikal nöronların bu tür moleküler değişiklikleri izleme sağlayan burada tanımlanmıştır.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Nöronlarda yaşanan bağımlı moleküler değişiklikler, beynin davranışsal zorluklara yanıt olarak uyum sağlama yeteneği için gereklidir. Burada, genetik olarak kodlanmış raportörler aracılığıyla bireysel kortikal nöronlardaki bu tür moleküler değişikliklerin izlenmesine izin veren bir in vivo iki foton görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. İyi bilinen deneyimli bağımlı genlerden biri, aktivite regüle edilmiş hücre iskeleti ile ilişkili protein veya arktır.ARC'nin transkripsiyonu, yoğunlaştırılmış nöronal aktivite ile hızlı ve yüksek oranda indüklenir Canlı nöronlardaki ark ekspresyonunun iki fotomikroskopi ile incelenmesini sağlamak için, bir GFP raportörünün endojen ark promotörün kontrolü altına yerleştirildiği bir knockin fare hattı kullanıyoruz. Bu protokol, canlı hayvanda nöronal topluluklarda deneyimlenen bağımlı ark GFP ekspresyon paternlerinin izlenmesi için cerrahi hazırlıkları ve görüntüleme prosedürlerini tanımlar. İlk olarak, bu teknik için gereken hayvan hazırlığını açıklayacağız.Bir ark GFP hayvanı kafatası penceresi ameliyatına tabi tutulacak ve ameliyattan yaklaşık iki hafta sonra iyileşecektir. Daha sonra kafatası pencere kalitesi kontrol edilir ve eğer nöronlar bu pencere aracılığıyla görüntülenebiliyorsa, hayvan davranışsal ve iki foton görüntüleme deneyinin başlangıcına kadar uygun bir ortama yerleştirilir. Bu hayvanlar daha sonra iki fotomikroskopi ile tekrar tekrar görüntülenir.İstenen davranışsal paradigmalar birkaç gün içinde tamamlandıktan sonra, tüm aletleri sıcak bir boncuk sterilizatöründe temizleyin. Aseptik cerrahiden önce ameliyat bölgesini %70 etanol ile temizleyin ve temiz damla bezleri koyun. Hayvanı, gram intraperitoneal başına 0.02 mililitre olarak verilen% 1.2 Everton çözeltisi ile uyuşturun.Tam sedasyonu sağlamak için kuyruk veya ayak parmağı tutamları kullanarak anestezi seviyesini kontrol edin. Hayvanın gözlerini steril oftalmik merhem ile örtün ve kilogram başına 0.2 miligram Deksametazon ve deri altına kilogram başına beş miligram carprofen enjekte edin. Kulaklar arasındaki kafatasının üzerindeki kılları tıraş edin ve cildi Betadine ovma ve% 70 Etanol'lük üç alternatif çubukla sterilize edin, hayvanı 37 dereceye ayarlanmış bir su sirkülasyonu ısıtma yastığı ile kulak çubukları ile stereotaksik bir cerrahi aşamasına monte edin.Hayvanın anestezi seviyelerini düzenli olarak kontrol edin ve gerektiğinde orijinal anestezik dozunu tamamlayın. Bölgeyi uyuşturmak, cildi kesmek ve kafatasının üzerindeki cilt flebini çıkarmak için kafa derisi derisinin altına 200 mikrolitre% 0.5 Marcaine enjekte edin. Periosteumu çıkarın ve alanı temiz pamuklu çubuklarla kurulayın.İhtiyaçlarınıza bağlı olarak, ilgilendiğiniz beyin bölgesi üzerinde üç ila beş milimetre çapında bir daireyi nazikçe çizmek için 0,5 milimetre çapaklı yüksek hızlı bir diş matkabı kullanın. Delme alanını periyodik olarak steril% 0,9 tuzlu su ile ıslatın ve temiz pamuklu çubuklarla kemik tozunu temizleyin. Kemik kanarsa, kanamayı temizlemek için steril tuzlu su ile önceden ıslatılmış jel köpük kullanın ve durmasını bekleyin.Son kemik tabakasına ulaşıldığında, ince uçlu forsepslerle kemik adasını kaldırın ve çıkarın. Kemiğin alt rafına dural ataşmanlarla karşılaşabilirsiniz. Pencerenizde kemik dikiş geçerse, bunlar nazikçe çıkarılmalıdır.Kemik flebi kaldırılırken, yüzeyini temizlemek için nemli ve jel köpüğü açıkta kalan duranın üzerine nazikçe yuvarlayın ve herhangi bir dural kanamanın durmasını bekleyin. İlgilendiğiniz bölge özellikle kalın bir dura bulunan bir yerin altındaysa, üzerindeki duranın çıkarılması gerekebilir. Bu durumda, durayı çok ince forsepslerle aşağıdaki PIA'dan nazikçe ayırın.Başka bir çift ince forseps ile kaldırılan durada küçük bir kesi yapın. Ardından kesilen kenarları kavrayın ve durayı yavaşça ayırın. Dura ince ama güçlüdür, bu nedenle duranın sağlam kenarları ile beyni kesmemeye dikkat edin.İlgilendiğiniz bölgeden geriye doğru ve uzakta çalışırken, bölgeyi steril A BOS veya steril tuzlu su ile bolca durulayın. Çevredeki kafatası, açıkta kalan dura veya pia etrafında önemli ölçüde kıvrılıyorsa, görüntülenmeyecek bölgelerde pencere kapağı kayması ile yakın temas etmeyecek boşlukları doldurmak için hızlı hücre yapıştırıcısı kullanın. Daha sonra steril bir cam örtü yerleştirin, hafifçe dura veya pia'nın üzerine yerleştirin.Elastomer yapıştırıcıyı ve camın kenarlarını kaplamak için Sano akrilik jel kullanın. Kapak kayması. Açıkta kalan tüm kafatasını Sano siyanoakrilat jel veya çılgın bir yapıştırıcı ve diş çimentosu karışımı ile kaplayın.Kafatasının diğer ucuna özel yapım bir metal kafa sabitleme çubuğu yerleştirin. Ağrı yönetimi için kilogram başına beş miligram intraperitoneal ketoprofen enjeksiyonundan sonra hayvanı ılık bir iyileşme odasına geri koyun. Ameliyattan sonra iki gün boyunca analjezik devam edin.Ameliyat sonrası iyileşmeden iki hafta sonra, hayvanı ISO flor ile uyuşturun. İndüksiyon için% 5, bakım için% 1.5. Kafa sabitleme çerçevesi ile özel yapım bir mikroskop aşamasına monte edin ve optik netlik için kraniyal pencereyi kontrol edin.Mavi ışıkla aydınlatma altında, beyin yüzeyi, kan damarı netliği, kraniyal pencere kalitesinin oldukça göstergesidir. Kenarları keskin bir şekilde tanımlanmışsa, pencerenin kullanılabilir olması muhtemeldir. Davranışsal bir protokole başlamadan önce, günlük değişimi en aza indirmek için hayvan tutarlı bir ev kafesi ortamında tutulmalıdır.Başlangıç yayında, GFP ekspresyon seviyeleri, ilgilenilen beyin bölgesine bağlı olarak davranışsal eğitim veya çevresel stimülasyon paradigmalarını başlatır. Örneğin, hayvanlar, görsel korteks yayındaki farklı nöron popülasyonlarını görüntülemek için ardışık günler boyunca farklı görsel ortamlara maruz bırakılabilir, nöronlardaki GFP floresansı tipik olarak stimülasyondan iki saat sonra en yüksek seviyesine ulaşır. Deneysel zaman çizelgesi, nöronlarda en yüksek floresan seviyelerinde ARC GFP ekspresyonunun tespitini kolaylaştırmak için optimize edilebilir.Davranışsal bir eğitim seansı veya çevresel stimülasyon tamamlandıktan sonra, hayvanı indüksiyon için ISO flor %5, bakım için %1,5 ile uyuşturun. Hayvanı, kafa sabitleme çerçevesi ile özel yapım mikroskop aşamasına monte edin. İki foton mikroskobu altında, hayvanın kafa pozisyonu, kafatasına implante edilmiş metal çubuk kullanılarak doğrudan sahneye bağlanan kafa sabitleme çerçevesine sabitlenir.ISO flor ve oksijen, bir burun konisi aracılığıyla fareye sürekli olarak verilir. Vücut ısısı bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur. Mikroskop dedektörlerinin ortam ışığından korunduğundan emin olun.Karanlık bir odada iki foton lazer taraması yaparak, görüntüleme için 20 x veya 25 x 1.05 sayısal açıklıklı suya daldırma lensi kullanın. İlk olarak, epi floresan aydınlatması altında, bir CCD kamera ile ilgilenilen beyin bölgesi üzerindeki yüzey kan damarı modellerinin bir görüntüsünü elde edin. Gelecekteki görüntü hizalaması için, bir 3D görüntü yığını elde etmek için iki foton lazer taraması başlatın.İki foton lazerin uyarma dalga boyu 920 nanometre ve güç yaklaşık 50 olarak ayarlanmıştır. Miliwatt yayılan floresan, hem yeşil hem de kırmızı kanal yayında aynı anda tespit edilir. GFP floresansı sadece yeşil kanalda görülürken, doku otofloresansı her iki kanalda da görülür.Tipik görüntü yığınları yaklaşık 320 x 300, 20 x 100 mikrometre boyutlara, piksel başına 0,5 mikrometre yatay çözünürlüğe ve piksel başına üç mikrometre dikey çözünürlüğe sahiptir. Görüntü yığınını aldıktan sonra, hayvanı ev kafesine geri koyun. Bir sonraki davranış ve görüntüleme seansına kadar hayvanı rahatsız etmeyin.Davranışı ve görüntüleme prosedürünü günler boyunca istediğiniz gibi tekrarlayın. Aynı görüntüleme konumuna geri dönmek için daha önce elde edilen beyin yüzeyi kan damarı görüntüsünü kullanın. Bu tekniğin gücü, aynı nöron setindeki ark Gen ekspresyonu değişikliklerinin birkaç gün boyunca incelenmesine izin vermesidir.Canlı hayvanda. Standart HISTOKIMYASAL yöntemler tek hücre çözünürlüğü elde edebilir, ancak aynı nöronlardaki gen ekspresyonu değişikliklerini birkaç gün boyunca izleyemez. Manyetik rezonans veya nükleer görüntüleme yöntemleri gibi diğer görüntüleme teknikleri, tek tek nöronları görüntüleme çözünürlüğünden yoksundur.Bu nedenle, gen ekspresyonu değişikliklerini ölçmek için mevcut başka hiçbir yöntem, burada açıklanan görüntüleme yönteminin hem uzamsal çözünürlüğü hem de zamansal kapsamı ile eşleşemez. Bu prosedürde kritik bir adım kafatası penceresi ameliyatıdır. Beyne travma geçirmemek veya cam kapak kaymasının altında kan kalmasını önlemek için ekstra özen gösterilmelidir.Gerekirse dura çıkarılabilir. Bu prosedürü kullanarak beyindeki maksimum görüntüleme derinliğinin kafatası penceresi netliğine, mikroskop kurulumuna ve floresan raportörlerin parlaklığına bağlı olacağını unutmayın. Bu in vivo görüntüleme protokolü, çeşitli davranışsal deneyimlere yanıt olarak bireysel nöronlardaki nöroplastisite ile ilgili moleküler dinamikler hakkında bilgi elde etmek için etkili ve çok yönlü bir yöntemdir ve genel olarak diğer deneyimli düzenlenmiş genler için floresan raportörleri taşıyan transgenik farelere uygulanabilir olması muhtemeldir.

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir...

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Yenidoğan Farelerde Kortikal Nöronların İki Fotonlu Görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, anestezi uygulanmış bir transgenik fare yavrusunun beynindeki nöronları görüntülemek için kullanılan iki foton mikroskobunu göstermektedir. İki fotonlu lazer, yüksek uzamsal çözünürlük ve minimum ışık saçılımı ile daha derin görüntülemeye olanak tanıyarak dendritik projeksiyonlar da dahil olmak üzere nöronal morfolojinin ayrıntılı bir şekilde yakalanmasını sağlar.

Bir Fare Yavrusunda Nöronal Morfolojiyi Görüntülemek için İki Foton Mikroskobu

Kaynak: Kamei, R., et. al., Fare Hipokampüsündeki Mikroglia'nın İn Vivo Kronik İki Foton Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Video, hipokampal CA1 (Cornu ammonis 1) ve dentat girustaki mikroglial dinamiklerin in vivo iki foton mikroskobu için kurulum ve görüntüleme sürecini göstererek optimum optik hizalama ve yapısal bütünlük değerlendirmesi sağlar.

Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Öğrenin, iki foton mikroskobisi ile fare kortikal nöronlarında deneyim bağımlı moleküler değişiklikleri canlı izleme yöntemini. ARC geni ifadesini gerçek zamanlı takip ederek sinir plastisitesi mekanizmalarını araştırın.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Daha fazla video keşfet