Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Nöronlarda yaşanan bağımlı moleküler değişiklikler, beynin davranışsal zorluklara yanıt olarak uyum sağlama yeteneği için gereklidir. Burada, genetik olarak kodlanmış raportörler aracılığıyla bireysel kortikal nöronlardaki bu tür moleküler değişikliklerin izlenmesine izin veren bir in vivo iki foton görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. İyi bilinen deneyimli bağımlı genlerden biri, aktivite regüle edilmiş hücre iskeleti ile ilişkili protein veya arktır.

ARC'nin transkripsiyonu, yoğunlaştırılmış nöronal aktivite ile hızlı ve yüksek oranda indüklenir Canlı nöronlardaki ark ekspresyonunun iki fotomikroskopi ile incelenmesini sağlamak için, bir GFP raportörünün endojen ark promotörün kontrolü altına yerleştirildiği bir knockin fare hattı kullanıyoruz. Bu protokol, canlı hayvanda nöronal topluluklarda deneyimlenen bağımlı ark GFP ekspresyon paternlerinin izlenmesi için cerrahi hazırlıkları ve görüntüleme prosedürlerini tanımlar. İlk olarak, bu teknik için gereken hayvan hazırlığını açıklayacağız.

Bir ark GFP hayvanı kafatası penceresi ameliyatına tabi tutulacak ve ameliyattan yaklaşık iki hafta sonra iyileşecektir. Daha sonra kafatası pencere kalitesi kontrol edilir ve eğer nöronlar bu pencere aracılığıyla görüntülenebiliyorsa, hayvan davranışsal ve iki foton görüntüleme deneyinin başlangıcına kadar uygun bir ortama yerleştirilir. Bu hayvanlar daha sonra iki fotomikroskopi ile tekrar tekrar görüntülenir.

İstenen davranışsal paradigmalar birkaç gün içinde tamamlandıktan sonra, tüm aletleri sıcak bir boncuk sterilizatöründe temizleyin. Aseptik cerrahiden önce ameliyat bölgesini %70 etanol ile temizleyin ve temiz damla bezleri koyun. Hayvanı, gram intraperitoneal başına 0.02 mililitre olarak verilen% 1.2 Everton çözeltisi ile uyuşturun.

Tam sedasyonu sağlamak için kuyruk veya ayak parmağı tutamları kullanarak anestezi seviyesini kontrol edin. Hayvanın gözlerini steril oftalmik merhem ile örtün ve kilogram başına 0.2 miligram Deksametazon ve deri altına kilogram başına beş miligram carprofen enjekte edin. Kulaklar arasındaki kafatasının üzerindeki kılları tıraş edin ve cildi Betadine ovma ve% 70 Etanol'lük üç alternatif çubukla sterilize edin, hayvanı 37 dereceye ayarlanmış bir su sirkülasyonu ısıtma yastığı ile kulak çubukları ile stereotaksik bir cerrahi aşamasına monte edin.

Hayvanın anestezi seviyelerini düzenli olarak kontrol edin ve gerektiğinde orijinal anestezik dozunu tamamlayın. Bölgeyi uyuşturmak, cildi kesmek ve kafatasının üzerindeki cilt flebini çıkarmak için kafa derisi derisinin altına 200 mikrolitre% 0.5 Marcaine enjekte edin. Periosteumu çıkarın ve alanı temiz pamuklu çubuklarla kurulayın.

İhtiyaçlarınıza bağlı olarak, ilgilendiğiniz beyin bölgesi üzerinde üç ila beş milimetre çapında bir daireyi nazikçe çizmek için 0,5 milimetre çapaklı yüksek hızlı bir diş matkabı kullanın. Delme alanını periyodik olarak steril% 0,9 tuzlu su ile ıslatın ve temiz pamuklu çubuklarla kemik tozunu temizleyin. Kemik kanarsa, kanamayı temizlemek için steril tuzlu su ile önceden ıslatılmış jel köpük kullanın ve durmasını bekleyin.

Son kemik tabakasına ulaşıldığında, ince uçlu forsepslerle kemik adasını kaldırın ve çıkarın. Kemiğin alt rafına dural ataşmanlarla karşılaşabilirsiniz. Pencerenizde kemik dikiş geçerse, bunlar nazikçe çıkarılmalıdır.

Kemik flebi kaldırılırken, yüzeyini temizlemek için nemli ve jel köpüğü açıkta kalan duranın üzerine nazikçe yuvarlayın ve herhangi bir dural kanamanın durmasını bekleyin. İlgilendiğiniz bölge özellikle kalın bir dura bulunan bir yerin altındaysa, üzerindeki duranın çıkarılması gerekebilir. Bu durumda, durayı çok ince forsepslerle aşağıdaki PIA'dan nazikçe ayırın.

Başka bir çift ince forseps ile kaldırılan durada küçük bir kesi yapın. Ardından kesilen kenarları kavrayın ve durayı yavaşça ayırın. Dura ince ama güçlüdür, bu nedenle duranın sağlam kenarları ile beyni kesmemeye dikkat edin.

İlgilendiğiniz bölgeden geriye doğru ve uzakta çalışırken, bölgeyi steril A BOS veya steril tuzlu su ile bolca durulayın. Çevredeki kafatası, açıkta kalan dura veya pia etrafında önemli ölçüde kıvrılıyorsa, görüntülenmeyecek bölgelerde pencere kapağı kayması ile yakın temas etmeyecek boşlukları doldurmak için hızlı hücre yapıştırıcısı kullanın. Daha sonra steril bir cam örtü yerleştirin, hafifçe dura veya pia'nın üzerine yerleştirin.

Elastomer yapıştırıcıyı ve camın kenarlarını kaplamak için Sano akrilik jel kullanın. Kapak kayması. Açıkta kalan tüm kafatasını Sano siyanoakrilat jel veya çılgın bir yapıştırıcı ve diş çimentosu karışımı ile kaplayın.

Kafatasının diğer ucuna özel yapım bir metal kafa sabitleme çubuğu yerleştirin. Ağrı yönetimi için kilogram başına beş miligram intraperitoneal ketoprofen enjeksiyonundan sonra hayvanı ılık bir iyileşme odasına geri koyun. Ameliyattan sonra iki gün boyunca analjezik devam edin.

Ameliyat sonrası iyileşmeden iki hafta sonra, hayvanı ISO flor ile uyuşturun. İndüksiyon için% 5, bakım için% 1.5. Kafa sabitleme çerçevesi ile özel yapım bir mikroskop aşamasına monte edin ve optik netlik için kraniyal pencereyi kontrol edin.

Mavi ışıkla aydınlatma altında, beyin yüzeyi, kan damarı netliği, kraniyal pencere kalitesinin oldukça göstergesidir. Kenarları keskin bir şekilde tanımlanmışsa, pencerenin kullanılabilir olması muhtemeldir. Davranışsal bir protokole başlamadan önce, günlük değişimi en aza indirmek için hayvan tutarlı bir ev kafesi ortamında tutulmalıdır.

Başlangıç yayında, GFP ekspresyon seviyeleri, ilgilenilen beyin bölgesine bağlı olarak davranışsal eğitim veya çevresel stimülasyon paradigmalarını başlatır. Örneğin, hayvanlar, görsel korteks yayındaki farklı nöron popülasyonlarını görüntülemek için ardışık günler boyunca farklı görsel ortamlara maruz bırakılabilir, nöronlardaki GFP floresansı tipik olarak stimülasyondan iki saat sonra en yüksek seviyesine ulaşır. Deneysel zaman çizelgesi, nöronlarda en yüksek floresan seviyelerinde ARC GFP ekspresyonunun tespitini kolaylaştırmak için optimize edilebilir.

Davranışsal bir eğitim seansı veya çevresel stimülasyon tamamlandıktan sonra, hayvanı indüksiyon için ISO flor %5, bakım için %1,5 ile uyuşturun. Hayvanı, kafa sabitleme çerçevesi ile özel yapım mikroskop aşamasına monte edin. İki foton mikroskobu altında, hayvanın kafa pozisyonu, kafatasına implante edilmiş metal çubuk kullanılarak doğrudan sahneye bağlanan kafa sabitleme çerçevesine sabitlenir.

ISO flor ve oksijen, bir burun konisi aracılığıyla fareye sürekli olarak verilir. Vücut ısısı bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur. Mikroskop dedektörlerinin ortam ışığından korunduğundan emin olun.

Karanlık bir odada iki foton lazer taraması yaparak, görüntüleme için 20 x veya 25 x 1.05 sayısal açıklıklı suya daldırma lensi kullanın. İlk olarak, epi floresan aydınlatması altında, bir CCD kamera ile ilgilenilen beyin bölgesi üzerindeki yüzey kan damarı modellerinin bir görüntüsünü elde edin. Gelecekteki görüntü hizalaması için, bir 3D görüntü yığını elde etmek için iki foton lazer taraması başlatın.

İki foton lazerin uyarma dalga boyu 920 nanometre ve güç yaklaşık 50 olarak ayarlanmıştır. Miliwatt yayılan floresan, hem yeşil hem de kırmızı kanal yayında aynı anda tespit edilir. GFP floresansı sadece yeşil kanalda görülürken, doku otofloresansı her iki kanalda da görülür.

Tipik görüntü yığınları yaklaşık 320 x 300, 20 x 100 mikrometre boyutlara, piksel başına 0,5 mikrometre yatay çözünürlüğe ve piksel başına üç mikrometre dikey çözünürlüğe sahiptir. Görüntü yığınını aldıktan sonra, hayvanı ev kafesine geri koyun. Bir sonraki davranış ve görüntüleme seansına kadar hayvanı rahatsız etmeyin.

Davranışı ve görüntüleme prosedürünü günler boyunca istediğiniz gibi tekrarlayın. Aynı görüntüleme konumuna geri dönmek için daha önce elde edilen beyin yüzeyi kan damarı görüntüsünü kullanın. Bu tekniğin gücü, aynı nöron setindeki ark Gen ekspresyonu değişikliklerinin birkaç gün boyunca incelenmesine izin vermesidir.

Canlı hayvanda. Standart HISTOKIMYASAL yöntemler tek hücre çözünürlüğü elde edebilir, ancak aynı nöronlardaki gen ekspresyonu değişikliklerini birkaç gün boyunca izleyemez. Manyetik rezonans veya nükleer görüntüleme yöntemleri gibi diğer görüntüleme teknikleri, tek tek nöronları görüntüleme çözünürlüğünden yoksundur.

Bu nedenle, gen ekspresyonu değişikliklerini ölçmek için mevcut başka hiçbir yöntem, burada açıklanan görüntüleme yönteminin hem uzamsal çözünürlüğü hem de zamansal kapsamı ile eşleşemez. Bu prosedürde kritik bir adım kafatası penceresi ameliyatıdır. Beyne travma geçirmemek veya cam kapak kaymasının altında kan kalmasını önlemek için ekstra özen gösterilmelidir.

Gerekirse dura çıkarılabilir. Bu prosedürü kullanarak beyindeki maksimum görüntüleme derinliğinin kafatası penceresi netliğine, mikroskop kurulumuna ve floresan raportörlerin parlaklığına bağlı olacağını unutmayın. Bu in vivo görüntüleme protokolü, çeşitli davranışsal deneyimlere yanıt olarak bireysel nöronlardaki nöroplastisite ile ilgili moleküler dinamikler hakkında bilgi elde etmek için etkili ve çok yönlü bir yöntemdir ve genel olarak diğer deneyimli düzenlenmiş genler için floresan raportörleri taşıyan transgenik farelere uygulanabilir olması muhtemeldir.