Name: Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin fare Peyer yamalarından lenfosit ve dendritik hücre izolasyonu için akış sitometrisi ve immün boyama yöntemlerini. Bu teknikler bağırsak bağışıklığı araştırmalarında hücre popülasyonlarını nicel ve uzamsal olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz hücre analizi ve kesitler hazırlamak için Helen Johnson (Wadsworth Merkezi Hayvan Histopatoloji Çekirdek) yardım için Renjie Song (Wadsworth Merkezi Akış Sitometri Çekirdek) teşekkür ederim. Biz konfokal mikroskopi ve görüntü toplama konusunda yardım almak için Dr Richard A. Cole (Wadsworth Merkezi Işık Mikroskobu Çekirdek) teşekkür ederim. Biz animasyonlar ile yardım için Andy Bentley (Wadsworth Center Fotoğraf ve İllüstrasyon) kabul etmek istiyorum. MDJ Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. SA Wadsworth Merkezi-Sağlık Araştırma A.Ş. intramural doktora sonrası dostluk tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH hibe HD061916 ve GM082978 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Hayvanlar geleneksel, spesifik patojen free koşullarda muhafaza edildi ve Wadsworth Merkezi&#39;nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) kurallarına tam uyumlu olarak tedavi edildi. 1. Oral Gavaj <ol><li> 22 G x1.5-kullanarak ilgi antijen veya mikroplarla seçim (İsteğe bağlı) Gavaj fare zorlanma. Künt uç besleme iğne (Popper Bilimsel, New Hyde Park, NY). Teslimat hacimleri fare başına 400 ul geçmemelidir. </li></ol> 2. Akış sitometrisi için PP Hücre İzolasyonu <ol><li> Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) kurallarına göre, CO 2 boğulma tarafından fareler Euthanize. </li><li> % 70 etanol veya cerrahi öncesi betadin ile karın temizleyin. Göğüs kafesinin tabanı 1,5 cm&#39;lik orta hat başında birlikte cerrahi sınıf makas kullanarak tek bir (1 cm) kesi yapılır standart laparotomi gerçekleştirin. Başına Açığapreperitoneal kavite ve körbağırsak tanımlar. Ileal-çekal kavşakta terminali küçük bağırsak Kırpmalı ve yavaşça bütünüyle bağırsak çıkarın. Bu periton boşluğuna kaldırılır ediliyor gibi bağırsak dokusundan hyperextend vermemeye özen. </li><li> Nemli kağıt havlu veya Kimwipes bir yatak üzerinde ince bağırsak yatırın. Doku kaybını önlemek için tuzlu su ile hafifçe ince bağırsak ıslatın. Görsel olarak bağırsak (Şekil 1) &#39;in anti-mesenterik tarafında bulunan bireysel PPs tanımlar. Genellikle, tek bir fare eşit ileum (distal) için duodenum (proksimal) dan dağıtılır 5 ila 10 görünür PPs vardır. Ortalama olarak, dört fare 23 PPs verecektir. </li><li> Kavisli cerrahi makas, yavaşça tüketim bireysel PPs ve soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) koyun kullanma. Not, makas sadece PP yukarıda eğri tarafı yukarı yerleştirilir ve daha sonra yavaşça dokuya uygulanmalıdır. Tüketim sadece PP (değil surrounding doku) ve soğuk HBSS transfer. Not: İleri Bölüm 2&#39;de bu noktadan tüm inkübasyonlar ve santrifüj adımları ° C hücre canlılığı korumak için 4 yapılmalıdır. </li><li> 37 az 15-20 dakika için 5 ml Dalak Ayrılma Orta ve inkübe içine PPs aktarın ° C kuvvetlice 250 rpm&#39;de sallayarak ise. Daha uzun inkübasyon süresi olumsuz hücre canlılığı etkileyecektir. </li><li> Steril (otoklav) 70 mikron naylon örgü hücre süzgecinden tek bir hücre süspansiyonu, yer PPs oluşturmak ve zorla bir 1 cc şırınga bir pistonun tabanı kullanılarak örgü içine doku öğütmek için. Alternatif olarak, iki buzlu steril cam mikroskop slaytlar (zarf içinde otoklava) ve hafifçe ileri geri hareket ile dokulara öğütmek arasında sandviç PPs. Bir 5 ml Falcon tüp içine hücre süspansiyonu aktarmak için bir aktarma steril pipet kullanın. </li><li> Hücre süspansiyonu ile 1 mm arasında bir nihai konsantrasyon için EDTA ekleyin. Bir rocker üzerinde inkübeOda sıcaklığında 5 dakika. </li><li> İkinci bir 70 mikron hücre süzgecinden Durusu hücre süspansiyonu kalan hücresel toplamları veya doku enkaz kaldırmak için. 15 ya da 50 ml konik tüp hücreleri toplayın. </li><li> Nazik santrifüj Konu hücreleri (500 x g&#39;de 5 dakika). Fosfat salin (PBS)% 1 dana fetus serumu (FCS) içeren tamponlu bir akış tampon içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant Durusu hücreler. </li><li> Hücre sayısı ve canlılığı belirlemek için, tripan mavisi içinde 1:10 hücrelerin sulandırmak ve görsel bir ışık mikroskobu ve bir hemasitometre kullanarak hücrelerin kontrol edin. Alternatif olarak, bir Kontes hücre sayacı (Invitrogen) veya benzer bir cihaz otomatik hücre numaralarını ve canlılığı numaralandırmak için de kullanılabilir. 20-25 PPs ile başlayarak, bu protokol&gt; 2.5 x 10 6 total hücre boyun eğmek zorundadır. Bu ~ 0.8-1.2 fare başına x 10 6 hücre eşittir. </li></ol> Akış sitometrisi için Hücrelerinin Antikor Etiketleme &lt;ol start = &quot;11&quot;&gt; <li> Bir 96-kuyu yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyularına hücreleri (çukur başına 10 5) dağıtın. </li><li> Nazik santrifüj (1.000 x g&#39;de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası. </li><li> Fc blok tampon içinde tekrar süspansiyon ve hücreler 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Piyasada bulunan Fc blok tampon bir dizi (örneğin Sıçan anti-fare CD16/CD32, BD Biosciences) olmakla birlikte, biz sadece murin karşı monoklonal IgG 1 salgılar bir sıçan B hücresi hibridoma (ATCC 2.4.G2) harcanan orta kullanmak Bu adım için Fcγ reseptörleri. </li><li> Yukarıdaki gibi nazik santrifüjleme (1.000 x g&#39;de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası. </li><li> İstediğiniz dilusyondaki hücre süspansiyonları doğrudan fluorofor konjuge antikorlar ekleyin ve sürekli sallanan ile 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Konu nazik santrifüj plaka (1.000 x g&#39;de 5 dakika) ve süzünyavaşça tersine plakası tarafından süpernatant. </li><li> Akış tampon 100 ul hücreleri yıkayın. </li><li> Yavaşça tersine plakası ile 5 dakika ve süzün süpernatant 1.000 xg&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> Yeniden süspanse hücre akış tamponu 300 ul ve PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM pH 6 MgCl2) 100 ul oluşan 400 ul tespit tampon,. </li><li> Konu bir FACSCalibur hücreleri ya da denk kullanılarak akış sitometrisi. Hücre Görev Pro yazılımı sürüm 5.2 kullanarak sonuçları analiz edin. </li></ol> 3. PP Cryosections hazırlanması <ol><li> Doku toplanması öncesinde, 7x7x5 mm plastik taban kalıpları Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) bileşiği ekleyin. Ayrıca bir Dewar veya buz kovasının içinde sıvı azot (&gt; 750 ml) bir havuz hazırlamak. </li><li> Fare Euthanize ve yukarıda tarif edildiği gibi, bir laparotamy gerçekleştirir. Islak kağıt havlu üzerine bağırsak ve yer çıkarın. </li><li> Karşıcyrosectioning için PPs yalıtmak, PBS içeren bir Petri kabı tek PP ve transfer doku içeren ince bağırsak 0,5 cm transvers segmentler kesti. Yavaşça istenmeyen fekal enkaz kaldırmak için PBS ile bu segmentlerin lümen durulayın. </li><li> Dikey Ekim içeren taban kalıpları içine bağırsak dokusundan segmentleri yerleştirin. Sıvı azot içinde kalıp daldırın ve doku (1-2 dk) tamamen dondurmak için izin verir. Doku tamamen donduğunda OCT rengi berrak beyaza dönüşecektir. . Daha kademeli bir soğutma (örneğin OCT çatlama azaltmak için) için, sıvı azot buharı ile soğutulur izopentan bir banyo daldırın kalıp Not: sıvı nitrojen ile çalışırken uygun güvenlik gözlükleri takın. </li><li> Forseps kullanarak sıvı azot dondurulmuş taban kalıpları çıkartın ve kalıp OCT blok kenarları yumuşatmak için izin yeterince uzun oda sıcaklığında (~ 10-15 sn) az ısınmasını bekleyin. O andan itibaren OCT donmuş blok kaldırmak içinkalıp, kalıp ters çevirin ve alüminyum folyo temiz bir 4 x 4 cm parça üzerine blok çıkarmak için tekrar üzerine hafifçe bastırın. Hemen sıvı azot veya kuru buz üzerinde depolanan bir etiketli numune torbaya folyo ve yerde doku sarın. Alternatif olarak, bir dondurucu (&lt;-20 ° C) içinde doku aktarın. Bir hafta içinde doku kullanın, aksi blokları yaş kırılgan olacak. </li></ol> Cryosectioning <ol start="6"><li> Cryosection bir Leica CM3050S cryomicrotome ya da eşdeğerini kullanarak doku. Kriyostat üzerindeki odasının sıcaklığı -21 ayarlanmış olmalıdır ° C </li><li> Kalınlığı 12-14 mikron olan bölümler için çalışıyoruz. </li><li> Fisher SuperFrost Plus (veya eşdeğer) cam mikroskop Slaytlarınıza bölümleri toplayın ve standart bir düşük güç ışık mikroskobu kullanılarak görsel inceleyin. Birden çok bölümlü bir slayt üzerinde toplanan ediliyor, onlar aşağı boyama uygulamaları için bir araya kümelenmiş emin olun. </li><li> Mağaza to bir slayt kutusunda oda sıcaklığında slaytlar ve ideal bir kaç gün içinde bunları kullanmak. </li></ol> Cryosections Antikor Etiketleme ve Konfokal Mikroskop Analizi <ol start="10"><li> 2 dakika süreyle doku boyama kavanoz ya da raflar aseton içinde daldırın slaytlar (ya da metanol). Uzun süreli inkübasyon slayt ayırmak dokularda neden olabilir. </li><li> Yeni boyama kavanoza slaytlar aktarın ve 3 dk her PBS-T (% 0.05 Tween-20 ile 1X PBS) ile 3 kere yıkayın. </li><li> Bir ImmEdge hidrofobik kalemle bölümleri çevreler. Bu reaktifler ve antikor inkubasyon sırasında bu alanı sınırlı kalır sağlayacaktır. </li><li> Işıktan korumalı bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dk için, blok tamponunda slaytlar (PBS içinde% 2 keçi serumu) inkübe edin. </li><li> 37, 10 dakika için Fc blok tamponu (yukarı bakınız) ile inkübe slaytlar ° C. </li><li> PBS-T ve Kimwipes veya diğer emici dokusu kullanılarak bölümler çevresinde kuru alanda Dip slaytlar.Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin. </li><li> Kaplama 37 doku 30 dakika için birincil antikor çözeltisi ile inkübe ° nemlendirilmiş bir oda içinde C ile bölümleri. Primer antikor tipik olarak 20 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona blok tamponu içinde seyreltilir. En çok üç antikorlar bu aşamada direkt olarak kombine edilebilir, çünkü doğrudan doğruya-etiketli primer antikorların kullanılması arzu edilir. Doğrudan etiketli antikorlar ek antikor inkübasyon aşaması için ihtiyacı ortadan kaldırır. </li><li> Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar. </li><li> Eğer bir nem odasında 37 ° C &#39;de 30 dakika süre ile ilgili ikincil antikor ile gerektiğinde inkübe kayar. </li><li> Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid içinde 4 dk için slaytlar inkübe edin. </li><li> 1 dakika boyunca PBS ile slaytlar durulayın. </li><li> Kuru Kimwipes kullanarak bölümleri çevresindeki alanı veya diğer absorbeent doku. Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin. Bir pipet veya damlalık kullanarak, yavaşça bölümüne doğrudan Altın montaj orta Prolong bir damla yerleştirin. Kabarcıkları önlemek için dikkat çekici montaj ortam üzerine bir cam lamel uygulayın. Herhangi bir aşırı montaj orta absorbe kurutma kağıdı kullanın. </li><li> Ticari oje ve kurumaya bırakın ile mikroskop slaytlar Seal lamelleri. </li><li> Leica TCS SP5 veya eşdeğeri konfokal mikroskop ile slaytlar görüntüle. </li></ol>

<ol><li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA%27s+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li>
<li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GALT%3A+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li>
<li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+distinct+Peyer%27s+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+%28MIP%29-3alpha%2C+MIP-3beta%2C+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li>
<li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li>
<li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li>
<li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer%27s+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li>
<li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li>
<li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li>
<li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer%27s+patch%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li>
<li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer%27s+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225(2011).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer%27s+patches+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda, immün akım sitometri ve fonksiyonel analiz ve cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri sağlamıştır. Her iki yöntem bir akış sitometresinin ve kriyostat olarak sağlanır, yüksek oranda tekrarlanabilir ve kolayca erişilebilir. Ilk kez araştırmacılar için bu dalak göre, santrallerin toplam hücre verimleri nispeten yetersiz olduğuna işaret edilmelidir. Bununla birlikte, protokol biz genellikle tek bir fare 0,8-1,2 x 10 6 toplam PP hücreleri arasındaki verimleri öz...

Peyer plaklarında (PPs) insan ve farelerde (Şekil 1) ince barsak boyunca mevcut organize lenfoid folikül makroskopik büyüklükler ve mukozal immün yanıtları diyet antijenler, komensal bakteriler, mikrobiyal patojenler ve oral aşılar karşı başlatılan hangi birincil siteler teşkil 1-4. Böyle mezenterik lenf düğümleri gibi diğer periferal lenfoid dokuların aksine, PPs afferent lenfatikler yoksundur. PPs böyle, adaptif immün yanıtları intestinal lümen elde antijenlere yanıt olarak tahrik gibi. Luminal antijenlerinin örnekleme M hücreleri olarak bilinen enterocytes ve antijen-örnekleme hücrelerinin her iki oluşan folikül ilişkili epitel (FAE) ile gerçekleştirilmektedir. FAE altında, alt-epitelyal kubbe (SED) bölgesinde, makrofaj, B hücreleri ve CD4 + T hücreleri 5-9 ile iç içe dendritik hücreler (DC) bir ağ yatıyor. Her PP lenfoid follicl özündeE foliküler dendritik hücreler (FDCs) ve T hücreden zengin interfolliküler zonları ile çevrili bir B hücre zengini Orta germinal merkez vardır. IgA + B hücre plasmablasts ve CD4 + efektör ve bellek hücrelerinin gelişiminde PPs sonuçları Antijen örnekleme o tohumu çevreleyen lamina propria ve mukoza işgalciler geniş bir bağışıklık sağlar. PPs antijen örnekleme, işleme ve sunum ile ilişkili kompleks immünolojik olaylar Diseksiyon PP hücreleri bağırsak mukozasında toplam lenfoid hücrelerin ancak çok küçük bir kısmını teşkil ettiği göz önüne alındığında, zor bir iştir. Bu ortamda hücrelerin in vitro olarak karakterize yardımcı olmak için, akış sitometrisi ve işlevsel analizi, hem de immün flüoresan mikroskopi ve immünohistoloji için cryosections PP hazırlanması için bir protokol için toplam fare PP hücrelerinin hazırlanması için bir protokol sağlar. Mous izolasyonu, karakterizasyonu ve immun Bizim protokolE PP hücreleri bu teknikler 5,6,9-11 cite daha 25 yıl öncesine tarihlenen çok sayıda başvuru olduğu gerçeğini kanıtladığı, başlı başına roman değildir. Aksine, protokol, ilk kez için PPs toplama araştırmacılar için düzenlenmiş bir (görme ve) bir yöntem sağlar. Bizim tarif teknikler kolayca hakim ve kolayca&gt;% 90 hücre canlılığı ile hücrelerin büyük sayıda elde edilir. Cryosectioning protokolü ideal immünofloresan boyama ve konfokal görüntüleme için uygun son derece tekrarlanabilir seri kesitler verir. Ayrıca, protokol diğer iki yeni vallahi makaleler tamamlar. İlk, Fukuda ve arkadaşları tarafından, PP M hücreleri 12 ile patojen bakterilerin alımını değerlendirmek için bağlanan ileal loop testlerinin kullanımı anlatılmaktadır. Diğer, Geem ve arkadaşları tarafından, DC&#39;ler ve fare intestinal mukozadan makrofaj izolasyonu ve karakterizasyonu açıklar, ancak açıkça onların analiz 13 PPs dışlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Madde </td><td> Şirket </td><td> Kedi. # </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Ekim Bileşik </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mm Taban Kalıpları </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Kalem </td><td> Vektör Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Artı Slaytlar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Kenar Rite Blade </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fare CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fare CD19-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol kırmızısı olmaksızın Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikron hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> Dalak Ayrışma Orta </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Blok </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes hücre hattı elde 2.4.G2 </td></tr><tr><td> Kavisli Makas </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Kriyostat </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kontes Hücre Sayacı </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoksilen </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> Starplex Bilimsel </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman. </td></tr></tbody></table>

lenfositler ve mürin peyer en yamalar itibaren dendritik hücreler İzolasyon ve immün

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer plaklarında (PPs) gut-ilişkili lenfoid dokuların ayrılmaz bileşenleri (GALT) ve intestinal immünosürveylansında ve homeostasis merkezi bir rol oynamaktadır. Bağırsak lümeninde Partikül antijen ve mikrop sürekli folikül ilişkili epitel (FAE) PP M hücreleri tarafından örneklenmiş ve altta yatan bir dendritik hücreler ağı (DC&#39;ler), makrofajlar ve lenfositler taşınmaktadır. Bu yazıda, murin PPs (i) tek hücre süspansiyonları içine uzaklaşılmış ve akım sitometri tabi ve (ii) cryosectioning ve immün için hazırlanan hangi protokolleri tanımlar. Flow sitometri için santrallerin mekanik ayrılmış ve daha sonra epitel hücreleri ve büyük enkaz ücretsiz tek hücre süspansiyonları üretmek için 70 mikron membran ile filtre vardır. 20-25 PPs (dört fareler) ile başlayarak, bu hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir&gt; 2,5 nüfusu verir x 10&gt; 90% hücre canlılığı ile 6 hücre. Cryosectioning, taze içinly izole PPs bir cryomicrotome kullanarak o Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta, sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve kesitli batırılır. Doku kesitleri (5-12 mikron), aseton veya metanol ile tespit edilmiş, hava ile kurutulmuş, ve daha sonra immün tabi tutulmuştur.

Toplam PP hücreleri monodisperse süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, iyi ve kötü hücre hazırlıkları arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. % 80&#39;in üzerinde canlılığı ile iyi cep hazırlıkları, hücreler büyük çoğunluğu yüksek ileri saçılım (FSC), yüksek hücre hacmi bir göstergesi ve düşük yan dağılım (SSC), düşük hücre granülarite (Şekil 2A) bir göstergesi gösterir. Bu deneyde, biz de kasıtlı (yerine PHEM PBS artı% 1 FCS ile hücreler kuluçkaya, son adımda, oda sıcaklığında (yerine buz on) ...

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Bu prosedürün genel amacı, iki paralel deneysel yaklaşım kullanarak lenfositleri ve dendritik hücreleri nöron ödeyen yamalardan izole etmek ve immün boyamaktır. İlk olarak, fareden, ince bağırsaktan taze ödeme yamalarını çıkarın. Daha sonra, ödeyicinin yamalarını fiziksel olarak ayırın, dokuyu toplayın ve akış sitometrisi analizi için tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak üzere bir ağ filtreden geçirin.Hücreleri santrifüjleme ile hasat edin ve alikotları 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakaya dağıtın. Daha sonra, hücreleri hücre tipine özgü yüzey işaretleyicilerine karşı antikorlarla etiketleyin. Belirli hücre tiplerini paralel olarak numaralandırmak için hemen akış sitometrik analizine devam edin: ödeyicinin yamalarını izole edin ve doku örneklerini dondurun.OCT bloklarında, kriyo bölümünde, numuneler hücre tipine özgü yüzey belirteçlerine karşı antikorlarla etiketlenir ve daha sonra birlikte alınan konfokal taramalı lazer mikroskobu ile görselleştirilir. Bu yöntemler, ödeyicinin yama dokuları içindeki belirli bölmelerde B hücrelerini, T hücrelerini ve dendritik hücreleri ölçecektir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, PI'nin yama dokuları son derece kırılgan olduğundan ve kolayca zarar görebileceğinden mücadele edecektir.Kullanım sırasında. Yeni izole edilmiş ince bağırsağı nemli kağıt havlu veya Kim mendillerinden oluşan bir yatağa koyun. Daha sonra doku dehidrasyonunu önlemek için ince bağırsağı tuzlu su ile hafifçe ıslatın.Şimdi, bağırsağın anti mezenterik tarafında bulunan bireysel ödeme yamalarını görsel olarak tanımlayın. Tipik olarak, tek bir fare, duodenumdan ileuma eşit olarak dağıtılan beş ila 10 görünür ödeyici yamaya sahiptir. Kavisli cerrahi makas kullanmak genellikle bireysel ödeyicinin yamalarını eksize eder.Hücre canlılığını korumak için dokuyu dört santigrat derecede tutarak onları soğuk hank'in denge sıralama solüsyonuna yerleştirin. Daha sonra, ödeyicinin yamalarını beş mililitre dalak ayrışma ortamına aktarın ve 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakika boyunca 250 RPM'de çalkalayın. Daha sonra, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için, numuneyi steril bir 70 mikron naylon ağ hücre süzgecine yerleştirin ve kalan hücresel agregaları çıkarmak için bir cc'lik şırıngadan bir pistonun tabanını kullanarak dokuyu zorla ağa öğütün.Hücre süspansiyonunu ikinci bir 70 mikron hücreden boşaltın, süzün ve hücreleri 15 veya 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. 1000 kez beş dakika santrifüjleme ile 96 kuyulu yuvarlak alt plaka pelet hücrelerine kuyucuk başına 10 ila beş hücre dağıtın. G. Ardından plakayı nazikçe ters çevirerek süpernatanı boşaltın.Şimdi hücreleri FC blok tamponunda yeniden süspanse edin ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, Fluor konjuge antikorları istenen seyreltmede doğrudan hücre süspansiyonlarına ekleyin ve 100 mikrolitre akış tamponu ile buz yıkama hücreleri üzerinde inkübe edin. Daha sonra, kriyoseksiyon için ödeme yamalarını izole etmek için hücreleri akış sitometrisi ile analiz etmek için hücreleri 400 mikrolitre fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin.Tek bir ödeme yaması içeren ince bağırsağın 0,5 santimetre enine segmentlerini kesin. Dokuyu PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Daha sonra bağırsak dokusu segmentlerini OCT içeren taban kalıplarının içine dikey olarak yerleştirin.Kalıpları sıvı nitrojene batırın ve dokunun tamamen donmasına izin verin. Donmuş baz kalıplarını forseps kullanarak sıvı nitrojenden çıkarın. Kalıbın, OCT bloğunun kenarlarının yumuşaması için yeterince uzun süre oda sıcaklığını ısıtmasına izin verin.Ardından donmuş OCT bloğunu kalıptan çıkarın. Kalıbı ters çevirin ve bloğu dört x dört santimetrelik temiz bir alüminyum folyo parçasına çıkarmak için arkaya hafifçe bastırın. Dokuyu hemen folyoya sarın ve sıvı, nitrojen veya kuru buz kriyo bölümünde saklanan etiketli bir numune torbasına, dokuyu bir LI, a CM, 3 0, 5 0 s, kriyo mikrotom veya eşdeğeri kullanarak yerleştirin.Kriyostat üzerindeki oda sıcaklığını eksi 21 santigrat dereceye ayarlayın. İdeal olarak 12 ila 14 mikron kalınlığında kesitler kesin. Bölümleri Supercross plus cam mikroskop slaytlarına toplayın.Standart bir düşük güçlü ışık mikroskobu kullanarak numuneleri görsel olarak inceleyin. Slaytları iki dakika boyunca asetona batırın. Uzun süreli inkübasyonun dokuların slayttan ayrılmasına neden olabileceğini unutmayın.Numuneleri PBST ile üç kez yıkayın. Ardından bölümleri bir görüntü hidrofobik kalemle çevreleyin. Şimdi numuneleri blok tamponunda inkübe edin, doku bölümlerini birincil antikor çözeltisi ile kaplayın.Gerçek doku bölümlerine dokunmadan Kim mendil veya diğer emici doku kullanarak bölümlerin etrafındaki alanı kurulayın. Bir pipet veya damlalık kullanarak, bir damla uzun süreli altın montaj ortamını doğrudan bölümün üzerine nazikçe yerleştirin. Hava kabarcıklarından kaçınarak ve fazla montajı lekeleyerek bir cam kapak kayma uygulayın.Toplam ödeyici yama hücrelerinin mono dağınık süspansiyonlarının orta faks analizi, iyi hücre preparatlarında iyi ve zayıf hücre preparatları arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koymaktadır. %80'in üzerinde canlılık ile, hücrelerin büyük çoğunluğu, düşük hücre tanecikliği ile tutarlı olarak yüksek hücre hacmini ve düşük yan saçılmayı gösteren yüksek ileri saçılma gösterir. Bu deneyde, kötü bir popülasyonda, hücrelerin çoğunluğunun düşük FSC, yüksek SSC sergilediğini ve belirtilen yürüyüş R'nin dışında olduğunu göstermek için zayıf hücre hazırlığı kasıtlı olarak hazırlandı.Bu hücreler muhtemelen apoptoz ve/veya nekroz geçiriyor. Burada dört farklı Fluor'a kadar bir kokteyl. Çeşitli hücre tipleri arasında ayrım yapmak için dört konjuge monoklonal antikor.Ödeme yapanlarda, yama tek hücreli süspansiyonlar kullanıldı, bir farklılaşma belirteçleri kümesi ile etiketleme yapıldı. CD 19 ve B iki 20, B hücrelerinin kapılı ödeme yapanların yaklaşık %60'ını oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Yama hücre popülasyonuna özgü T hücresi alt kümeleri, CD üç ve CD dörte karşı antikorlarla çift etiketleme ile kolayca numaralandırılabilir veya CD üç ve CD sekiz, CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücreleri, toplam ödeyen yama hücrelerinin sırasıyla yaklaşık %23 ve %9'unu oluşturur.DC'nin alt kümeleri, CD 11 C pozitif ve CD 1 0 3 pozitif de bu yöntemle numaralandırılabilir. CD 11 C pozitif dc'ler, toplam kapılı nüfusun yaklaşık% 8'ine katkıda bulunur, bu da kabaca ödeme yapan yama başına 10.000 dcs'ye eşdeğerdir. CD 11 C pozitif hücrelerin popülasyonu arasında, yaklaşık% 4.7'si B iki 20 pozitif için çift pozitifti.Benzer sonuçlar, ödeyicilerin yamalı hücreleri C 57 siyah altı fareden toplandığında da elde edilir. Zayıf hücre preparatları, büyük ölçüde ölü veya ölmekte olan hücrelerin antikorları spesifik olmayan bir şekilde bağlama eğiliminde olması nedeniyle, oldukça yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Tipik olarak, bunlar B 2 2 0 pozitif ve CD üç pozitif çift pozitif hücrelerin yanı sıra B iki 20 pozitif B hücresi ve CD dört pozitif T hücresi çift pozitif hücrelerin aşırı temsiline yol açar.Fare ödeyicilerinin yama kriyo kesitleri, histopatolojik analizin yanı sıra immüno etiketlemeye de uygundur. Kesitlerin gücü, h ve e ile boyandığında hücresel düzeyde daha fazla çözünürlük sağlarken, ödeyicilerin yama germinal merkezlerinin aydınlık ve karanlık bölgeleri, kriyo kesit bölümlerinde daha kolay sınırlandırılır. Bu tipik ödeme yapanlar yama kriyo bölümünde, anti CD üç antikor, T hücrelerini anti CD 11 C antikorlarını etiketler.Dendritik hücreleri ve anti B iki 20 antikoru vurgulayın. Vurgulayın B hücreleri Gelişiminden sonra. Bu teknik, alandaki araştırmacıların, bağırsakla ilişkili lenfoid dokulardaki dendritik hücreler gibi spesifik hücre tiplerinin bağırsak antijenlerine ve mikrobiyal patojenlere nasıl tepki verdiğini anlamalarının yolunu açtı.Bu bilgi, mukozal aşı tasarımını ve geliştirilmesini etkilemiştir.

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme...

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Bu videoda, hasat edilmiş bir fare Peyer'in yamasından lenfositlerin izolasyonunu gösteriyoruz. İzole edilen lenfositler daha fazla analiz için kullanılabilir.

Bir Fare Peyer Yamasından Lenfositlerin İzolasyonu

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Deride yerleşik T hücrelerini insan derisi biyopsilerinden etkili bir şekilde izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, akım sitometrik analizi ve ex vivo kültür için yeterli sayıda canlı insan derisinde yerleşik lenfosit sağlar.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Burada, farklı fare dokuları içindeki IL-22 üreten hücreleri görselleştirmek için bir transgenik raportör fare modelini açıklıyoruz. Bu yöntem, faredeki diğer sitokinlerin veya salgı proteinlerinin yerini izlemek için kullanılabilir.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

Burada, fare Peyer'in yamalarından germinal merkez B hücrelerini kullanarak immünoglobulin ağır zincir gen lokusu içindeki somatik hipermütasyonu ölçmek için bir test sunulmaktadır.

Fare Peyer Yamalarından Germinal Center B hücrelerinin JH4 intronunda Somatik Hipermütasyon Analizi

Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Öğrenin fare Peyer yamalarından lenfosit ve dendritik hücre izolasyonu için akış sitometrisi ve immün boyama yöntemlerini. Bu teknikler bağırsak bağışıklığı araştırmalarında hücre popülasyonlarını nicel ve uzamsal olarak analiz etmenizi sağlar.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Daha fazla video keşfet