Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Bu prosedürün genel amacı, iki paralel deneysel yaklaşım kullanarak lenfositleri ve dendritik hücreleri nöron ödeyen yamalardan izole etmek ve immün boyamaktır. İlk olarak, fareden, ince bağırsaktan taze ödeme yamalarını çıkarın. Daha sonra, ödeyicinin yamalarını fiziksel olarak ayırın, dokuyu toplayın ve akış sitometrisi analizi için tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak üzere bir ağ filtreden geçirin.

Hücreleri santrifüjleme ile hasat edin ve alikotları 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakaya dağıtın. Daha sonra, hücreleri hücre tipine özgü yüzey işaretleyicilerine karşı antikorlarla etiketleyin. Belirli hücre tiplerini paralel olarak numaralandırmak için hemen akış sitometrik analizine devam edin: ödeyicinin yamalarını izole edin ve doku örneklerini dondurun.

OCT bloklarında, kriyo bölümünde, numuneler hücre tipine özgü yüzey belirteçlerine karşı antikorlarla etiketlenir ve daha sonra birlikte alınan konfokal taramalı lazer mikroskobu ile görselleştirilir. Bu yöntemler, ödeyicinin yama dokuları içindeki belirli bölmelerde B hücrelerini, T hücrelerini ve dendritik hücreleri ölçecektir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, PI'nin yama dokuları son derece kırılgan olduğundan ve kolayca zarar görebileceğinden mücadele edecektir.

Kullanım sırasında. Yeni izole edilmiş ince bağırsağı nemli kağıt havlu veya Kim mendillerinden oluşan bir yatağa koyun. Daha sonra doku dehidrasyonunu önlemek için ince bağırsağı tuzlu su ile hafifçe ıslatın.

Şimdi, bağırsağın anti mezenterik tarafında bulunan bireysel ödeme yamalarını görsel olarak tanımlayın. Tipik olarak, tek bir fare, duodenumdan ileuma eşit olarak dağıtılan beş ila 10 görünür ödeyici yamaya sahiptir. Kavisli cerrahi makas kullanmak genellikle bireysel ödeyicinin yamalarını eksize eder.

Hücre canlılığını korumak için dokuyu dört santigrat derecede tutarak onları soğuk hank'in denge sıralama solüsyonuna yerleştirin. Daha sonra, ödeyicinin yamalarını beş mililitre dalak ayrışma ortamına aktarın ve 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakika boyunca 250 RPM'de çalkalayın. Daha sonra, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için, numuneyi steril bir 70 mikron naylon ağ hücre süzgecine yerleştirin ve kalan hücresel agregaları çıkarmak için bir cc'lik şırıngadan bir pistonun tabanını kullanarak dokuyu zorla ağa öğütün.

Hücre süspansiyonunu ikinci bir 70 mikron hücreden boşaltın, süzün ve hücreleri 15 veya 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. 1000 kez beş dakika santrifüjleme ile 96 kuyulu yuvarlak alt plaka pelet hücrelerine kuyucuk başına 10 ila beş hücre dağıtın. G. Ardından plakayı nazikçe ters çevirerek süpernatanı boşaltın.

Şimdi hücreleri FC blok tamponunda yeniden süspanse edin ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, Fluor konjuge antikorları istenen seyreltmede doğrudan hücre süspansiyonlarına ekleyin ve 100 mikrolitre akış tamponu ile buz yıkama hücreleri üzerinde inkübe edin. Daha sonra, kriyoseksiyon için ödeme yamalarını izole etmek için hücreleri akış sitometrisi ile analiz etmek için hücreleri 400 mikrolitre fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Tek bir ödeme yaması içeren ince bağırsağın 0,5 santimetre enine segmentlerini kesin. Dokuyu PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Daha sonra bağırsak dokusu segmentlerini OCT içeren taban kalıplarının içine dikey olarak yerleştirin.

Kalıpları sıvı nitrojene batırın ve dokunun tamamen donmasına izin verin. Donmuş baz kalıplarını forseps kullanarak sıvı nitrojenden çıkarın. Kalıbın, OCT bloğunun kenarlarının yumuşaması için yeterince uzun süre oda sıcaklığını ısıtmasına izin verin.

Ardından donmuş OCT bloğunu kalıptan çıkarın. Kalıbı ters çevirin ve bloğu dört x dört santimetrelik temiz bir alüminyum folyo parçasına çıkarmak için arkaya hafifçe bastırın. Dokuyu hemen folyoya sarın ve sıvı, nitrojen veya kuru buz kriyo bölümünde saklanan etiketli bir numune torbasına, dokuyu bir LI, a CM, 3 0, 5 0 s, kriyo mikrotom veya eşdeğeri kullanarak yerleştirin.

Kriyostat üzerindeki oda sıcaklığını eksi 21 santigrat dereceye ayarlayın. İdeal olarak 12 ila 14 mikron kalınlığında kesitler kesin. Bölümleri Supercross plus cam mikroskop slaytlarına toplayın.

Standart bir düşük güçlü ışık mikroskobu kullanarak numuneleri görsel olarak inceleyin. Slaytları iki dakika boyunca asetona batırın. Uzun süreli inkübasyonun dokuların slayttan ayrılmasına neden olabileceğini unutmayın.

Numuneleri PBST ile üç kez yıkayın. Ardından bölümleri bir görüntü hidrofobik kalemle çevreleyin. Şimdi numuneleri blok tamponunda inkübe edin, doku bölümlerini birincil antikor çözeltisi ile kaplayın.

Gerçek doku bölümlerine dokunmadan Kim mendil veya diğer emici doku kullanarak bölümlerin etrafındaki alanı kurulayın. Bir pipet veya damlalık kullanarak, bir damla uzun süreli altın montaj ortamını doğrudan bölümün üzerine nazikçe yerleştirin. Hava kabarcıklarından kaçınarak ve fazla montajı lekeleyerek bir cam kapak kayma uygulayın.

Toplam ödeyici yama hücrelerinin mono dağınık süspansiyonlarının orta faks analizi, iyi hücre preparatlarında iyi ve zayıf hücre preparatları arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koymaktadır. %80'in üzerinde canlılık ile, hücrelerin büyük çoğunluğu, düşük hücre tanecikliği ile tutarlı olarak yüksek hücre hacmini ve düşük yan saçılmayı gösteren yüksek ileri saçılma gösterir. Bu deneyde, kötü bir popülasyonda, hücrelerin çoğunluğunun düşük FSC, yüksek SSC sergilediğini ve belirtilen yürüyüş R'nin dışında olduğunu göstermek için zayıf hücre hazırlığı kasıtlı olarak hazırlandı.

Bu hücreler muhtemelen apoptoz ve/veya nekroz geçiriyor. Burada dört farklı Fluor'a kadar bir kokteyl. Çeşitli hücre tipleri arasında ayrım yapmak için dört konjuge monoklonal antikor.

Ödeme yapanlarda, yama tek hücreli süspansiyonlar kullanıldı, bir farklılaşma belirteçleri kümesi ile etiketleme yapıldı. CD 19 ve B iki 20, B hücrelerinin kapılı ödeme yapanların yaklaşık %60'ını oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Yama hücre popülasyonuna özgü T hücresi alt kümeleri, CD üç ve CD dörte karşı antikorlarla çift etiketleme ile kolayca numaralandırılabilir veya CD üç ve CD sekiz, CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücreleri, toplam ödeyen yama hücrelerinin sırasıyla yaklaşık %23 ve %9'unu oluşturur.

DC'nin alt kümeleri, CD 11 C pozitif ve CD 1 0 3 pozitif de bu yöntemle numaralandırılabilir. CD 11 C pozitif dc'ler, toplam kapılı nüfusun yaklaşık% 8'ine katkıda bulunur, bu da kabaca ödeme yapan yama başına 10.000 dcs'ye eşdeğerdir. CD 11 C pozitif hücrelerin popülasyonu arasında, yaklaşık% 4.7'si B iki 20 pozitif için çift pozitifti.

Benzer sonuçlar, ödeyicilerin yamalı hücreleri C 57 siyah altı fareden toplandığında da elde edilir. Zayıf hücre preparatları, büyük ölçüde ölü veya ölmekte olan hücrelerin antikorları spesifik olmayan bir şekilde bağlama eğiliminde olması nedeniyle, oldukça yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Tipik olarak, bunlar B 2 2 0 pozitif ve CD üç pozitif çift pozitif hücrelerin yanı sıra B iki 20 pozitif B hücresi ve CD dört pozitif T hücresi çift pozitif hücrelerin aşırı temsiline yol açar.

Fare ödeyicilerinin yama kriyo kesitleri, histopatolojik analizin yanı sıra immüno etiketlemeye de uygundur. Kesitlerin gücü, h ve e ile boyandığında hücresel düzeyde daha fazla çözünürlük sağlarken, ödeyicilerin yama germinal merkezlerinin aydınlık ve karanlık bölgeleri, kriyo kesit bölümlerinde daha kolay sınırlandırılır. Bu tipik ödeme yapanlar yama kriyo bölümünde, anti CD üç antikor, T hücrelerini anti CD 11 C antikorlarını etiketler.

Dendritik hücreleri ve anti B iki 20 antikoru vurgulayın. Vurgulayın B hücreleri Gelişiminden sonra. Bu teknik, alandaki araştırmacıların, bağırsakla ilişkili lenfoid dokulardaki dendritik hücreler gibi spesifik hücre tiplerinin bağırsak antijenlerine ve mikrobiyal patojenlere nasıl tepki verdiğini anlamalarının yolunu açtı.

Bu bilgi, mukozal aşı tasarımını ve geliştirilmesini etkilemiştir.