Name: Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin fare hipokampusuna lentivirus enjeksiyonu ile mikroRNA aşırı ekspresyonunun bilişsel etkilerini. Bu yöntem, gen düzenlemesini incelemek için hızlı ve etkili bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Beyin Bilimleri Edmond ve Lily Safra Merkezi (SB dostluk), İsrail Bilim Vakfı (HS Hibe No 378/11,) The Legacy Mirası Biyomedikal Bilim Ortaklık Programı ve Bilimsel için Alman İsrail Vakfı tarafından desteklenmiştir Araştırma ve Geliştirme (GIF) (HS Grant No 1093-32.2/2010,).

1. Lentivirüs Hazırlık <ol><li> % 90 izdiham HEK-293FT hücreleri büyütün. </li><li> Serumsuz DMEM transfeksiyon değişim hücre orta günde 1 mM glutamin, ve 50 mg / ml penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş. </li><li> Bir pLKO.1-Puro, vektör ve bir taşıyıcı olarak 9: 1 mg / ml &#39;polietilenimin 10 ul kullanılarak delta R8.2 ve VSV-G grupları ve ilgi MiRNA kodlayan plazmid ile ko-transfekte hücreleri. </li><li> 0.45 mikron filtre ile filtre, 24 saat ve 48 saat sonrası transfeksiyon de ambalajlı lentivirüsler toplayın. </li><li> 2 saat ve 15 ° -70 C, kısım ve mağaza ° C için, 70.000 xg de Ultrasantrifügasyon kullanarak lentivirüsler Konsantre </li><li> Seri seyreltilmiş virüs preparatları (kuyu başına vektör 1 ile 10 -6 ml) ile HEK-293T hücreleri enfekte ölçüm virüs titresi. Elde edilen titresi (~ 1, en ​​az 10 ml x 9 bulaşıcı parçacıklar tavsiye edilir) ge sentezlenmesi için değerlendirilirilgi ne, puromycin seçimi kullanarak ve floresan hücreleri sayma yoluyla virüs ifade GFP miktarının tarafından. </li></ol> Lentivirüs hazırlık daha ayrıntılı bir protokol için 10 bakın. 2. Cerrahi Hayvanlar hazırlanması <ol><li> Cerrahlar giysi cerrahi önlük, steril eldiven, şapka ve maske içermelidir. </li><li> Hayvan tartılır, daha sonra her bir ilaç için belirtilen hayvan ağırlığı ile orantılı hacmi ile, bir Ketamin karışımın bir IP enjeksiyonu ile anestezi. Bir Ketamin / Ksilazin karışım için 80-200 mg / kg ketamin ve 7-20 mg / kg &#39;Ksilazin bir doz aralığı genellikle farenin için kullanılır. </li><li> Hayvan tam anestezi kadar bekleyin, sonra bacak uzanan ve sonra parmağınızla bastırarak hayvanın arka bacak içinde geri çekilme refleksi eksikliği olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Kutunun üzerinde belirtilen ağrı kesici, Rimadyl ile deri altı hayvan enjekte edilir. Rymadil için tipik doz aralığı 5-10 mg&#39;dır. </li><li> Sabit bir vücut sıcaklığı tutmak ve merhem ile gözleri nemlendirmek için bir ısıtma yastığı hayvan yerleştirin. </li><li> Bir kırpma makine ile iki kulak arasındaki alanda tıraş. </li><li> Betadin ile cilt dezenfekte. </li></ol> 3. Kafatası ve Sondaj maruz kalma <ol><li> Hayvanın kulak sadece ön yarıklar içine çubuklar ayarlayarak STEREOTAKT içindeki hayvanın yerleştirin. </li><li> Kulak arasındaki yaklaşık 1,5 cm bir ön-arka kesi yapmak ve cerrahi kelepçeleri (serfines) ile açık tutmak için bir neşter kullanın. </li><li> Bregma ve koronal ve lambdoidea&#39;ya sütür arasındaki kesişme yani,, koronal sütür ve sagittal sütür arasındaki kesişme kadar bir pamuklu çubukla kafatası yüzeyini temizlemek yani lambda, görülebilir. </li><li> Her üç eksen de bregma noktasına STEREOTAKT tarafından düzenlenen şırınga ucu,,, gelin. Koordinatları yazın. Bu noktada sıfır po olarak düşünülebilirher üç eksende int. </li><li> Bir düzlemsel hareket kafatası çizilmeye ve doğru konuma şırınga kafa hareket olmaz ki dikey eksende şırınga kaldırın. -2 Ön / arka eksende, ± medial / yan ekseninde 1.8 ve dorsal / ventral ekseninde -1.5: hipokampal CA1 enjeksiyon aşağıdaki mm bregma göre koordine gerektirir. </li><li> Bu kafatası temas edene kadar şırınga ucu indirin ve bir işaretleyici ile nokta işaretleyin. Bıçaklama önlemek için geri şırınga çıkarın. </li><li> Sadece ince bir delici kullanarak kafatası kemik sığ bir delik, açın. Bu nedenle yumuşak doku altında içine matkap devam olmaz delici sabit tutun. Sen diğer steadying bir elle ve kısa bakliyat delerek bu önleyebilirsiniz. </li></ol> 4. Lentivirüs Enjeksiyon <ol><li> Konsantre lentivirüs bir çözeltinin 0.5 ml çekin. </li><li> Delik üzerinde şırınga yerleştirin ve Rea kadar yavaşça dikey olarak daha düşükkafatasının nü içerir yüzeyi. Çok yavaş, beyin içine şırınga düşürmek için devam edin. Bu aşamada bir miktar kanama mutlaka başarısız bir penetrasyon göstermez hangi oluşabilir. Kanama oluşursa bir pamuklu çubuk ile paspas. </li><li> Dijital pompaya 0.02 ml / dakika (0.5 ul 25 dakika içinde enjekte olacak) ayarlayın ve infüzyon başlar. Yavaş infüzyon dokuya virüsün yayılmasını etkili için izin verir ve geri akışını engeller. Bazı şırınga tiplerinde orijinal koordinatları ve beslerken çekilmeden önce 0,5 mm ekstra bir derinlik için şırınga takmadan düşünün. </li><li> Infüzyon tamamlandıktan sonra malzeme yerine bir şırınga ile oluşturulan kanal içine geri çekilen bir beyin içine yaymak için izin vermek için ek 5 dakika boyunca bekleyin. </li><li> Çok yavaş şırınga çıkarın ve geri akışları için izleyin. Bir geri akış bu adımda gözlenirse, enjekte edilen malzemenin bir kısmını muhtemelen kayboldu. </li></ol> 5. Yara Sızdırmazlık ve Kurtarma <ol><li> Seal inciE histoakril ile yara. Gözlerinin içine histoakril sızmasını önlemek için emin olun. </li><li> Dehidratasyon önlemek için, 1 ml önceden ısıtılmış tuzlu su ile hayvan intraperitoneal (İP) enjekte edilir. </li><li> Isıtılmış bir pad üzerinde konumlandırılmış bir kurtarma kafeste hayvan yerleştirin. Bu, ilave bir saat için geri alırken hayvan izleyin. </li></ol> Kilo kaybı, iştahsızlık durumunda, zayıf / yem ya da su, can çekişme durumuna ya da enfeksiyon, hayvanın ötenazi elde edememe yapılmalıdır. Kemirgenler ötenazi kabul edilebilir yöntemler barbitüratlar, uçucu anestetikler, CO2, CO, veya genel anestezi ile birlikte potasyum klorürdür. 4-6 hafta sonra, hayvanın navigasyon bellek Morris su labirentinde değerlendirilir değerlendirmek. Lentivirüs genellikle enjeksiyon alanı içinde en hücreleri enfekte olacaktır. 6. Morris Su Maze Davranış Değerlendirme <ol><li> M hayvanları yetiştirmeksüsen Su Labirent. Tam eğitim ve test protokolü için 11 bakın. Her deneme sonra, kuru bir havlu ile kurulayın hayvan kafesine değiştirin ve depodaki su yenileyin. </li><li> Her gün birbirini takip eden 3 gün, 4 denemeler için, Morris su labirentinde hayvanlar test edin. Doğu-batı-kuzey-güney, iki gün: batı-güney Her gün örneğin gün biri için, değişen bir sırayla labirent (kuzey, güney, doğu ve batı) ve 4 yönde her labirent içine hayvan yerleştirin -kuzey-doğu. Her deneme sonra hayvanlar silin. </li><li> Test sırasında denemeler gibi Noldus izleme sistemi gibi bir takip sistemi ile hayvan izleyebilirsiniz. </li><li> 12. Test deneme sonra, bir dakika için bir platform olmadan su tankı içine hayvan yerleştirin. Bu hayvan alıyor arama stratejisi analiz için kullanılacak. </li><li> 12 önerilen gibi verileri analiz. </li></ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li>
<li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li>
<li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors%3A+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li>
<li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li>
<li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A%2FB+in+Alzheimer%27s+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li>
<li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety%3A+the+case+of+amygdalar+miR-34%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li>
<li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+%26+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171(2012).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+Water+Maze+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897(2008).</li>
<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).</li>
<li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bir lentivirüs stereotaktik enjeksiyon için hem yukarı veya farklı genler ve miRNA&#39;lar yük atma in vivo değerlendirme için nispeten hızlı bir yöntemdir. Başlıca alternatif daha sonra çok daha zahmetli ve zaman alan bir tekniktir lentivirüs doğrudan enjeksiyon, bir genetik faredir. Buna ek olarak, yukarı regülasyonu, lentivirüs enjeksiyon, yetişkin fare belirli bir zamanda meydana gelir ve çoğu zaman geçici denetimi genetiği farelerde olduğu gibi, geliştirme sırasında sızdırma olasılığı içermez. Değişmiş düz...

Sinir sisteminin işleyişinde özellikle miRNA&#39;lar rolü son zamanlarda birçok çalışmada lentiviral enjeksiyon meydan olmuştur. MiRNA sinaps yapısı 1, sinaptogenez 2 ve sinaps yeniden ve bakım 3 bakımı ve yeniden şekillendirme için çok önemli olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmalar güçlü bir yukarı şekillendirme hem de sinir sistemi, bilişsel fonksiyon ana çıkış korunmasında çok katmanlı düzenleyici etkileri ile, miRNA&#39;lar meşgul olduğunu göstermektedir. Kemirgen beynindeki belirli bölgeleri lentivirüs parçacıkların stereotaktik enjeksiyon sinaps morfolojisi ve nöronal aktivite Değişiklik için arama sağlar ve 4,5-aşırı ifade transkript fonksiyonel önemi kurulması için kullanılmıştır. MiRNA-ifade lentivirüsler ile iyi tanımlanmış beyin alanlarda nöronların doğrudan enfeksiyon yaşlanma, beyin hastalıkları ve nörodejenerasyon çalışmalarında karışmış olabilir; miRNA Çalışmalarıs davranışsal düzenleme 6-8 dünyasında bir çok daha az gelişmiş devlet altındadır, ve stereotaktik enjeksiyon miRNA-ifade davranış testleri takip lentivirüs parçacıklar gibi amaçlar için yararlı olabilir. Aşırı ya da az ifade uyaran için çok daha zahmetli yöntemi genetik knock-in veya farelerde mühendislik içerir. Genetik sistemleri daha da ifade koşullu ve zamansal kontrolünün (örneğin, Kre-Lox, Tet sistemler) için izin verebilir, ancak bu pek bir enjeksiyon işlemi uzamsal özgüllüğünü sunmak ve sızdırma bir miktar hemen hemen her zaman bulunmamaktadır. Ayrıca, mühendislik yöntemleri ameliyat gerektirmeyen ve nispeten iyi tekrarlanabilirlik ile laboratuvarlar arasında kullanılabilir, ancak onlar daha yavaş ve çok daha fazla insan gücü ve mali kaynak gerektirir. Buna ek olarak, kontrol geçici aşırı ya da enjekte edilmiş farelerde altında ekspresyonu genetik farelere kıyasla çok daha doğru olacaktır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kemirgen tartı</td><td>Burtons (İngiltere)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>ısıtma yastığı</td><td>FIRstTechnology</td><td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td>kırpma makinesi</td><td>Çalma</td><td>51465</td><td></td></tr><tr><td>stereotakt</td><td>Çalmak</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Neşter ve bıçaklar</td><td>Kent bilimsel</td><td></td><td></td>INS500348</tr><tr><td>Harland şırınga</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td>delici</td><td>Hırsızlık</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>dijital pompa</td><td>Harvard aparatı</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>Su deposu ve platform</td><td>Çalma</td><td>60135<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>ketamin </td><td>Vetoquinol(Lure France)</td><td></td><td></td>3055503</tr><tr><td>domitor</td><td>Orion pharma</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer hayvan sağlığı</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>nem merhem - Synthomycine %5</td> <td>Rekah İlaç</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>histoakril</td><td>Braun</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

bir stereotaktik enjeksiyon microrna-ifade fare hippocampus ca1 bölgesi lentiviruses ve davranış sonuç değerlendirilmesi

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNA (miRNA&#39;lar) uzun 22 nükleotid çevresinde küçük düzenleyici tek zincirli RNA molekülleri olduğunu olabilir her hedef çok sayıda mRNA transkript ve neden olan yıkım ve / veya bu hedeflere inhibe çeviri tarafından loş bütün bir gen yolu. Çeşitli miRNA&#39;lar nöronal yapı ve fonksiyonu sürdürmek ve üst düzey beyin fonksiyonlarında önemli rol oynayan ve yöntemleri bu işlevler keşfetmek için kendi seviyelerini değiştirmek için aranır. Burada, MiRNA kodlayan virüs partiküllerinin stereotaktik enjeksiyon yoluyla uygulanan farelerde aşırı miRNAs bilişsel sonuçları incelemek için in vivo metot, doğrudan mevcut. Özellikle, mevcut protokol memeli bellek konsolidasyon, öğrenme ve stres yanıtları katkıda bulunur ve uygun bir enjeksiyon yeri sunmaktadır hipokampal CA1 bölgesinde, içine enjeksiyon içerir. Koordinatları fare bregma ve virüs perfüzyon dijital kontrollü ve çok yavaş tutulur göre ölçülür.Enjeksiyon sonrası, cerrahi yara kapalı ve hayvanların kurtarmak olduğunu. Ilgili mRNA hedeflerin susturucular kodlama lentivirüsler naif fare ile, gözlenen etkisi sorumlu özel miRNA / hedef etkileşimi ima hizmet, tuzlu ve kontrol grubu olarak &quot;boş&quot; lentivirüs vektörleri enjekte fareler enjekte fareler. Bir ay sonrası enjeksiyon, hayvanlar kendi navigasyon öğrenme ve bellek yeteneklerini değerlendirmek için Morris Su Maze (MWM) incelenmiştir. MWM 1 cm su yüzeyinin altında batık küçük bir platformu ile renkli su dolu yuvarlak bir tank. Tankın etrafında sabit görsel ipuçları mekansal navigasyon (ses ve dünyanın manyetik alanı da navigasyon hayvanlar yardımcı olabilir) için izin verir. Video kamera izleme bulmak ve platform miktar için yüzme ve zaman yol ölçüm sağlar. Fare ilk gizli montaj platformu zorla yüzme bir kaçış sunuyor öğretilir, daha sonra bu kaçış ve f kullanmak için test edilirinally, platform kaldırılır ve fare önceki konumuna hatırlar eğer prob testleri incelemektir. Birkaç gün üst üste tekrar tekrar test platformu bulmak ve monte etmek daha kısa gecikmeleri test farelerin gelişmiş performans vurgulamak ve daha direkt hatları platform ya da konumu ulaşmak için. Bu gelişme daha sonra (yükseltilmiş artı labirent gibi) özel olarak test edilebilir bozulmuş öğrenme ve bellek ve / veya anksiyete, temsil göstermek için başarısız. Bu yaklaşım, bilişsel eğitim ve / veya stres ile ilgili işlemlerde özel miRNAs ve hedef transkript doğrulama sağlar.

Protokol bölümünde belirtilen debi ile fare hipokampta CA1 bölgesinde, içine 0.5 ul lentivirüs enjeksiyon rostral-kaudal ekseninde yaklaşık 1 mm enfekte bir küre verir ve 0.5 medial yan mm ve ön ile ilgili -arka eksen (Şekil 3). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Şekil 1. Bregma noktası ve enjeksiyon cihazı. (A) gösterilir bregma (koronal ve sagital sütür kavşak) ve kesi yaptıktan sonr...

MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet verebilir<em&gt; In vivo</em&gt; Spesifik beyin bölgelerinde aşırı ifade miRNAs etkisi.

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerde mikro RNA aşırı ekspresyonunun nörolojik ve bilişsel etkilerini değerlendirmektir. Bu, ikinci bir adım olarak mikro RNA eksprese eden lentivirüs hazırlanarak gerçekleştirilir. Lentivirüs, mikro RNA'nın aşırı eksprese olmasına ve hedefleri üzerinde düzenleme yapmasına olanak tanıyan belirli bir beyin bölgesine enjekte edilir.Lentivirüsün fare beynine anatomik olarak hedeflenmiş şekilde iletilmesi sonucu, mikro RNA aşırı ifadesinin bilişsel etkilerini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin genetik mühendisliği gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genetik mühendisliğinin doğrudan lentivirüs enjeksiyonuna kıre kıyasla çok daha zahmetli ve zaman alıcı bir teknik olmasıdır. Ayrıca lentivirüs enjeksiyonu, aşırı ifade edilen molekülün tam mekânsal ve zamansal kontrolüne ve takibine olanak tanır.Bu yöntem, nöronal miRNA alanıyla ilgili, örneğin davranışsal testlerle değerlendirildiğinde belirli bir miRNA'nın aşırı veya düşük ekspresyonunun öğrenme ve bellek üzerindeki etkisinin ne olacağı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. miRNA'ların terapötik müdahalelere uygun olması nedeniyle, bu tekniğin etkileri nörodejeneratif hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Plakaya ekilen paketleme hücrelerini %90 konfluense ulaşana kadar inkübe edin, ardından önce onları transfect edin ve ortamlarını 1 mM glutamin ve 50 mg/mL ile desteklenmiş serumsuz DMEM ile değiştirin.Penisilin streptomisin uygulamasının ardından, hücreleri delta R 8.2 ve VSVG kısımlarını kodlayan A-P-L-K-O 0.1 pur vektör plazmidi ile ilgilenilen mikro RNA'yı içeren plazmid ile ko-transfekte edin. 24 ve 48. saatlerde taşıyıcı olarak 1 mg/mL konsantrasyonda 10 µL polietilen kullanın. Transfeksiyon sonrası paketlenmiş lentivirüsleri toplayın ve 0,45 µm'lik bir filtreden süzün.Lentivirüs içeren filtratı, 15 °C'de ve 70.000 G'de iki saat boyunca ultrasentrifüj ile konsantre edin. Süpernatantı atın ve pellet tamamen çözülene ve görünür topaklar kalmayana kadar, sadece gerekli miktarda deiyonize distile su ile lentivirüsü süspanse edin. Ardından, konsantre çözeltiyi -70 °C'de saklamak üzere alikotlara ayırın.Ardından, seri dilüsyon uygulanmış virüsle paketleme hücrelerini enfekte ederek virüs titresini ölçün. 12 kuyucuklu bir plakada, kuyucuk başına bir mililitreden bir milyonuncu bir mililitre vektöre kadar dilüsyon yapın. Elde edilen titre, mililitre başına en az 1 milyar enfeksiyöz partikül olmalıdır.Hayvanı tartın ve ketamin karışımının IP enjeksiyonu ile anesteziye alın. Her ilaç için belirtilen, hayvanın ağırlığıyla orantılı hacmi kullanın. Hayvan tamamen anesteziye girene kadar bekleyin.Ardından, refleks olmadığında arka ekstremitede geri çekilme refleksinin yokluğunu kontrol edin. Hayvana, kutu üzerinde belirtilen şekilde ağrı kesici IL'yi deri altına enjekte edin. Hayvanı bir ısıtıcı lambanın altına veya ısıtıcı bir pedin üzerine yerleştirin ve gözlerini merhemle nemlendirin.Son olarak, iki kulak arasındaki bölgeyi bir tıraş makinesiyle tıraş edin ve cildi %70 ethanol ile sterilize edin. Hayvanı stereo T içerisine yerleştirin ve çubukları, hayvanın kulaklarının hemen içindeki boşluklara gelecek şekilde ayarlayın. Ardından, kulaklar arasında yaklaşık 1.5 santimetre uzunluğunda anterior posterior bir insizyon yapmak için bir skalpel kullanın ve insizyonu cerrahi klemplerle açık tutun.Ardından, koronal sütür ile sagital sütürlerin kesişim noktası görünür hale gelene kadar kafatası yüzeyini bir pamuklu çubukla temizleyin. Buna bgma ve koronal ile lambdoid sütürlerin kesişimi veya lambda dahildir. Şimdi, stereotaktik düzeneğe sabitlenmiş şırınganın ucunu, üç eksende de koordinatları takip ederek tam olarak bgma noktasına konumlandırın.Bunlar sıfır noktalarıdır. Ardından, düzlemsel bir hareketin skull'u bgma'dan çizmemesi için şırıngayı dikey eksende kaldırın. Şırıngayı, örneğin hippocampal ca one için gerekli konuma; AP ekseninde 2 mm aşağıya, LM ekseninde 1.8 mm yukarı ve aşağıya ve DV ekseninde 1.5 mm aşağıya taşıyın.Ardından, şırınganın ucunu kafatasına değene kadar indirin. İşareti koyun, ardından matkap için yer açmak amacıyla şırıngayı o noktadan uzaklaştırın. İnce uçlu bir matkap kullanarak kafatası kemiğinde sığ bir delik açın.Matkabı sabit tutun ve yumuşak dokuya doğru delme işlemi yapmayın. Delme işlemi sırasında kısa darbelerle çalışmak yardımcı olabilir. Kemiğin delinmesinin yumuşak dokuda daha derine inmemesi için, bir elinizle diğer eli desteklediğinizden emin olun.Konsantre lentivirüs solüsyonunun yarım mililitresini şırıngaya çekin. Şırıngayı deliğin üzerine yerleştirin ve kafatası yüzeyine ulaşana kadar dikey olarak yavaşça indirin. Şırıngayı beynin içine çok yavaş bir şekilde indirmeye devam edin.Hacmin 25 dakika içinde yavaşça enjekte edilmesi için dijital pompayı dakikada 0,02 mililitreye ayarlayın. Bu işlem geri akışı önleyecek ve başarılı bir yayılma sağlayacaktır. Bazı şırınga tiplerinde infüzyonu başlatın.Madde infüzyonu yapılırken, orijinal koordinatlara geri dönmeden önce şırıngayı yarım milimetre daha ileri itmeyi değerlendirin. Dokunun susuz kalmasını önlemek için açığa çıkan alanı PBS ile ıslatın. İşlem tamamlandığında, şırıngayı geri çekmeden önce beş dakika bekleyin.Bu işlem, materyalin şırınganın izlediği yola geri çekilmek yerine beyne yayılmasını sağlar. Ardından şırıngayı çok yavaşça çıkarın ve geri akış olup olmadığını gözlemleyin. Eğer bir geri akış gözlemlenirse, enjekte edilen materyalin bir kısmı muhtemelen kaybedilmiştir.Histo acron'un hayvanın gözlerine sızmamasına dikkat ederek yarayı histo acron ile kapatın. Ardından, hayvanın dehidrasyonunu önlemek için intraperitonal olarak bir mililitre ısıtılmış salin enjekte edin. Hayvanı ısıtmalı bir ped üzerinde bulunan iyileşme kafesine yerleştirin.Dört ila altı hafta sonra, hayvanı bir saat boyunca iyileşirken izleyin ve hayvanın navigasyon hafızasını Morris su labirentinde olduğu gibi değerlendirin. Lentivirüs, hedeflenen hücrelerin çoğunu enfekte etmiş olacaktır. Bu süre zarfında, ca. içine 0,5 microliter lentivirüs enjeksiyonu yapılmıştır.Fare hipokampusunun bir bölgesi protokolde açıklandığı şekilde hazırlandı. Hayvan daha sonra sakrifiye edildi ve beyninden alınan 40 mikron kalınlığındaki kesitler analiz edildi. GFP ekspresyonu için, DAPI boyaması kırmızı renkte görülebilmektedir.Özetle, bu işlem rostral kodlanmış eksende yaklaşık bir milimetre, medial lateral ve anterior posterior AE'lerde ise yaklaşık 0.5 milimetre çapında enfekte bir küre oluşturmuştur. Mikro RNA kodlayan lente vektörü enjekte edilen fareler, Morris su labirentinde kontrollerle karşılaştırılmıştır. Üç günlük eğitimin ardından, yeşil ile gösterilen kontrol faresinin batık platforma giden temsilci yolu, kırmızı ile gösterilen deney hayvanınınkine göre çok daha kısaydı.Genel olarak, deney hayvanlarının görevi öğrenmesi kontrol grubuna göre daha uzun sürmüştür. Teknik kavrandıktan sonra, bu işlem fare başına yaklaşık 40 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürün uygulanmasındaki tek sınırlayıcı faktör akış hızıdır.Bu prosedürün beyin-vücut iletişimini ne ölçüde değiştirdiği gibi soruları yanıtlamak için sistematik oligonükleotid enjeksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Lentivirüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; tek kullanımlık tyvac laboratuvar önlüğü ve nötr eldivenler gibi önlemler alınmalıdır. Ayrıca, sıvı atık içeren cam ve plastik malzemeler, biyotehlike torbasına atılmadan önce dekontamine edilmelidir.

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Bu video, fare hipokampal beyin dilimlerinde uyarıcı sinaptik akımların mikroRNA aracılı inhibisyonunu göstermektedir. CA3 nöronları, bir floresan raportörü eksprese etmek için bir yapıyı, ışıkla aktive olan bir membran kanalını ve voltaj kapılı kalsiyum kanallarının ekspresyonunu aşağı regüle eden bir mikroRNA'yı barındıran rekombinant bir viral vektör ile enfekte edildi. Bir kayıt odasına bir dilim yerleştirildikten ve bir CA1 nöronunu bir kayıt pipeti ile yamaladıktan sonra, ışıkla aktive...

Fare Hipokampal Dilimlerinde Uyarıcı Postsinaptik Akımların MikroRNA Aracılı İnhibisyonu

Kaynak: Chen, S., et al., Yenidoğan Fare Beyinlerinin Striatal Hücrelerinde Genetik Manipülasyon için Stereotaksik Cerrahi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, Cre rekombinaz ve yeşil floresan proteini veya GFP'yi kodlayan bir viral vektörün, bir loxP ile çevrili STOP kasetini eksize ederek, kırmızı floresan proteinini veya RFP'yi bir raportör olarak aktive ederek gen manipülasyonu elde etmek için genetik olarak değiştirilmiş bir fare yavrusunun striatumuna stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

Bir Fare Yavrusu Striatumunda Gen Manipülasyonu için Viral Bir Vektörün Stereotaktik Mikroenjeksiyonu

Kaynak: Pereira, M. et. al., Viral Vektörlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile Yerleşik Glial Hücrelerin İnternöronlara İn Vivo Doğrudan Yeniden Programlanması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Cre'ye bağımlı nöronal yeniden programlama ve floresan raportör genleri glial hücrelere iletmek için transgenik bir farenin serebral korteksine adeno-ilişkili bir virüsün stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

Bir fare modelinde glial hücre yeniden programlaması için viral vektörlerin stereotaksik enjeksiyonu

Kaynak: Fricano-Kugler, C. J., et al. Stereotaksik enjeksiyon yoluyla yüksek titreli CRISPR retro ve Lentivirüslerin tasarımı, paketlenmesi ve teslimi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare beyninde hassas nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyonu göstermektedir. Protokol, dentat girusa doğru virüs iletimini sağlayarak, nöral devreleri, gen fonksiyonunu ve hastalık mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için floresan etiketleme ve CRISPR aracılı gen nakavtını mümkün kılar.

Fare beyninde hedeflenen nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyon

Bu makalede, fare beynine viral vektörler microinject ve sonra satın alma, yok olma ve iade faz içeren klimalı yerde tercih paradigma test etmek için nasıl.

Cre Recombinase Kokain Klima yeri tercihi Hedef Genlerin Rolü Eğitim için ifade Viral Vektörler stereotaksik Mikroenjeksiyon

Lentivirüsler cDNA'larını ifade eden ya da shRNAs farelerde spesifik beyin bölgelerinde gen ifadesini modüle edebilen stereotaktik enjeksiyon. Burada, biz Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi davranışsal görevleri ile stereotaktik enjeksiyon birleştirmek için bir protokol mevcut.

Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

Burada, amiloid-beta'nın doğrudan stereotaksik beyin infüzyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, amiloid-beta'nın beyin nöronları üzerindeki kısa vadeli etkilerini ele almak için alternatif bir in vivo fare modeli sağlar.

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

MicroRNA'lar beyinde çok önemli roller oynar ve nöro-dejenerasyonu modellemek için potansiyel hedeflerdir. Bununla birlikte, miRNA'nın kısa uzunluğu ve beyin dokusunun erişilememesi nedeniyle miRNA seviyelerini bozmak zordur. Bu video, farelerde bir nöropeptit kullanarak antagomir tasarımı ve beyne özgü uygulama için bir yöntem sunmaktadır.

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Bu makale, infüzyon kanülü ile desteklenmiş özel yapım bir görüntüleme penceresinin hazırlanmasını ve farelerde hipokampüsün CA1 bölgesine implantasyonunu göstermektedir.

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Öğrenin fare hipokampusuna lentivirus enjeksiyonu ile mikroRNA aşırı ekspresyonunun bilişsel etkilerini. Bu yöntem, gen düzenlemesini incelemek için hızlı ve etkili bir alternatif sunar.

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet