Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Bu prosedürün genel amacı, viral olmayan polimerik nanopartiküller kullanarak gen dağıtım deneylerini gerçekleştirmek ve değerlendirmektir. Bu, ilk önce hücrelerin gen dağıtım parçacıkları ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. Transfeksiyon verimliliği daha sonra mikroskopi ve yüksek verimli akış sitometrisi analizi ile değerlendirilir.

Daha sonra, nanopartikül boyutu dağılım konsantrasyonu ve partikül başına plazmitler, bir nanopartikül izleme analiz cihazı kullanılarak belirlenir. Sonuç olarak, bu yöntem nanopartikül boyutu karakterizasyonuna ve nanopartiküller kullanılarak transfeksiyon etkinliğine izin verir. Gen iletimi için biyolojik olarak parçalanabilen polimerik nanopartiküllerin kullanılmasının temel avantajı, diğer gen transfer yöntemlerinden daha güvenli ve daha etkili olabilmeleridir.

Nanopartikül izleme analizinin dinamik ışık saçılımı gibi mevcut yöntemlere göre birincil avantajı, nanopartikül izleme analizinin doğrudan sayı, ortalama dağılım ve partikül konsantrasyonunu vermesidir. Bu yöntem, birlikte ekspresyon çalışmaları için önemli olan parçacık başına plazmit sayısı gibi viral olmayan gen iletimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Aşağıdaki protokol, model hücreler olarak insan retinal endotel hücreleri veya hre ve model polimerler olarak poli beta amino esterler veya PBA AE'ler kullanılarak gösterilmiştir.

Kültür koşullarının ve çözücülerin, 24 saat önce kullanılan hücrelere ve polimerlere bağlı olarak ayarlanması gerekebileceğini unutmayın. Transfeksiyon. Spermi düz bir şekilde tedavi edilmiş berrak doku kültürüne tohumlamak için çok kanallı bir pipet kullanın. Mikrolitre başına 25 ila 50 hücre konsantrasyonunda alt 96 oyuklu plakalar.

Bu, transfeksiyon gününde %70 ila 80 oranında ortak akıcılık sağlayacak, tedavi edilen berrak doku dışı kültürü hazırlayacak ve etiketleyecektir. PBA ve DNA'yı hazırlamak ve seyreltmek için ana plakalar olarak görev yapacak 96 kuyulu plaka. İki özdeş plaka hazırlanacaktır.

Biri toksisiteyi değerlendirmek için, diğeri ise transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için. Oda sıcaklığında poli beta amino ester veya PVAE polimeri ve P-E-G-F-P-N 1D NA stok çözeltilerini takip edin. Toplandıktan sonra, her koşul için 25 milimolar sodyum asetat tamponunda mililitre DNA başına 50 mikrolitre 0.06 miligram içeren bir kuyu hazırlamak için 12 kanallı bir pipet kullanın.

Aynı plakanın daha sonra, PBAE polimerlerini sodyum asetat tamponunda mililitre başına 10 miligrama seyreltin. Daha sonra PBAE polimerlerini, 30 ve 60 ve 50 mikrolitre sodyum asetat tamponunun DNA ağırlık oranlarına polimer ağırlığına seyreltin. Nanopartikül oluşumu için, 50 mikrolitre seyreltilmiş PBA'yı, yukarı ve aşağı pipetleme yoluyla kuvvetlice karıştırılan 50 mikrolitre seyreltilmiş plazma DNA'sı ile birleştirmek için 12 kanallı bir pipet kullanın.

Daha sonra, kendi kendine montaja izin vermek için karışımın oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Kendi kendine montajı takiben, bu şemada gösterildiği gibi koşul başına dört kuyucuk içeren orta transfekt içeren tohumlanmış hücrelerin her bir oyuğuna damla damla 20 mikrolitre nanopartikül çözeltisi eklemek için 12 kanallı bir pipet kullanın. Her plaka için, negatif ve pozitif kontrollerin her biri için en az dört kuyu ayırın.

Negatif kontrol, tedavi edilmemiş hücrelerden ve pozitif kontrollerden oluşur, lipo 2000 veya Fuge hd gibi ticari olarak temin edilebilen bir reaktif ile transfekte edilmiş hücrelerden oluşur. Plakaları, transfekte edilmiş hücrelerle dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin İnkübasyondan sonra, ortamı hücrelerden çıkarmak için 12 kanallı pipeti kullanın ve taze tavşan kuyusu başına 100 mikrolitre ile değiştirin. Orta 24 ila 48 saat daha inkübe edin.

Ertesi gün, inkübatörden bir tabak çıkarın. Floresan mikroskobu ile hücre transfeksiyonunu ve toksisitesini değerlendirin ve ekteki metinde açıklandığı gibi hücre titresi 96 sulu bir test kullanarak hücre toksisitesini ölçün. 48 saat sonra, diğer plakayı inkübatörden çıkarın.

Ekteki metinde açıklandığı gibi floresan, mikroskopi ve akış sitometrisi ile transfeksiyon verimliliğini değerlendirin. Gelecekteki deneyler için kullanılacak PBA'ların optimal konsantrasyonlarını belirlemek için burada elde edilen toksisite ve transfeksiyon verilerini kullanın. Nano site NS 500, nanopartikül numunesinin boyut dağılımı hakkında bilgi sağlayabilen bir nanopartikül izleme analiz cihazıdır, kullanmadan önce nanopartiküllerin sıvı sistemini 0.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde astarlamadan önce nanopartikül numunesinin boyut dağılımı hakkında bilgi sağlayabilir

PBA ve plazma DNA'sını daha önce olduğu gibi, bu videonun önceki bölümünde kullanılan aynı konsantrasyonlarda analiz için hazırlayın. Kendi kendine montajı takiben, en az 500 mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için nanopartikül çözeltisini PBS'de yeni bir 1.5 mililitrelik tüpte 100 kat seyreltin. Bu, nanopartikül izleme analizi için uygun aralıkta bir nanopartikül konsantrasyonu verecektir.

Ardından, örneği nano siteye yükleyin. Ekranda 20 ila 100 parçacık olduğundan emin olmak için görsel olarak kontrol edilen hava kabarcıklarını sokmadığınızdan emin olun. Nanopartikül takibi için ideal bir sayı yaklaşık 50 partiküldür.

Çok fazla veya çok az varsa, NS 500'ü yıkayın, seyreltmeyi PBS'ye ayarlayın ve numuneyi yeniden yükleyin. Ekrandaki parçacık sayısı 20 ila 100 arasındaysa, video çekin. Videolar çekildikten sonra, aynı yazılımda bir video dosyası açarak işleme aşamasına geçin.

Ardından dosya açıldıktan sonra ekran kazancını artırın. Uygun kutuları tıklatarak görüntü parametreleri için otomatik ayarlamayı seçin. Ekrandaki bir parçacık yazılım tarafından tanınırsa, kırmızı bir çarpı ile işaretlenecektir.

Tüm parçacıklar işaretlendikten sonra, video dosyasını işlemek için yazılımdaki işlem düğmesine tıklayın. Partikül boyutu, dağılım boyutu ortalamaları ve partikül konsantrasyonu daha sonra partikül sayımının doğru olduğunu doğrulamak için görüntülenecektir. İki x ve dört ile seyreltilmiş aynı numuneyi kullanarak bu işlemi tekrarlayın.

PBS apre'deki Forex, bu videoda gösterildiği gibi E-G-F-P-P-B-A-E nanopartikülleri ile transfekte edildi. Transfeksiyon verimliliğini görsel olarak değerlendirmek için floresan mikroskobu görüntüleme yapıldı. Bu görüntüler, birleştirilmiş görüntüde görüldüğü gibi, transfekte edilmiş hücrelerin floresan parlak alanını ve birleştirilmiş görüntülerini gösterir, hücrelerin çoğu EGFP'yi eksprese eder ve normal morfolojiyi korur.

Transfeksiyon verimliliğini ölçmek için, canlı popülasyon üzerinde geçit yapıldıktan sonra bu şekilde görülebileceği gibi akış sitometrisi yapıldı. Rezeke edilmemiş popülasyon EGFP pozitif hücreler içermiyordu. Bununla birlikte, tedavi edilen hücrelerin% 71.6'sı EGFP nano sitesi için pozitifti Nanopartikül izleme analizi daha sonra nanopartikül boyut dağılımını ve konsantrasyonunu belirlemek için kullanıldı.

Bu analiz için partikül boyutu dağılımının mono dispers olması önemlidir. Bu bilgi kullanılarak, partikül başına ortalama plazmit sayısı, çözeltideki plazmit konsantrasyonunun NS 500 tarafından belirlenen partikül konsantrasyonuna bölünmesiyle hesaplanabilir. Parçacık başına plazmit sayısı, parçacık boyutu dağılımını yansıtan bir dağılımdır.

Numune içinde, partikül başına plazmit değeri ortalamadan daha büyük olan daha büyük partiküllerin yanı sıra, partikül başına ortalama değerden daha düşük plazmit değerine sahip daha küçük partiküller olacaktır. Bu prosedürü denerken, ncy kullanmak için hücrelere nanopartiküller eklemeden önce bozunabilir polimerlerin sulu çözücüde çok uzun süre kalmasına izin vermemeyi hatırlamak, boyutlandırmaya uygun seyreltmeyi ayarlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, viral olmayan gen taşıyıcı polimerlerle yapışma hücre tiplerinin nasıl transfekte edileceğini, ayrıca transfeksiyon etkinliğinin yanı sıra partikül boyutu dağılımının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

İnsan hücreleriyle çalışmanın biyolojik olarak tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken daima kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir biyogüvenlik kabininde çalışın.