Name: Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin polimerik nanoparçacıklarla gen taşıma yöntemini; mikroskopi ve yüksek verimli akış sitometrisi ile transfeksiyon verimliliğini değerlendirin. Nanoparçacık izleme analizi ile boyut dağılımı ve plazmid içeriğini belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar destek için TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) ve NIH R21CA152473 ederim.

1. Hücre Seeding <ol><li> Hücreleri overconfluency büyümeye izin vermeyin. Birincil hücreler transfekte erken ne zaman geçiş hücreleri kullanın. </li><li> Transfeksiyon öncesi Yirmi dört saat, hücrelerin Trypsinize bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı, ve arzu edilen hücre yoğunluğu (hücre / hacim) elde etmek için ortam ile hücre süspansiyonu seyreltin. Net doku içine Tohum hücrelerinin bir rezervuar ve çok kanallı pipetler kullanarak düz alt 96-kuyucuğu kültür-tedavi. Seçilen yoğunluk transfeksiyon gününde confluency% 70-80 vermelidir. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, örneğin, hücre burada gösterilen veri transfeksiyon için 25-50 hücre / ml&#39; ye seyreltilir edildi. </li></ol> 2. Hücre Transfeksiyon <ol><li> Polimer ve DNA stokların seyreltilmesi. Oda sıcaklığında (RT) az polimer ve DNA stok çözeltileri, çözülme. On iki kanallı pipet kullanarak net 96-kuyucuğu ayrı polimer stok solüsyonu ve DNA stok solüsyonu, sulandırınız, DNA ağırlık oranı (ağırlık / ağırlık) için arzu edilen polimer ağırlığı elde etmek için gereken konsantrasyon ile uygun bir solvent ile. Bu durumda, seçilen çözücü, 25 mM sodyum asetat tamponu (pH = 5.2) &#39;dir. <ol><li> DNA seyreltme. Tipik olarak, 1 mg / ml &#39;de saklanan DNA olmayan bir doku kültürü ile tedavi edilen berrak 96-kuyulu plaka (tek bir formülasyon için iyi bir) 0,03-0,06 mg / ml&#39; lik bir konsantrasyon ile sodyum asetat tamponu içinde seyreltilir. Tablo 2 Adım 1 hücreleri ile tohumlanan 96 çukurlu bir plaka içinde dört tekrarlanan kuyu transfekte etmek için kullanılan tek bir formülasyon için tipik seyreltme DNA protokolü. </li><li> Polimer seyreltme. 100 mg / ml polimer / DMSO çözeltisi DNA ağırlık / ağırlık oranı arzu edilen polimer elde etmek için gerekli olan konsantrasyon göre sodyum asetat tamponu içinde seyreltilir. Genellikle poli (beta-amino ester) s (PBAEs) ile gen dağıtımı için kullanılan ağırlık / ağırlık oranları aralığı 20 ila 100 &#39;dür. PBAE polimerler ilk seyreltme s, ardından 10 mg / ml &#39;ye seyreltilirotokol, Tablo 3&#39;te gösterilmiştir. Polimer seyreltmeler DNA seyreltme plaka yönlendirme örnek uygun olmayan bir doku kültürü ile tedavi edilen berrak 96-kuyulu plaka içinde gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Nanoparçacık oluşumu. On iki kanallı pipet kullanarak plazmid DNA çözeltisi eşit hacmi PBAE çözümü eklenir ve şiddetle karıştırın. Kendi montaj izin vermek için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışım izin verin. </li><li> Nanoparçacık transfeksiyon. Kendi montaj sonrasında, 20 ul nanopartiküller on iki-kanallı bir pipet kullanılarak kültür ortamı ile damla damla başına de eklendi. Replicate kuyu tedavi edilmeyen kontroller olarak veya ticari olarak mevcut reajanlardır ile transfekte edilir. Transfekte hücreler, 37 ° inkübe edilir 2-4 saat sonra kuyular için C taze ortam (100 ul / çukur) ile değiştirilir. İnkübasyon süresi seçimi hücre hattı, kültür koşulları ve transfeksiyon sisteminize bağlıdır. Transfeksiyon farklılıkKuluçka süresi değişen bir sonucu olarak verim ve hücre toksisitesinin Aşama 3&#39;te tarif edildiği gibi analiz protokol ile ölçülür. </li></ol> 3. Transfeksiyon Verimlilik ve Hücre Toksisitesi Analizi Transfeksiyon etkililiği, flöresanlı bir mikroskop ile görsel olarak incelendi ve bir akış sitometresinde kırk sekiz saat post-transfeksiyon kullanılarak ölçülür. Hücre toksisite, flöresanlı bir mikroskop ile görsel olarak incelendi ve CellTiter 96 sulu bir tahlil yirmi-dört saat post-transfeksiyon kullanılarak ölçülür. <ol><li> Floresan mikroskobu. Görsel olarak uygun floresan kanalı kullanılarak transfekte edilen raportör gen (örneğin, EGFP veya DsRed) ifadesi için analiz kuyu. Uygun özel formülasyon (Şekil 1) için transfeksiyon verimliliği temsil görüş alanları seçerken, her sıra için görüntüleri edinin. Görsel gözlemlenen herhangi hücre toksisite bir yere not edin. </li><li> Akış sitometrisi. <ol><li> Akım sitometri için 96-plaka hazırlamak için çok kanallı pipetler kullanın. PBS ile yıkayın, ul / kuyu tripsin / EDTA 30, kenarlarda da dahil olmak üzere, her bir kuyuya, 170 ul FACS tampon (PBS +% 2 FBS) ile pipet kadar nötralize ve aşağı Trypsinize, ve tüm 200-ul hacim transferi Bir yuvarlak tabanlı veya V-alt 96-plaka karşılık gelen kuyulara her iyi. </li><li> 4, 5 dakika boyunca 130 xg&#39;de levha santrifüje ° C. </li><li> Kabarcıklar kaçınarak her süspansiyonu iyi ve pipet hücrelerden 170 ul ortamı çıkarın. Her bir kuyucuğa, a canlılığı propidyum iyodür (PI) gibi leke kullanmak için, FACS tamponu + PI (PI stok konsantrasyonu 1 mg / ml &#39;PI seyreltme 50:1 FACS tampon) 10 ul ekle. Hemen buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kapsamaktadır. </li><li> C6 Accuri akış sitometresi, 96-eki HyperCyt ve HyperView yazılımını başlatın. Uygun p seçmek HyperView Tasarım ve Protokol sekmeleri kullanınGeç tipi, plaka düzeni ve bu tür sallamak / yudum gibi diğer ayarlar / / durulama zamanı sallayın. Yukarıdaki protokol için, aşağıdaki parametreler bir dakika ve 2400 rpm&#39;de 30 saniye boyunca bir ön plaka sallamak için, bir ön plaka asal kullanılmıştır. Sip süresi 15 rpm&#39;de 15 sn için kuruldu, bir prob 2 sn de her durulayın ve bir inter-de 2,400 rpm&#39;de 12 saniye boyunca her 12 kuyuda sallayın. Inter-de sarsıntı hücrelerin kuyu grupları arasında zamanlanmış sonları (bu durumda 12 saniye içinde) ekleyerek verileri işlemek için gelişmiş yeteneği yanı sıra, medyada dağınık tutmak için önemlidir. </li><li> Uygun zamanda (Şekil 2) içine veri ve ayrı işleme HyperView Peki Kimlik sekmesini kullanın. Bireysel kuyular tespit etmek için, bu yazılım gürültü filtresi yanı sıra gelişmiş ayarları altında bile filtre bir baz dahil olmak üzere kullanmak için yardımcı olabilir. </li><li> Farklı açılır ayırmak için uygun yolluk tarafından olumlu transfekte canlı hücrelerin yüzdesi sayısalulations (Şekil 3). İlk enkaz (Şekil 3A) ayrı hücreleri için bir FSC vs SSC dağılım arsa üzerinde akış verileri görüntülemek. Propidium iyodür (PI) kullanılmışsa, kapı bireysel hücre popülasyonu ve görünümü bir FSC vs FL3 arsa üzerinde veri ölü hücreleri ve kapı canlı hücrelerin canlı hücreleri ayırmak için. Transfekte edilmiş hücrelerin sayısı ölçmek için, uygun kanal üzerinde bir canlı hücre nüfusunun görünüm, örneğin GFP FL1 görülebilir. Kapısı arka plan sinyali (Şekil 3B) tespit etmek için, tedavi edilmeyen nüfus işlenmemiş hücreler kullanılması. Olumlu transfekte hücreler daha sonra bu kapı kullanılarak izole ve scatter ve kontur grafikleri (Şekil 3C ve 3D) her ikisini de kullanarak transfekte nüfus görüntüleyerek. Edilebilir Farklı hücre floresan farklı derecelerde transfekte edileceği gibi, pozitif olarak transfekte edilmiş hücrelerin bir süreklilik içinde olabilir. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 sulu bir tahlil <ol><li> Hücre toksisite ölçümleri için tam olarak aynı şekilde başka bir plaka transfekte. </li><li> 10 ml taze medya ile CellTiter 96 sulu bir test solüsyonu Premiks 1 ml. Hücreleri bulunan ortamı çıkarın ve premix çözüm 110 ul + kuyu başına medya eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Işlenmemiş koşulu ile kuyudan absorbans testin lineer aralığında kadar 490 nm 1 ila 4 saat için her bir saat arayla absorbansı ölçülür. Bir arka plan absorbans okuma için tek çözüm + medya ile dört kontrol kuyuları ekleyin. </li><li> Ortalama absorbans koşulu başına dört tekrarında kuyulardan değerleri ve her ortalama ortalama plan absorbans çıkarın. Yüzde hücre yaşayabilirliği belirlemek için, tedavi edilmeyen durumun düzeltilmesi için ortalama her bir tedavi edilen durum için düzeltilmiş ortalama normalize edilir. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. Nanoparçacık NTA ve Plazmid Başına Parçacık Hesaplamaları ile Boyutlandırma <ol><li> Yaklaşık 1/5th maksimum hız ve maksimum hız yaklaşık 1/10th de geriye örnek pompa ileri seyreltici pompa çalıştırarak Nanosight NS500 Prime Sıvıların sistemi. Sıvıların sistemi seyreltici ile temizlendi kadar devam edin. </li><li> Analiz edilecek nanoparçacıklar hazırlayın. PBAEs durumunda, ayrı ayrı stok plasmid DNA (1 mg / ml) ve Eppendorf tüpleri içinde sodyum asetat tampon içinde stok PBAE (100 mg / ml) (25 mM, pH 5) seyreltin. </li><li> 0.06 mg / ml &#39;ye plazmid DNA konsantrasyonu seyreltilir. Polimer konsantrasyonu DNA polimer için gerekli ağırlık-ağırlık oranına bağlı olarak değişebilir (60 ağ / ağ parçacık için, örneğin, polimer 3.6 mg / ml &#39;ye seyreltilir). </li><li> Plazmid DNA çözeltisinin eşit bir hacmi ile polimer solüsyonu eklenir ve güçlü bir şekilde karıştırılır. Kendi montaj izin vermek için 10 dakika için oda sıcaklığında karışım inkübe edin. </li><li> DiUd nanoparçacık konsantrasyon için sırayla 100 kat PBS içine nanoparçacık çözelti NTA için uygun bir aralık içinde olması ve en azından 500 ul nihai hacim elde etmek için. </li><li> Örnek Eppendorf tüpü (Şekil 4A), yükleme borusu içine yerleştirerek Nanosight içine örnek yerleştirin. Hava kabarcıkları tanıtmak için değil emin olun. </li><li> Parçacıklar görülebilir kadar yakalama modunda, kamerayı düzeyini artırmak. Partikülleri (Şekil 4A ve 4B) düzgün bakmak böylece odak ayarlayın. </li><li> Standart modda iken, tüm parçacıkların ekranda görülebilir noktadan kamera düzeyini ayarlayın. Ardından parçacıklar hâlâ görülebilir böyle düşük seviyeye kamera seviyesini azaltmak. Bir ara kamera seviyesinde gerekli ise, gelişmiş moduna geçer ve kamera deklanşör değiştirmek ve uygun düzeylere kazanmak. </li><li> Görme 20 arasında olmadığından emin olmak için kontrol edin - s 100 partiküllerkontrastını ve parlaklığını. Nanoparçacık izleme için ideal sayı yaklaşık 50 parçacıklardır. Çok fazla veya çok az varsa, NS500 floş PBS içine seyreltme ayarlayın ve örnek yeniden yükleyin. </li><li> Standart mod tabloya göre yakalama süresini ayarlayın. Genellikle 30 - 60 saniye uygun bir yakalama uzunluğu (Şekil 4B) &#39;dir. </li><li> Sonraki örnek yüklemek için, yeniden yüklemek yeni bir örnek daha sonra, sistem yıkayın. </li><li> Bir kez videoları yakalanır, bir video dosyasını açarak işlem aşamasına geçin. </li><li> Iyi (Şekil 4C) bir video işlemek için ayarlanabilir parametreleri vardır. Amaç en iyi şekilde her parçacık (Şekil 5) üzerindeki ekranda kırmızı bir çarpı işareti ile belirtilir ekrandaki her parçacık, yakalama parametrelerini seçmektir. </li><li> Iyi partikülleri görmek için ekrana kazanç artırın. Standart veya gelişmiş modu altında, otomatik üzerine tıklayarak tarafından parametrelerini ayarlamak seçing uygun kutuları. Otomatik ayarlar yeterli parçacıklar seçmemeniz durumunda, unclick kutusu ve parametreleri manuel olarak (Şekil 4C) ayarlayın. </li><li> Bir zamanlar tüm parçacıkların ekranda toplanır, video dosyası (Şekil 4C) işlemek için yazılım süreci düğmesini tıklatın. Bu, parçacık boyutu dağılımı, ortalama boyutu, hem de partikül konsantrasyonu sağlar. </li><li> Partikül konsantrasyonu doğru olduğundan emin olmak için, 2x seyreltme artırarak PBS seyreltme gibi değiştirin ve yukarıdaki işlemi tekrarlayın. Aynı örnek çoklu dilüsyonları ölçülmesi örnek konsantrasyon ölçüm doğru olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. Ölçümü için iyi bir dizi 10 7 -10 9 parçacıklar / ml &#39;dir. </li><li> Tüm plazmidler nanopartiküller jel elektroforezi çalışan ve herhangi bir serbest DNA mevcut olup olmadığını değerlendirerek nanopartiküller dahil olduğunu doğrulayın.Tüm plazmid kapsüllü ise, toplam kapsüllü plazmidler ölçmek amacıyla DNA absorbans ölçmek için standart teknikleri kullanın. </li><li> Parçacık başına plazmidlerin ortalama sayısını hesaplamak için, NTA ölçülen partikül konsantrasyonu ile toplam kapsüllü plazmid konsantrasyonu bölün. Plazmid başına parçacık örnek dağılımını tahmin etmek için, ilk olarak partikül her bir 1-nm kabın hacim fraksiyonu hesaplamak için NTA parçacık boyutu histogram kullanır. Her bin plazmid sayısını elde etmek için toplam plazmid miktarı ile bu hacim fraksiyonu dağıtım çarpın. Her parçacık boyutu (Şekil 6) plazmidler başına partikül sayısını elde etmek için, her bin parçacıkların sayısı bu sayıyı böler. </li></ol>

<ol><li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li>
<li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rita+Schaffer+Lecture%3A+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li>
<li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+poly%28beta-amino+esters%29%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+self-assembly+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li>
<li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure%2C+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li>
<li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li>
<li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li>
<li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly%28beta-amino+esters%29+for+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li>
<li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947(2009).</li>
<li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li>
<li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li>
<li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+solution+of+%28Lys%29%2816%29-containing+bifunctional+synthetic+peptide%2FDNA+nanoparticles+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li>
<li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor.

Yukarıdaki protokol nanoparçacık formülasyonların transfeksiyon etkinliği gibi parçacık boyutu ve nanoparçacıkların DNA yükleme karakterize etmek için bir yöntem değerlendirme yöntemleri açıklanmaktadır. Parçacık başına plazmit sayısı parçacık etkisini tahmin yardımcı olabilir önemli bir parametre olan ve aynı zamanda doz tayini için kullanılabilir. Nanopartikül izleme analizi, tuz konsantrasyonunun farklı olanlar gibi çeşitli sulu çözeltiler, bir dizi içinde gerçekleştirilebilir. Genellikle bu tanımlama fizyolojik tuzl...

Nanoparçacık başına komplekslenmiş plazmid sayısının belirlenmesi, özellikle de aynı hedef hücre için birden çok plazmit ortak dağıtımı için etkili nanoparçacık tabanlı bir gen aktarım stratejilere tasarlamak için önemli olan, sıklıkta çalışmaları 12 yeniden programlanması kök hücre gereklidir. Tek bir nanoparçacık ile ilişkili plazmid sayısını hesaplamak için birkaç yaklaşım tarif edilmiştir ve her bir yaklaşım tahmin 13-16 için kullanılan teknikler de dezavantajları vardır edilmiştir. TEM ile birlikte Kuantum nokta (QD) etiketleme kitosan tabanlı nanopartiküller parçacık başına plazmidler tahmin etmek için kullanılır olmuştur. Kapsüllü etiketsiz DNA doğrudan tespit edilememesi olasılığı;; potansiyel örtüşen plazmidler ve parçacıkların 2D TEM görüntülerde QDS; Bu QD teknik ile Kestirimi nedeniyle kendinden montaj özelliklerini değiştirebilir DNA, etiketlemek için ihtiyaç karmaşık ve Diğer basitleştirici kabuller 13. Bir alternatif bir yaklaşımpplicable sipariş microdomains parçacıklar mevcut olduğunda kriyo-transmisyon elektron mikroskobu (kriyo-TEM), X-ışını saçılması ve dinamik ışık saçılımı (DLS) 14,15 aracılığıyla Lipopolyamine-DNA kompleksleri incelemek için kullanılır olmuştur. Ne yazık ki, bu tür araştırmak burada polimer nanopartikülleri gibi malzemeler bu yöntem ile uygulanabilir değildir. . Ancak, kendi yöntemi sadece büyük, mikron boyutlu parçacıklar 16 değerlendirebilir; başka bir çalışmada, Collins ve ark çalışmak için bir akış parçacık görüntü analizi tekniği (Lys) 16-içeren peptid / DNA kompleksleri kullanılır. Böylece, son zamanlarda nanoparçacık 11 başına plazmit sayısı ölçmek için bir roman ve esnek analiz geliştirilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Fosfat, 1x (PBS) Tamponlu Salin </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2mV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum asetat tampon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Deiyonize su 25mM için seyreltin </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biyofarmasötikler </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, dallı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 sulu One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeler </td></tr><tr><td> Şeffaf düz dipli 96-plaka, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Açık bir yuvarlak tabanlı 96-kuyulu plaka, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 kanallı Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 ve 50-300 ul </td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Model numarası: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri flowsitometri </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt eki </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> Nanosight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

polimerik gen taşıyıcı değerlendirilmesi nanoparçacık İzleme analizi ve yüksek throughput flow sitometri tarafından nanopartiküller

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik nano partiküller kullanarak Sigara viral gen teslimat genetik hastalıklar 1. tedavisinde gen tedavisi için cazip bir yaklaşım olarak ve rejeneratif tıp 2 için bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Önemli güvenlik sorunları var virüsler, aksine, polimerik nano partiküller büyük nükleik asit kargo ve biyolojik olarak parçalanabilen ve / veya çevreye duyarlı taşıma kapasitesine sahip, kimyasal olarak çok yönlü, sentezlemek için non-toksik, non-immünojen olmayan mutajenik, daha kolay olması için dizayn edilebilir. Katyonik polimerler yaygın polimerik nano partiküller olarak adlandırılır 100 nm sırasına komplekslerini oluşturmak için elektrostatik etkileşim yoluyla negatif yüklü DNA ile kendi kendine monte. Nano ölçekli polikatyonik gen aktarımı nanopartikülleri oluşturmak için kullanılan biyomateryaller örnekleri arasında bir non-parçalanabilir off-the-shelf bir polilisin, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s ve polietilenimin (PEI), yaygın olarak bulunur nükleik asit aktarımı ile 1,3 kullanılan katyonik polimer. Poli (beta-Aminoester) s (PBAEs), 5,6 hidrolitik olarak parçalanabilir olan ve bu tür insan retina endotel hücreleri (HRECs) 7 gibi sert-transfekte hücre tipleri için gen aktarımının etkili olduğu gösterilmiş olan katyonik polimerler 4 yeni bir sınıfıdır fare meme epitel hücreleri 8, insan beyninin kanser hücreleri 9 ve 10 makrovasküler (insan umbilikal ven, HUVEC&#39;lere) endotel hücreleri. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) kullanılarak polimer nanopartikülleri karakterize etmek için yeni bir protokol tarif edilmektedir. Bu yaklaşıma göre, partikül büyüklük dağılımı ve parçacık başına plazmid sayısı dağılım hem de 11 elde edilir. Buna ek olarak, polimer nanopartikülleri ile transfeksiyon etkinliğinin hızlı taranması için olan bir yüksek verimli 96-plaka transfeksiyon deneyinde sunulmuştur. Bu protokol, poli (beta-amino ester) s (PBAEs) model polimerler ve insan retina endotel hücreleri (HRECs) olarak kullanılır mo olarak kullanılmaktadırdel insan hücreleri. Bu protokol, kolayca herhangi bir polimerik nanoparçacık ve bir multi-plaka biçiminde ilgi herhangi bir hücre tipi değerlendirmek için adapte edilebilir.

Şekil 1, plazmid EGFP HRECs ile başarılı bir şekilde aktarılmasının bir örnek olarak, flöresanlı bir mikroskop görüntüsü gösterilmektedir. Aydınlık görüntü hücreleri normal morfoloji korumalarını sağlamak için yardımcı olur. Ayrıca, bu tür MTS ya da benzer deneyler gibi hücre canlılığı deneyleri, nanoparçacık toksisite 7 değerlendirmek için de kullanılabilir. Akış sitometrisi, tarif edildiği gibi, transfeksiyon etkinliği ölçmek için kullanılabilir. HyperCyt çoklu-plaka ek kullanırken, veriler...

Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Bu prosedürün genel amacı, viral olmayan polimerik nanopartiküller kullanarak gen iletim deneyleri gerçekleştirmek ve bunları değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin gen iletim partikülleri ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Transfeksiyon verimliliği daha sonra mikroskopi ve yüksek kapasiteli akış sitometrisi analizi ile değerlendirilir.Ardından, bir nanoparçacık izleme analizi cihazı kullanılarak nanoparçacık boyut dağılımı konsantrasyonu ve parçacık başına plazmid sayısı belirlenir. Nihayetinde bu yöntem, nanoparçacık boyut karakterizasyonuna ve nanoparçacıklar kullanılarak gerçekleştirilen transfeksiyon etkinliğinin değerlendirilmesine olanak tanır. Gen iletimi için biyobozunur polimerik nanoparçacıklar kullanmanın temel avantajı, bunların diğer gen transfer yöntemlerinden daha güvenli ve daha etkili olabilmeleridir.Nanoparçacık takip analizinin, dinamik ışık saçılımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nanoparçacık takip analizinin doğrudan sayı ortalamalı dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu vermesidir. Bu yöntem, ko-ekspresyon çalışmaları için önemli olan parçacık başına plazmid sayısı gibi, viral olmayan gen aktarımı alanındaki temel soruların ya

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makale diblock co-polimerler kullanarak polimer bazlı nanopartiküller sentezlemek için nanoprecipitation yöntem açıklanır. Biz diblock sentezi co-polimerler, nanoprecipitation tekniği ve potansiyel uygulamalar ele alınacaktır.

Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

B Tipi jelatin tabanlı mühendislik nanovectors sistemi (gens), pankreas kanseri tedavisi sistemik gen teslimat ve transfeksiyon için geliştirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) nanparticles yüzey üzerinde belirli peptid değişiklik, EGFR reseptör hedef olabilir ve plazmid gibi yüksek intrasellüler glutatyon konsantrasyonları olarak azaltılması, çevre altında serbest.

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Bu el yazması, floresan işaretli nanopartiküllerin doğrudan canlı hücrelerde endositozundan sonra hücre içi gen ekspresyonunun saptanmasına izin veren yeni bir tekniği tanımlamaktadır. Yöntem, hücrelerin manipülasyonunu gerektirmez ve hedef gen veya türe göre sınırlı değildir.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

Nanoilaçların in vivo performansının zayıf anlaşılması, klinik translasyonlarını engellemektedir. Tümör taşıyan immünokompetan farelerde kanser nanoilaçlarının sistemik, doku, tek hücreli ve subselüler düzeylerde in vivo davranışını değerlendirme prosedürleri burada açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, araştırmacıların klinik çeviri için umut verici kanser nanoilaçlarını tanımlamalarına yardımcı olabilir.

Kapsamlı Usulü değerlendirin<em&gt; İn Vivo</em&gt; Kanser Nanomedicines performans

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Burada, poli (beta aminoester) polimerlere dayalı mRNA nanopartikülleri üretmek için basit bir protokol sunulmaktadır, kapsüllenmiş mRNA değiştirilerek uyarlanabilir. Polimerleri, nanopartikülleri ve in vitro temel karakterizasyonlarını sentezlemek için iş akışı da açıklanmıştır. Bağışıklama ile ilgili bir kavram kanıtı da ekleniyor.

Aşı Amacıyla mRNA Yüklü Poli (Beta Aminoesterler) Nanopartiküllerinin Sentezi ve Karakterizasyonu

Bu protokol, Rayleigh parçalanmasını viral olmayan mRNA vektörlerinin aerosolize edilmesi için hafif bir süreç olarak sunar. Aerosol mRNA vektörleri için bölgesel birikim, Alberta İdealize Burun Girişi (AINI) modeliyle değerlendirilmiştir. İnsan akciğer hücrelerinde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu, aerosol sonrası mRNA vektörlerinin fizikokimyasal ve biyolojik işlevlerinin korunmasını temsil eder.

Rayleigh Parçalanma Aerosolleri Yoluyla MRNA Poliplekslerinin Burun İçinden Ulaşılması: Burun Biriktirme ve Fonksiyonel Test İçin Vitro Yöntem

Öğrenin polimerik nanoparçacıklarla gen taşıma yöntemini; mikroskopi ve yüksek verimli akış sitometrisi ile transfeksiyon verimliliğini değerlendirin. Nanoparçacık izleme analizi ile boyut dağılımı ve plazmid içeriğini belirleyin.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller (Video) | JoVE Journal

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Daha fazla video keşfet