Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Bu prosedürün genel amacı, viral olmayan polimerik nanopartiküller kullanarak gen iletim deneyleri gerçekleştirmek ve bunları değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin gen iletim partikülleri ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Transfeksiyon verimliliği daha sonra mikroskopi ve yüksek kapasiteli akış sitometrisi analizi ile değerlendirilir.

Ardından, bir nanoparçacık izleme analizi cihazı kullanılarak nanoparçacık boyut dağılımı konsantrasyonu ve parçacık başına plazmid sayısı belirlenir. Nihayetinde bu yöntem, nanoparçacık boyut karakterizasyonuna ve nanoparçacıklar kullanılarak gerçekleştirilen transfeksiyon etkinliğinin değerlendirilmesine olanak tanır. Gen iletimi için biyobozunur polimerik nanoparçacıklar kullanmanın temel avantajı, bunların diğer gen transfer yöntemlerinden daha güvenli ve daha etkili olabilmeleridir.

Nanoparçacık takip analizinin, dinamik ışık saçılımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nanoparçacık takip analizinin doğrudan sayı ortalamalı dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu vermesidir. Bu yöntem, ko-ekspresyon çalışmaları için önemli olan parçacık başına plazmid sayısı gibi, viral olmayan gen aktarımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Aşağıdaki protokol, model hücreler olarak insan retinal endotelyal hücreleri veya hre ve model polimerler olarak poli beta amino esterler veya PBA AE'ler kullanılarak gösterilmiştir.

Kültür koşullarının ve çözücülerin, kullanılan hücrelere ve polimerlere bağlı olarak transfeksiyondan 24 saat önce ayarlanması gerekebileceğini unutmayın. Hücreleri, mikrolitre başına 25 ila 50 hücre konsantrasyonunda, şeffaf doku kültürü işleminden geçmiş düz tabanlı 96 kuyucuklu plakalara ekmek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Bu, transfeksiyon gününde %70 ila %80 konfluens sağlayacaktır; PBA ve DNA'yı hazırlamak ve seyreltmek için ana plaklar olarak kullanılacak olan, doku kültürü için işlem görmemiş şeffaf 96 kuyucuklu plakları hazırlayın ve etiketleyin. Birbirinin aynısı iki plaka hazırlanacaktır.

Biri toksisiteyi değerlendirmek için, diğeri ise transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek içindir. Oda sıcaklığındaki poly beta amino ester veya PVAE polimer ve P-E-G-F-P-N 1D NA stok çözeltilerini takip edin. Homojen hale getirildikten sonra, her bir koşul için 25 millimolar sodyum asetat tamponu içinde 0,06 milligrams per milliliter DNA içeren 50 microliters'lik bir kuyu hazırlamak amacıyla 12 kanallı bir pipet kullanın.

Aynı plaka üzerinde sırasıyla, PBAE polimerlerini sodyum asetat tamponunda 10 mg/mL konsantrasyona seyreltin. Ardından PBAE polimerlerini, polimer ağırlığının DNA ağırlığına oranı 30 ve 60 olacak şekilde 50 µL sodyum asetat tamponu ile daha fazla seyreltin. Nanopartikül oluşumu için, 12 kanallı bir pipet kullanarak 50 µL seyreltilmiş PBA'yı 50 µL seyreltilmiş plazma DNA'sı ile birleştirin ve pipetle yukarı-aşağı hareketlerle kuvvetlice karıştırın.

Ardından, kendi kendine montajın gerçekleşmesi için karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Kendi kendine montaj işleminin ardından, 12 kanallı bir pipet kullanarak, besiyeri içeren hücre ekili her bir kuyucuğa nanopartikül solüsyonundan damla damla 20 µL ekleyin; bu diyagramda gösterildiği gibi koşul başına dört kuyucuğu transfekte edin. Her plak için negatif ve pozitif kontrollerin her birine en az dört kuyucuk ayırın.

Negatif kontrol, işlem görmemiş hücrelerden; pozitif kontroller ise lipo 2000 veya Fuge hd gibi ticari olarak temin edilebilen bir reaktif ile transfekte edilmiş hücrelerden oluşur. Transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu plakaları 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 12 kanallı pipet kullanarak hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve her kuyucuğa 100 µL taze hre besiyeri ekleyin. 24 ila 48 saat daha inkübe edin.

Ertesi gün, inkübatörden bir plakayı çıkarın. Hücre transfeksiyonunu ve toksisitesini floresan mikroskobu ile değerlendirin ve hücre toksisitesini, beraberindeki metinde açıklandığı şekilde cell titer 96 aqueous one deneyi kullanarak nicelendirin. 48 saat sonra, diğer plakayı inkübatörden çıkarın.

Transfeksiyon verimliliğini, ekteki metinde açıklandığı şekilde floresan, mikroskopi ve akış sitometrisi ile değerlendirin. Gelecekteki deneylerde kullanılacak optimal PBA konsantrasyonlarını belirlemek için burada elde edilen toksisite ve transfeksiyon verilerini kullanın. nano site NS 500, tekil nanopartiküllerin difüzyonunu takip ederek bir nanopartikül örneğinin boyut dağılımı hakkında bilgi sağlayabilen bir nanopartikül takip analizi cihazıdır; kullanmadan önce nano site'ın akışkan sistemini 0,5 ml'lik bir mikro santrifüj tüpü ile hazırlayın.

PBA ve plazma DNA'sını, bu videonun önceki bölümünde kullanılan konsantrasyonlarda analiz için önceden olduğu gibi hazırlayın. Kendi kendine montajın ardından, nanopartikül çözeltisini yeni bir 1,5 mililitre tüp içerisinde PBS ile 100 kat seyrelterek en az 500 mikrolitre nihai hacim elde edin. Bu işlem, nanopartikül takip analizi için uygun aralıkta bir nanopartikül konsantrasyonu sağlayacaktır.

Ardından, numuneyi nano bölmeye yükleyin. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin ve ekranda 20 ila 100 arasında partikül olduğundan görsel olarak emin olun. Nanoparçacık takibi için ideal sayı yaklaşık 50 partiküldür.

Eğer çok fazla veya çok az partikül varsa, NS 500'ü yıkayın, PBS içindeki dilüsyonu ayarlayın ve örneği yeniden yükleyin. Ekrandaki partikül sayısı 20 ile 100 arasındaysa videoları kaydedin. Videolar kaydedildikten sonra, aynı yazılımda bir video dosyası açarak işleme aşamasına geçin.

Dosya açıldıktan sonra, ekran kazancını (screen gain) artırın. Uygun kutucuklara tıklayarak görüntü parametreleri için otomatik ayarlamayı seçin. Ekrandaki bir partikül yazılım tarafından tanındığında, kırmızı bir artı ile işaretlenecektir.

Tüm partiküller işaretlendikten sonra, video dosyasını işlemek için yazılımdaki işlem butonuna tıklayın. Ardından, partikül sayısının doğruluğunu teyit etmek için partikül boyutu, dağılım boyutu ortalamaları ve partikül konsantrasyonu görüntülenecektir. Aynı numuneyi iki ve dört kat seyrelterek bu prosedürü tekrarlayın.

PBS içindeki Forex'ler, bu videoda gösterildiği gibi E-G-F-P-P-B-A-E nanoparçacıkları ile transfekte edilmiştir. Transfeksiyon verimliliğini görsel olarak değerlendirmek için floresan mikroskobu görüntüleme yapılmıştır. Bu görüntüler, transfekte edilen hücrelerin floresan, parlak alan ve birleştirilmiş görüntülerini göstermektedir; birleştirilmiş görüntüde görüldüğü üzere, hücrelerin çoğunluğu EGFP eksprese etmekte ve normal morfolojilerini korumaktadır.

Transfeksiyon verimliliğini nicelleştirmek için, bu şekilde görüldüğü üzere, canlı popülasyon üzerinden kapılama (gating) yapıldıktan sonra akış sitometrisi gerçekleştirilmiştir. Rezeke edilmemiş popülasyonda EGFP pozitif hücreler bulunmamaktaydı. Ancak, işlem görmüş hücrelerin %71,6'sı EGFP için pozitifti. Ardından, nanopartikül boyut dağılımını ve konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi kullanılmıştır.

Bu analiz için partikül boyut dağılımının monodisper olması önemlidir. Bu bilgi kullanılarak, çözeltideki plazmid konsantrasyonunun NS 500 ile belirlenen partikül konsantrasyonuna bölünmesiyle partikül başına düşen ortalama plazmid sayısı hesaplanabilir. Partikül başına düşen plazmid sayısı, partikül boyut dağılımını yansıtan bir dağılımdır.

Numune içerisinde, partikül başına plazmid değeri ortalamanın üzerinde olan daha büyük partiküllerin yanı sıra, partikül başına plazmid değeri ortalamadan daha düşük olan daha küçük partiküller de bulunacaktır. Bu prosedürü uygularken, ncy kullanımı için nanopartiküller hücrelere eklenmeden önce parçalanabilir polimerlerin sulu çözücüde çok uzun süre kalmamasına dikkat etmek önemlidir; boyutlandırma için seyreltmeyi uygun şekilde ayarlayın. Bu videoyu izledikten sonra, yapışkan hücre tiplerinin viral olmayan gen aktarım polimerleri ile nasıl transfekte edileceği, ayrıca transfeksiyon etkinliğinin ve partikül boyut dağılımının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

İnsan hücreleriyle çalışmanın biyotehlike oluşturduğunu unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir biyogüvenlik kabininde çalışın.