Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Bu prosedürün genel amacı, rekabetçi bir fare kemik iliği transplantasyon modelinde donör hücre tutunumunu nicelleştirmek için PCR tabanlı bir teknik uygulamaktır; bu işlem, öncelikle dişi alıcı farelere erkek donör hücreler kullanılarak kemik iliği transplantasyonu yapılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, alıcı farelerden farklı zaman noktalarında periferik kan toplanır ve genomik DNA izole edilir. Örnekler, bir standart eğri için hazırlanır.

Son olarak, standart örnekler ve test örnekleri ile gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilir. Nihayetinde, bilinen bir erkek/dişi DNA yüzdesine sahip bir standart eğriye karşı hesaplama yapılarak, dişi alıcı farelerde erkek donör kaynaklı hücrelerin tutunmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, akış sitometrisi tabanlı yöntem gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha hassas ve daha ekonomik olması ve örneklerin uzun süre saklanabilmesidir.

En önemlisi, tekniğimiz büyük oranda diziden bağımsızdır ve donör hücreyi alıcı hücrelerden ayırt etmek için iyi tanımlanmış hücre yüzey markörleri gibi farelerin herhangi bir genomik arka planı için kullanılabilir. Laminer akışlı kabin altında FVB nj, erkek donör ve dişi fareler ötanize edildikten sonra, femur ve tibia kemiklerini çıkarmak için küçük makas ve pens kullanarak bunları 6 ml buz gibi soğuk, %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren RPMI 1640 bulunan 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Kas ve diğer dokuları temizlemek için bir Kimwipe kullanın ve her bir kemik şaftının iki ucunu kap içerisinde kesin. Ardından, kemiklerin ucunu %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren RPMI 1640 ile doldurulmuş 3 cc'lik bir şırıngaya takılı 23 gauge iğneye bağlayın ve iliği yıkayarak dışarı çıkarın.

Tekrarlanan aspirasyonlar ile kemik iliği dokusunu ayrıştırmak için aynı iğneyi kullanın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 400 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri bir mililitre oda sıcaklığındaki eritrosit lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin ve %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren 5 ila 10 mililitre RPMI 1640 eklemeden önce oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin; hücreleri bir hücre süzgecinden geçirin ve süzüntüyü yeni bir tüpe toplayın. Hücreleri 400 G'de beş dakika santrifüjleyip süpernatanı uzaklaştırdıktan sonra, peletin kırmızı renkten arınmış olması gerekir, bu da eritrositlerin tamamen uzaklaştırıldığını gösterir; hücreleri %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren 10 mililitre RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin, nazikçe vorteksledikten sonra hemositometreye küçük bir alikot ekleyin ve hücreleri sayın.

Kemik iliği transplantasyonu için rekabetçi dişi hücrelerle beşe iki oranında karıştırılması gereken hücre hacmini hesaplayın. Hücreleri enjeksiyona hazırlamak için son adım olarak, transplantasyondan dört ila altı saat önce donör ve rekabetçi hücreleri karıştırın, hücreleri pelletleyin, PBS ile yıkayın ve donör hücreler için mililitre başına 5 × 10⁶ ve rekabetçi hücreler için mililitre başına 2 × 10⁶ nihai konsantrasyonda PBS içinde yeniden süspande edin. Dişi alıcı fareleri, tek doz 11 gray sezyum 137 gama radyasyonu ile ışınlayın.

Işınlanmış dişi fareleri bir fare sabitleyiciye yerleştirin ve kan örnekleri almak amacıyla, her bir fareye 5 × 10⁵ donör hücresi ve 2 × 10⁵ kompetitör kemik iliği hücresi gelecek şekilde, toplam 0,1 mL hacmindeki karışık donör ve kompetitör hücrelerini kuyruk veninden enjekte edin. Fareleri anestezi altına aldıktan sonra, retroorbital kanama yoluyla EDTA kaplı tüplere yaklaşık 50 µL kan toplayın. Ayrıca yaşa uygun erkek ve dişi farelerden de örnekler toplayın.

Ardından, denek farelerden ve farelerden genomik DNA izole edin. Standart eğri için, her kan örneğine oda sıcaklığında yaklaşık 200 µL RBC lizis tamponu ekleyin ve beş dakika inkübe edin. 1 mL PBS ekleyin ve lizis olmuş RBC'lerin çoğunu uzaklaştırmak için santrifüjleyin.

Ardından, elüsyon tamponunu 37 °C'ye önceden ısıtarak DNA'yı izole etmek için bir kan DNA ekstraksiyon kiti kullanın. Verimi artırmak için her örneğin DNA konsantrasyonunu ölçün. OD 260/280 oranı 1.8 ile 2.0 arasında olanlar ileri analizler için kullanılır.

Bir standart eğrisi oluşturmak için, erkek ve dişi DNA'yı mikrolitre başına dört nanogram konsantrasyona seyreltin ve DNA karışımını bu kılavuzlara göre hazırlayın. Cyber green super mix reaktifini, burada gösterilen primerler ve genomik DNA ile karıştırarak PCR reaksiyon plağını hazırlayın. Her 20 mikrolitrelik reaksiyon, her bir primerden 400 nano molar ve üç tekrarlı olarak çalışılan beş mikrolitre kan hücresi genomik DNA içerir.

Metin protokolünde yer alan koşullara göre PCR gerçekleştirin ve döngü eşiği veya CT değerlerini elde edin. Delta CT çarpı miktar CT üzeri ZY bir eksi CT üzeri BCL iki ile ZY bir ekspresyon seviyelerini veya iki üzeri eksi delta CT değerlerini hesaplayın; üç tekrarlı iki üzeri delta CT değerlerinin ortalamasını, doğrusal regresyon uyumu gösterilerek karışımdaki bilinen erkek DNA yüzdesiyle grafikleyerek standart eğriler oluşturun. Burada, iki üzeri delta CT ortalama değerlerinin erkek DNA yüzdelerine karşı çizilmiş standart eğri örnekleri yer almaktadır.

Bu grafik, sırasıyla 78,5 ve 88,5 °C'de yer alan BCL2 ve ZFY1 amplikonları için spesifik bir erime sıcaklığını içermektedir. BCL2, her PCR reaksiyonuna yüklenen toplam DNA miktarını normalize etmek için referans gen olarak kullanılmıştır. Her standart örnek için BCL2 amplifikasyon eğrileri, erkek DNA konsantrasyonundan bağımsız olarak birbirleriyle örtüşmektedir; bu durum, eşit miktarda DNA yüklendiğini göstermektedir.

Bununla birlikte, örnekteki erkek DNA miktarı arttıkça ZFY birincil amplifikasyon eğrileri sola kaymıştır; PIM TKO farelerden alınan hematopoetik kök hücreler, letal düzeyde ışınlanmış farelerin yeniden yapılandırılmasında kusurlar göstermiştir ve beklendiği üzere, PIM TKO hücreleri nakledilen alıcı fareler, vahşi tip hücreler nakledilen farelere kıyasla çok daha düşük bir erkek hücre yüzdesine sahipti. Yöntemimizi doğrulamak için, nakil sonrası farklı zaman noktalarında (altı haftada periferik kan ve 16 haftada kemik iliği örnekleri), vahşi tip ile PIM triple knockout veya TKO farelerden kemik iliği hücreleri alan nakledilmiş dişi farelerde erkek donör hücresi tutunmasını test ettik. Bu video izlendikten sonra analiz edildi.

Rekabetçi bir denizel kemik iliği transplantasyonu modelinde donör hücre tutunumunu niceliksel olarak belirlemek için PCR tabanlı yöntemin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.