Name: Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Öğrenin, rekabetçi kemik iliği transplantasyonunda erkek donör hücre aşılanmasını kantitatif gerçek-zamanlı PCR ile nasıl ölçersiniz. Bu hassas ve ekonomik yöntem, farklı fare soylarında geçerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onun Real Time PCR makine kullanımı için Dr Charles Greenberg ederim. Bu çalışma MUSC Hollings Kanser Merkezi Başlangıç ​​Fonu, Hollings Kanser Merkezi ACS IRG, ASCO Kanseri Vakfı Kariyer Geliştirme Ödülü Conquer, NIH 1K08HL 103780-01A1 ve NIH 3P30CA138313-01S3 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Sağlık veya diğer finansman ajanlar Ulusal Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Kemik İliği Hücre İzolasyonu <ol><li> Erkek donör FVB / NJ fareler ve servikal dislokasyon ile takip CO2 yöntemi kullanılarak dişi FVB / NJ fareler Euthanize. Dişi FVB / NJ kemik iliği hücreleri rekabetçi hücreler olarak kullanılır. </li><li> Farelerin femur ve tibiaes üzerinden incelemek ve% 5 ısı inaktive FBS ile 6 ml buz-soğuk RPMI1640 içeren 60 mm doku kültür kaplarına koyun, küçük bir makas ve forseps kullanın. Kas ve diğer dokuları kaldırmak için Kimwipe doku kullanın. Her bir çanak içinde kemik şaftın her iki ucuna kes. </li><li> 3 cc şırınga 23G iğne ile kemik ucunu, yemeğin içine% 5 ısı inaktive FBS ile RPMI1640 ile kemik iliği dışarı floş. Aynı iğne kullanılarak tekrarlanmalıdır özlemleri tarafından kemik iliği doku Ayrık. 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 400 x g&#39;de 5 dakika için hücreler aşağı Spin, süpernatanın kaldırmak (155 mM p oda sıcaklığında kırmızı kan hücresi lizis tamponu, 1 ml hücre tekrar süspansiyonotassium bikarbonat, 10 mM amonyum klorid, EDTA, pH = 7.4, 0.1 mM) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve sonra% 5 ısı ile aktifliği giderilmiş FBS içeren RPMI 1640 5-10 ml eklenir. </li><li> Bir hücre süzgecinden hücreleri geçirir. Yeni bir tüp aracılığıyla akış toplayın. 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca aşağı spin. Süpernatantı; hücre pelletini herhangi bir kırmızı renk içermemelidir. Kırmızı renk yokluğu, kırmızı kan hücrelerinin bir tam olarak çıkarılması gösterir. % 5 ısı ile aktifliği giderilmiş FBS RPMI1640 10 ml hücre pelet yeniden süspanse edin. Emin olmak için yavaşça girdap hücre süspansiyonu tamamen üniforma olduğunu. Bir kısım alın ve bir hemasitometre hücreleri saymak. Hesapla ne kadar kemik iliği transplantasyonu ve kısım yeterli hücre için gerekli hücrelerin hacim ve 05:02 oranında rakip dişi hücreleri erkek donör hücreleri karıştırın. 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca aşağı Spin, 2, 5 x 10 6 / ml, ve rakip hücrelerini verici hücrelerin nihai konsantrasyon ile PBS içinde, PBS ile tekrar süspansiyon yıkama x 10 6 </sup&gt; / ml. </li></ol> 2. Rekabetçi Kemik İliği Transplantasyonu <ol><li> Kemik iliği nakli öncesi 11Gy 4-6 saat tek bir dozda 137Cs gama ışınları radyatör ile saçmak dişi alıcı fareler (yaş 8-12 hafta). </li><li> Bir fare süzgeç olarak ışınlanmış dişi fareler yerleştirin. Her fare 5 × 10 5 donör hücreleri ve 2 × 10 5 yarışmacı kemik iliği hücreleri aldığı gibi toplam hacminin 0,1 ml kuyruk veni yoluyla karışık donör ve rakip hücreleri enjekte edilir. </li></ol> 3. Örnek Toplama Çift hafta kemik iliği transplantasyonu sonrası, anestezi koşulu altında retroorbital kanama kadın alıcı fare periferal kan örnekleri (~ 50 ul) toplamak. Örnekleri EDTA kaplı tüpler içerisine toplanır. BM örnekleri de açıklandığı önceki aynı prosedürleri (Adım 1) ile, genellikle en az 4 ay transplantasyon sonrası, deney sonunda tahsil edilebilir; genellikle% 20-401 tibiada BM hücrelerinin DNA yeterli miktarda yapmak için yeterli. Kan veya BM örneklerinde yaş eşleştirilmiş normal dişi ve erkek farelerde de standart eğrisi hazırlamak için toplanır. 4. Genomik DNA İzolasyonu <ol><li> Her kan örneği oda sıcaklığında RBC lizis tamponu 4 × hacmi (~ 200 ul) ekleyin. İyice karıştırın ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. PBS 1 ml ekleyin, daha sonra parçalanan RBC çoğunu kaldırmak için aşağı doğru döndürün. </li><li> Bir kan DNA ekstraksiyon kiti (QIAmp DNA Kan ekstraksiyon kiti) kullanılarak DNA izole edin. 37 Pre-sıcak elüsyon tampon (AE) ° C Elüsyonlanan DNA verimi artırmak için. Standart eğri için Erkek ve kadın DNA&#39;ları benzer izole edilmiştir. </li><li> (İsteğe bağlı) Genomik DNA, daha ileri saflaştırıldı ve 3 M sodyum asetat (pH = 5.5) varlığında, EtOH çökeltme yöntemi kullanılarak konsantre edilebilir. DNA pelletleri hemen sonra analiz için 40-50 ul damıtık su içinde tekrar süspanse edilir veya ileride kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanır. </li><li> DNA concentr ölçünNanodrop ND-1000 spektrumları fotometre ile ation. OD 260 / 1.8-2.0 arası 280 numuneler daha fazla analiz için kullanılır. </li><li> 50 ul toplam hacim içinde 4ng/μl için DNAase serbest H2O ile DNA seyreltin. </li></ol> 5. Standart Eğri Hazırlama 4 ng / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile DNA erkek ve dişi DNA seyreltilir, ve Table1 göre DNA karışım yapmak <table border="1"><tbody><tr><td> Kadın Arkaplan erkek DNA&#39;sının% </td><td> 4ng/μl erkek DNA&#39;sının hacmi (ul) </td><td> 4ng/μl kadın DNA hacmi (ul) </td><td> Toplam hacim (ul) </td></tr><tr><td> 0.2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12.5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87.5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Standart eğri için Tablo 1. Numune hazırlama. 8-12wks çağındaki Normal erkek ve dişi FVB / NJ fareler sakrifiye edildi. Kan ve BM hücrelerinin toplanmıştır. Erkek ve dişi hücreler hücrelerden DNA 4ng/μl &#39;lik bir konsantrasyonda izole edildi ve yeniden süspansiyon haline getirildi. Erkek ve dişi DNA&#39;lar DNA standardının örneği karışımları üretmek için çeşitli oranlarda karıştırılmıştır. 6. Real-time PCR <ol><li> Astar ve genomik DNA ile SYBR Green Supermix reaktifi karıştırılarak PCR reaksiyonu plakasını yukarı ayarlayın. Reaksiyon hacmi (20 ul), her reaksiyon bölgesindeki her bir primer ve kan hücresi genomik DNA (4ng/μl x5 ul = 20 ng) 5 ul 400 nM içerir. DNA samples ve standartları üç tekrarlı olarak kurulmuştur. Primerlerin dizileri Tablo 2 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Gene adı </td><td> Ileri </td><td> Ters </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> Mürin Bcl2 ve Zfy1 için Tablo 2. RT-PCR primer sekans. <ol start="2"><li> Aşağıdaki koşullara BioRad iQ5 PCR makinesi kullanılarak PCR reaksiyonu gerçekleştirin: 95 ° C&#39;de 3 dakika, 95 42 amplifikasyon döngüleri ° 10 sn için C, 58 ° 15 sn 25 sn ve 72 ° C&#39;de, bir erime eğrisi izledi adım. </li><li> Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition Optik Sistem tarafından Cycle threshold (Ct) değerleri elde edilir. Hesapla δCt (Ct Zfy1 &lt;/) Değeri&gt;-Ct Bcl2 sup ve Zfy1 ekspresyon seviyesi 2-δ Ct değeri olarak hesaplanır. </li><li> Bilinen kadın / erkek standart karışımlarından 2-δCt okuma kullanarak her reaksiyon serisi için standart eğrileri oluşturmak. Standart eğriler doğrusal regresyon uydurma ile karışım içinde% bilinen erkek DNA, kopyalardaki 2-δCt değer ortalama çizim tarafından oluşturulur. </li></ol>

<ol><li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%2C+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li>
<li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316(2010).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
<li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FVB%2FN%3A+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li>
<li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li>
<li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum%3A+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li>
<li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894(2008).</li>
<li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li>
<li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li>
<li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+%28Zfy-1+and+Zfy-2%29+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes & development. 4, 63-74 (1990).</li>
<li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+PIM+serine%2Fthreonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li>
</ol>

Biz hiçbir mali çıkarlarının ifşa rekabet var.

Mevcut çalışmanın amacı, izleyicilere rekabetçi bir kemirgen kemik iliği nakli modelinde donör hücre uyumunu ölçmek için PCR temelli bir yöntem sağlamaktır. Çeşitli çalışmalarda, transplantasyonu modelleri 9-10 donör hücrelerini saptamak için RT-PCR kullanılarak bildirilmiştir. Dr Schwarzenberger grubunun ilk y kromozomu özgü 8 yükseltmek için real-time PCR kullanarak bir kemirgen kemik iliği nakli modeli geliştirilmiştir. Bu yöntem, HSC etkinlik 11 Gli-1 fonksiyonu incelemek için kullan...

Mürin kemik iliği (Kİ) nakli model ilk 1960 1 geliştirilmiştir. Bu model yaygın donör hematopoetik kök hücre (HSC) bir ana alıcı fare biyoloji çalışma için kullanılır olmuştur. Mürin kemik iliği nakli modeli HSC fonksiyonları ve düzenlenmesi ile ilgili değerli bilgi ile bize sağladı ve HSC araştırma vazgeçilmezdir. C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 gibi C57BL/6J H2b-Balb / C H2d veya congenic nakli modeli gibi Allojenik kemik iliği nakli modelinin etkisi, HSC aktivitesi 2 geninin işlevini incelemek için birçok laboratuarlarda kullanılmaktadır graft-versus-host hastalığı (GVHH) 4 olarak HSC fonksiyonu 3 veya transplantasyon ilişkili hastalıklar üzerinde ilaç tedavisi. Bu tür MHC haplotip veya CD45.1 gibi hücre yüzey belirteçleri yaygın olarak alıcı kökenli hücrelerden ayırt verici türetilmiş hücreler için kullanılmaktadır. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sudonör hücre katkısı kolayca CD45.1 vs CD45.2 veya H2b vs ölçüm akım sitometri ile tespit edilebilir, çünkü p&gt;, Balb / C H2d ve B6.SJL CD45.1 kemik iliği nakli en yaygın olarak kullanılan fare suşları vardır H2d. Bununla birlikte, bu tür FVB / NJ 5 ve C3H gibi birçok diğer bakteriler aynı zamanda sık sık genetik mühendisliği transjenik fareler veya nakavt üretmek için kullanılır. Bu fareler, doğuştan bir hat için backcrossed ve bir karışık MHC / genetik arka plan içinde muhafaza edilebilir. Donör spesifik hücre yüzey belirteçleri mevcut olmayabilir bu durumda, donör hücre uyumunu ve HSC fonksiyonu belirlenmesi zor olabilir. Sex-uyumsuz kemik iliği nakli güney blot donör erkek hücrelerini saptamak için Y-kromozomu-spesifik DNA prob kullanarak ilk Dr Miwa grubu 6 tarafından geliştirilmiştir. Daha sonra, cinsiyet belirleyici bölge Y için bir gerçek-zamanlı PCR ma miktarının belirlenmesi için bir doğru ve büyük ölçüde belirli bir yöntem olduğu bulundumaternal kan sistemi 7 le fetal hücreler. Bu kavram, donör hücre uyumunu 8 belirlemek için bir kemirgen kemik iliği nakli modelinde, bir gerçek-zamanlı PCR tekniğinin geliştirilmesi için Dr Schwarzenberger grubu tarafından adapte edilmiştir. Biz daha FVB / NJ fare kemik iliği nakli modelinde donör hücre engraftman ölçümü için bu yöntemi değiştirilmiş. Bu yöntem, şu anda geniş olarak HSC biyoloji Pim1 kinaz rolünü incelemek için, grup halinde kullanılmaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Inaktive Isı </td></tr><tr><td> Amonyum klorid </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Bikarbonat </td><td> Balıkçı </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA Kan MINIKIT </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre süzgeç </td><td> Biyobilim BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 gerçek zamanlı PCR makinesi </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra fotometre </td><td> ND-1000 Nanodrop </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

rekabetçi bir mürin kemik İliği transplantasyon modelinde donör hücre aşı belirleme kantitatif gerçek-zamanlı pcr kullanarak

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Mürin kemik iliği nakli modelleri hematopoetik kök hücre (HSC) fonksiyonları ve belirleyici gen / HKH&#39;lerin düzenleyen molekülleri ölçen önemli bir araç sağlar. Bu transplant modeli sistemlerinde HKH&#39;lerin fonksiyonu sokmak ve sulandırmak öldürücü ışınlanmış alıcı fareler için bu hücrelerinin yeteneği belirlenir. Genellikle, verici katkı hücre / melezleşmesi akış sitometrisi kullanılarak özel bir verici-hücre yüzey proteinleri, antikorlar tarafından ölçülür. Ancak, bu yöntem ağır özgüllük ve tüm fare suşları için geçerli olmayabilir alıcının kaynaklı hücreler, gelen donör kaynaklı hücreler ayırt etmek için hücre yüzey belirteci yeteneğine bağlıdır. Piyasada genetiği değiştirilmiş fare suşlarının çeşitli geçmişlere dikkate alındığında, bu hücre yüzey / akım sitometri tabanlı yöntem özellikle congenic alıcı ce ayrı donör hücreleri iyi tanımlanmış yüzey belirteçleri yoksun fare suşları önemli sınırlamaları vardırlls. Burada, transplant alıcıları farelerde donör hücre engraftman / katkısını belirlemek için PCR-temelli teknik bildirdi. Biz lethally ışınlanmış congenic dişi farelere erkek donörün kemik iliği HKH&#39;lerin nakledilen. Periferal kan numuneleri farklı zaman noktalarında, nakil sonrası toplandı. Kemik iliği örnekleri deneyler sonunda elde edildi. Genomik DNA izole edildi ve Y kromozom özgü gen, Zfy1, kantitatif Gerçek zamanlı PCR ile amplifiye edildi. Dişi alıcı farelerde erkek donör kaynaklı hücrelerinin aşılanması erkek vs kadın DNA&#39;ların bilinen yüzdesi, standart bir eğriye karşı hesaplanır edildi. Bcl2 toplam DNA miktarının normale döndürmek için bir gen referans olarak kullanılmıştır. Bizim verilerimiz bu yaklaşım güvenilir donör hücre uyumunu belirler ve fare kemik iliği nakli modelleri hematopoetik hücre sulandırma ölçmede yararlı, henüz basit bir yöntem sağlar önerdi. Bizim yöntemi rutin en laboratuarlarda yapılabilir çünkü hiçbirgibi flow sitometri gibi pahalı ekipman gereklidir.

Şekil 1 ve 2 standart eğri örnekleri erkek DNA yüzdeleri karşı 2-δCt ortalama değerleri ile çizilen gösterdi. Şekil 1A, sırasıyla 78.5 ° C&#39;de ve 88.5 ° C&#39;de lokalize Bcl2 ve Zfy1 amplikonlar için spesifik erime sıcaklığı göstermiştir. Bcl2 her bir PCR reaksiyonu içinde yüklenmiş DNA&#39;nın toplam miktarı normalleştirmek için bir referans gen olarak kullanılır. Her standart numune için Bcl2 amplifikasyon eğrileri (Log görünümü) yüklü DNA (Şekil 1B) eş...

Donör hücre engraftman belirleme iyi tanımlanmış fenotipik belirteçlerin yoksun fare kemik iliği nakli modelleri bir meydan okuma sunuyor. Biz kadın transplant alıcı fareler erkek donör hücre uyumunu ölçmek için bir metodoloji tanımlamıştır. Bu yöntem, HSC fonksiyonların çalışması için tüm fare suşu olarak da kullanılabilir.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Bu prosedürün genel amacı, rekabetçi bir fare kemik iliği transplantasyon modelinde donör hücre tutunumunu nicelleştirmek için PCR tabanlı bir teknik uygulamaktır; bu işlem, öncelikle dişi alıcı farelere erkek donör hücreler kullanılarak kemik iliği transplantasyonu yapılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, alıcı farelerden farklı zaman noktalarında periferik kan toplanır ve genomik DNA izole edilir. Örnekler, bir standart eğri için hazırlanır.Son olarak, standart örnekler ve test örnekleri ile gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilir. Nihayetinde, bilinen bir erkek/dişi DNA yüzdesine sahip bir standart eğriye karşı hesaplama yapılarak, dişi alıcı farelerde erkek donör kaynaklı hücrelerin tutunmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, akış sitometrisi tabanlı yöntem gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha hassas ve daha ekonomik olması ve örneklerin uzun süre saklanabilmesidir.En önemlisi, tekniğimiz büyük oranda diziden bağımsızdır ve donör hücreyi alıcı hücrelerden ayırt etmek için iyi tanımlanmış hücre yüzey markörleri gibi farelerin herhangi bir genomik arka planı için kullanılabilir. Laminer akışlı kabin altında FVB nj, erkek donör ve dişi fareler ötanize edildikten sonra, femur ve tibia kemiklerini çıkarmak için küçük makas ve pens kullanarak bunları 6 ml buz gibi soğuk, %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren RPMI 1640 bulunan 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Kas ve diğer dokuları temizlemek için bir Kimwipe kullanın ve her bir kemik şaftının iki ucunu kap içerisinde kesin. Ardından, kemiklerin ucunu %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren RPMI 1640 ile doldurulmuş 3 cc'lik bir şırıngaya takılı 23 gauge iğneye bağlayın ve iliği yıkayarak dışarı çıkarın.Tekrarlanan aspirasyonlar ile kemik iliği dokusunu ayrıştırmak için aynı iğneyi kullanın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 400 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri bir mililitre oda sıcaklığındaki eritrosit lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin ve %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren 5 ila 10 mililitre RPMI 1640 eklemeden önce oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin; hücreleri bir hücre süzgecinden geçirin ve süzüntüyü yeni bir tüpe toplayın. Hücreleri 400 G'de beş dakika santrifüjleyip süpernatanı uzaklaştırdıktan sonra, peletin kırmızı renkten arınmış olması gerekir, bu da eritrositlerin tamamen uzaklaştırıldığını gösterir; hücreleri %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS içeren 10 mililitre RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin, nazikçe vorteksledikten sonra hemositometreye küçük bir alikot ekleyin ve hücreleri sayın.Kemik iliği transplantasyonu için rekabetçi dişi hücrelerle beşe iki oranında karıştırılması gereken hücre hacmini hesaplayın. Hücreleri enjeksiyona hazırlamak için son adım olarak, transplantasyondan dört ila altı saat önce donör ve rekabetçi hücreleri karıştırın, hücreleri pelletleyin, PBS ile yıkayın ve donör hücreler için mililitre başına 5 × 10⁶ ve rekabetçi hücreler için mililitre başına 2 × 10⁶ nihai konsantrasyonda PBS içinde yeniden süspande edin. Dişi alıcı fareleri, tek doz 11 gray sezyum 137 gama radyasyonu ile ışınlayın.Işınlanmış dişi fareleri bir fare sabitleyiciye yerleştirin ve kan örnekleri almak amacıyla, her bir fareye 5 × 10⁵ donör hücresi ve 2 × 10⁵ kompetitör kemik iliği hücresi gelecek şekilde, toplam 0,1 mL hacmindeki karışık donör ve kompetitör hücrelerini kuyruk veninden enjekte edin. Fareleri anestezi altına aldıktan sonra, retroorbital kanama yoluyla EDTA kaplı tüplere yaklaşık 50 µL kan toplayın. Ayrıca yaşa uygun erkek ve dişi farelerden de örnekler toplayın.Ardından, denek farelerden ve farelerden genomik DNA izole edin. Standart eğri için, her kan örneğine oda sıcaklığında yaklaşık 200 µL RBC lizis tamponu ekleyin ve beş dakika inkübe edin. 1 mL PBS ekleyin ve lizis olmuş RBC'lerin çoğunu uzaklaştırmak için santrifüjleyin.Ardından, elüsyon tamponunu 37 °C'ye önceden ısıtarak DNA'yı izole etmek için bir kan DNA ekstraksiyon kiti kullanın. Verimi artırmak için her örneğin DNA konsantrasyonunu ölçün. OD 260/280 oranı 1.8 ile 2.0 arasında olanlar ileri analizler için kullanılır.Bir standart eğrisi oluşturmak için, erkek ve dişi DNA'yı mikrolitre başına dört nanogram konsantrasyona seyreltin ve DNA karışımını bu kılavuzlara göre hazırlayın. Cyber green super mix reaktifini, burada gösterilen primerler ve genomik DNA ile karıştırarak PCR reaksiyon plağını hazırlayın. Her 20 mikrolitrelik reaksiyon, her bir primerden 400 nano molar ve üç tekrarlı olarak çalışılan beş mikrolitre kan hücresi genomik DNA içerir.Metin protokolünde yer alan koşullara göre PCR gerçekleştirin ve döngü eşiği veya CT değerlerini elde edin. Delta CT çarpı miktar CT üzeri ZY bir eksi CT üzeri BCL iki ile ZY bir ekspresyon seviyelerini veya iki üzeri eksi delta CT değerlerini hesaplayın; üç tekrarlı iki üzeri delta CT değerlerinin ortalamasını, doğrusal regresyon uyumu gösterilerek karışımdaki bilinen erkek DNA yüzdesiyle grafikleyerek standart eğriler oluşturun. Burada, iki üzeri delta CT ortalama değerlerinin erkek DNA yüzdelerine karşı çizilmiş standart eğri örnekleri yer almaktadır.Bu grafik, sırasıyla 78,5 ve 88,5 °C'de yer alan BCL2 ve ZFY1 amplikonları için spesifik bir erime sıcaklığını içermektedir. BCL2, her PCR reaksiyonuna yüklenen toplam DNA miktarını normalize etmek için referans gen olarak kullanılmıştır. Her standart örnek için BCL2 amplifikasyon eğrileri, erkek DNA konsantrasyonundan bağımsız olarak birbirleriyle örtüşmektedir; bu durum, eşit miktarda DNA yüklendiğini göstermektedir.Bununla birlikte, örnekteki erkek DNA miktarı arttıkça ZFY birincil amplifikasyon eğrileri sola kaymıştır; PIM TKO farelerden alınan hematopoetik kök hücreler, letal düzeyde ışınlanmış farelerin yeniden yapılandırılmasında kusurlar göstermiştir ve beklendiği üzere, PIM TKO hücreleri nakledilen alıcı fareler, vahşi tip hücreler nakledilen farelere kıyasla çok daha düşük bir erkek hücre yüzdesine sahipti. Yöntemimizi doğrulamak için, nakil sonrası farklı zaman noktalarında (altı haftada periferik kan ve 16 haftada kemik iliği örnekleri), vahşi tip ile PIM triple knockout veya TKO farelerden kemik iliği hücreleri alan nakledilmiş dişi farelerde erkek donör hücresi tutunmasını test ettik. Bu video izlendikten sonra analiz edildi.Rekabetçi bir denizel kemik iliği transplantasyonu modelinde donör hücre tutunumunu niceliksel olarak belirlemek için PCR tabanlı yöntemin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

using-quantitative-real-time-pcr-to-determine-donor-cell-engraftment

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

Bu video, allojenik hematopoietik kök hücreler ve GvHD'yi indükleyen splenik alloreaktif T lenfositleri kullanılarak letoral ışınlanmış bir alıcı farede bağırsak greftine karşı konak hastalığının (GvHD) indüksiyonunu göstermektedir. Bu protokol, hastalığın mekanizmasını anlamak ve yenilikçi terapötik seçenekler geliştirmek için ciddi bir akut intestinal GvHD modeli oluşturmaya yardımcı olur.

Allojenik Kemik İliği ve Splenik Hücre Nakli ile Fare Modellerinde Graft Versus Host Hastalığının İndüksiyonu

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz.  Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Bu protokol, hücre sıralama yoluyla kök hücrelerin önceden saflaştırılması olmadan hematopoietik kök/progenitör hücre fonksiyonunu incelemek için rekabetçi fare kemik iliği nakli deneyleri kurmak için adım adım yönergeler sağlar.

Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin

Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Öğrenin, rekabetçi kemik iliği transplantasyonunda erkek donör hücre aşılanmasını kantitatif gerçek-zamanlı PCR ile nasıl ölçersiniz. Bu hassas ve ekonomik yöntem, farklı fare soylarında geçerlidir.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Daha fazla video keşfet